Оптимизированные с помощью компьютера антигены с широким спектром реактивности для вирусов гриппа h3n2

Оптимизированные с помощью компьютера антигены с широким спектром реактивности для вирусов гриппа h3n2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/596014, поданной 7 февраля 2012 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее раскрытие относится к оптимизированным белкам-гемагглютининам вируса гриппа, которые вызывают иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H3N2, H2N2 или В, и к их применению в качестве вакцин.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус гриппа является представителем семейства Orthomyxoviridae. Существует три подтипа вирусов гриппа, обозначаемые как вирус гриппа А, вирус гриппа В и вирус гриппа С. Вирион вируса гриппа содержит геном, состоящий из сегментированной отрицательно-полярной нити РНК, который кодирует следующие белки: гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксный белок (M1), белок протонного канала (М2), нуклеопротеин (NP), основный белок полимеразного комплекса 1 (РВ1), основный белок полимеразного комплекса 2 (РВ2), кислый белок полимеразного комплекса (РА) и неструктурный белок 2 (NS2). Белки НА, NA, M1 и М2 являются белками, ассоциированными с мембраной, тогда как NP, РВ1, РВ2, РА и NS2 являются белками, ассоциированными с нуклеокапсидом. Белок M1 является наиболее распространенным белком в частицах вируса гриппа. Белки НА и NA являются гликопротеинами оболочки, отвечающими за прикрепление вируса и проникновение вирусных частиц в клетку, а также являются источниками основных иммунодоминантных эпитопов для нейтрализации вируса и для защитного иммунитета. Как белок HA, так и белок NA считаются наиболее важными компонентами профилактических вакцин против гриппа.

Ежегодно сезонные вспышки гриппа являются причиной более 300000 случаев госпитализации и 36000 смертельных случаев только в США (Simonsen et al., Lancet Infect Dis 7:658-66, 2007). Появление нового вируса гриппа H1N1 в 2009 г. показало, насколько быстро пандемия нового вида гриппа может распространиться по всему миру. Штаммы вируса гриппа H3N2 могут инфицировать как птиц, так и млекопитающих, и вирус гриппа H3N2 становится все более распространенным при сезонном гриппе. H2N2 является другим подтипом вируса гриппа, который ранее вызывал вспышки пандемии среди людей. Штамм H2N2 вызвал пандемию в 1957 году в Азии. Вирус гриппа B является другим типом вируса гриппа, который инфицирует людей, и представляет собой существенную причину сезонного гриппа, но не известно, чтобы он вызывал вспышки пандемии, поскольку у него ограниченный круг хозяев (люди и тюленевые).

В настоящее время в США лицензированы два типа подходов к вакцинации против гриппа – применение инактивированной сплит-вакцины и применение вакцины на основе живого ослабленного вируса. Инактивированные вакцины могут эффективно индуцировать гуморальный иммунный ответ, но, как правило, вызывают только незначительный клеточный иммунный ответ. Вакцины на основе живого вируса не могут вводиться пациентам с ослабленным иммунитетом или беременным пациентам в связи с имеющимся у них повышенным риском развития инфекции. Таким образом, существует потребность в вакцине против вируса гриппа, обладающей широким спектром защитной активности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью компьютера полипептидов HA вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, имеющие оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B. В некоторых вариантах осуществления полипептид HA содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 99,4% идентичную SEQ ID NO: 2, по меньшей мере на 99,7% идентичную SEQ ID NO: 4, по меньшей мере на 99,6% идентичную SEQ ID NO: 5, по меньшей мере на 98,8% идентичную SEQ ID NO: 6, по меньшей мере на 99,7% идентичную SEQ ID NO: 8, по меньшей мере на 98,4% идентичную SEQ ID NO: 9, по меньшей мере на 97,8% идентичную SEQ ID NO: 10 или по меньшей мере на 98,9% идентичную SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида содержит не более 2 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1; не более 3 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 2; не более 1 аминокислотной замены по сравнению с SEQ ID NO: 4; не более 2 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 5; не более 7 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 6; не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 8; не более 9 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 9; не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 10; или не более 6 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления в полипептиде НА вируса гриппа отсутствует N-концевой метиониновый остаток.

Молекулы выделенных нуклеиновых кислот и векторы, кодирующие рекомбинантные полипептиды НА, также обеспечиваются в настоящем раскрытии. Дополнительно обеспечиваются выделенные клетки, содержащие такие векторы.

Также представлены вирусоподобные частицы (VLP), сходные с частицами вируса гриппа, и слитые белки, содержащие оптимизированные полипептиды НА, раскрытые в данном документе.

Дополнительно представлены композиции, которые включают оптимизированные полипептиды НА вируса гриппа, слитые белки или VLP, раскрытые в данном документе, в фармацевтически приемлемом носителе. В настоящем раскрытии также предусмотрены способы вызова иммунного ответа против вируса гриппа у субъекта путем введения раскрытых композиций, слитых белков или VLP.

Также представлены способы иммунизации субъекта против вируса гриппа путем введения субъекту композиции, содержащей VLP, которая содержит оптимизированный полипептид НА.

Вышеуказанные и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания, которое следует далее ссылаясь на прилагаемые графические материалы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA НА вируса гриппа H2N2 в соответствии со способом 2, как описано в примере 1.

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H2N2 в соответствии со способом 3, как описано в примере 1.

Фиг. 3 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа B в соответствии со способом 2, как описано в примере 2.

Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа B в соответствии со способом 3, как описано в примере 2.

Фиг. 5 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 1, как описано в примере 3.

Фиг. 6 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 2, как описано в примере 3.

Фиг. 7 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 3, как описано в примере 3.

Фиг. 8 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 4, как описано в примере 3.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с помощью стандартных буквенных обозначений для нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода для аминокислот, как определено в §1.822 главы 37 Свода федеральных нормативных актов США. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но подразумевается, что комплементарная цепь включена в документ посредством любой ссылки на указанную цепь. Перечень последовательностей представлен в виде текстового файла с кодировкой ASCII, созданного 30 января 2013 года, 53,7 KB, который включен в данный документ посредством ссылки. В прилагаемом перечне последовательностей:

SEQ ID NO: 1-4 представляют собой аминокислотные последовательности COBRA для HA вируса гриппа H2N2.

SEQ ID NO: 5-7 представляют собой аминокислотные последовательности COBRA для HA вируса гриппа B.

SEQ ID NO: 8-11 представляют собой аминокислотные последовательности COBRA для HA вируса гриппа H3N2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Сокращения

COBRA: оптимизированный с помощью компьютера антиген с широким спектром реактивности;

HA: гемагглютинин;

HAI: подавление гемагглютинина;

HRP: пероксидаза хрена;

M1: матриксный белок 1;

NA: нейраминидаза;

PFU: бляшкообразующая единица;

VLP: вирусоподобная частица.

II. Выражения и способы

Если не указано иное, технические выражения используются согласно традиционному способу употребления. Определения общепринятых выражений в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, Genes V, опубликованном Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованном Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованном VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Для того чтобы облегчить обзор различных вариантов осуществления настоящего раскрытия, представлены следующие объяснения конкретных выражений.

Адъювант. Вещество или среда, которые неспецифически усиливают иммунный ответ в отношении антигена. Адъюванты могут включать суспензию минеральных веществ (квасцы, гидроксид алюминия или фосфат алюминия), на которой адсорбируется антиген; или эмульсию типа “вода-в-масле”, в которой раствор антигена эмульгирован в минеральном масле (например, неполном адъюванте Фрейнда), иногда с включением убитых микобактерий (полный адъювант Фрейнда) для дополнительного усиления антигенных свойств. В качестве адъювантов можно также применять иммуностимулирующие олигонуклеотиды (как, например, содержащие мотив CpG) (например, см. патенты США №№6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; 6339068; 6406705 и 6429199). Адъюванты также включают биологические молекулы, такие как ко-стимулирующие молекулы. Иллюстративные биологические адъюванты включают IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L и 41 BBL.

Вводить. Как применяется в данном документе, введение композиции субъекту означает предоставление, нанесение или приведение композиции в контакт с субъектом. Введение можно осуществлять любым из ряда путей, как, например, местным, пероральным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, подоболочечным и внутрикожным.

Антитело. Молекула иммуноглобулина, вырабатываемая B-лимфоцитами с определенной аминокислотной последовательностью. Выработка антител у людей или других животных происходит под действием специфического антигена (иммуногена). Антитела характеризуются специфической реакцией с антигеном, происходящей некоторым очевидным образом, при этом каждое из выражений “антитело” и “антиген” определен относительно другого. Выражение “вызывать ответ с формированием антител” относится к способности антигена или другой молекулы индуцировать выработку антител.

Антиген. Соединение, композиция или вещество, которое может стимулировать выработку антител или Т-клеточный ответ у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые ним. Антиген реагирует с продуктами специфических гуморальных или клеточных иммунных реакций, в том числе с таковыми, индуцируемыми гетерологичными иммуногенами. В некоторых вариантах осуществления раскрытых композиций и способов антиген представляет собой белок HA вируса гриппа.

Подвергнутый оптимизации кодонов. Выражение “нуклеиновая кислота, подвергнутая оптимизации кодонов” относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая была изменена таким образом, что кодоны являются оптимальными для экспрессии в конкретной системе (такой как конкретный вид или группа видов). Например, последовательность нуклеиновой кислоты может быть оптимизирована для экспрессии в клетках млекопитающих. Оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка.

Слитый белок. Белок, полученный путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, сконструированной из последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере часть двух различных (гетерологичных) белков. Для создания слитого белка последовательности нуклеиновых кислот должны находиться в одной той же рамке считывания и не содержать внутренних стоп-кодонов. Например, слитый белок может включать НА вируса гриппа, слитый с гетерологичным белком.

Гемагглютинин (НА). Поверхностный гликопротеин вируса гриппа. НА опосредует связывание вирусной частицы с клетками-хозяевами и последующее проникновение вируса в клетку-хозяина. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности множества белков НА вирусов гриппа известны в данном уровне техники и публично доступны, как, например, через NCBI базу данных ресурсов по вирусам гриппа (Bao et al., J Virol 82:596-601, 2008). НА (наряду с NA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Иммунный ответ. Ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Т-клетка, макрофаг или полиморфноядерный лейкоцит, на стимул, такой как антиген или вакцина. Иммунный ответ может затрагивать любую клетку тела, участвующую в защитной реакции организма-хозяина, включая, например, эпителиальную клетку, которая секретирует интерферон или цитокин. Иммунный ответ включает, но без ограничений, врожденный иммунный ответ или воспаление. Как применяется в данном документе, защитный иммунный ответ относится к иммунному ответу, который защищает субъект от инфекции (предупреждает инфекцию или предупреждает развитие заболевания, ассоциированного с инфекцией). Способы оценивания иммунных ответов хорошо известны в данном уровне техники и включают, например, оценивание пролиферации и/или активности лимфоцитов (таких как В- или Т-клетки), секреции цитокинов или хемокинов, воспаления, выработки антител и т.п.

Иммуноген. Соединение, композиция или вещество, которое в соответствующих условиях способно стимулировать иммунный ответ, такой как выработка антител или Т-клеточный ответ, у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые ним. Как применяется в данном документе, “иммуногенная композиция” представляет собой композицию, которая содержит иммуноген (например, полипептид HA).

Подвергать иммунизации. Предоставлять субъекту защиту от инфекционного заболевания, например, путем вакцинации.

Вирус гриппа. Вирус с сегментированной отрицательно-полярной нитью РНК, который принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа А инфицируют большое число видов птиц и млекопитающих, в том числе людей, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и кур. У животных большинство вирусов гриппа A вызывают локализованные инфекции дыхательных путей и кишечника в легкой форме. Тем не менее, высокопатогенные штаммы вируса гриппа A, такие как H5N1, вызывают системные инфекции домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. В 2009 г. вирус гриппа H1N1 был наиболее частой причиной заболевания людей гриппом. Новый штамм H1N1, происходящий от свиней, появился в 2009 г. и был объявлен пандемическим Всемирной организацией здравоохранения. Этот штамм был назван “вирусом свиного гриппа”. Вирусы гриппа A H1N1 также были причиной пандемии испанского гриппа в 1918 г., вспышки заболевания в Форт-Дикс в 1976 г. и эпидемии гриппа в России в 1977-1978 гг. Вирусы гриппа H3N2, H2N2 и B также инфицируют людей и являются этиологическим фактором сезонного гриппа.

Выделенный. “Выделенный” биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота, белок или вирус) был практически отделен или очищен от других биологических компонентов (таких как клеточный детрит или другие белки или нуклеиновые кислоты). Биологические компоненты, которые были “выделены”, включают компоненты, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Это выражение также охватывает рекомбинантные нуклеиновые кислоты, белки или вирусы (или VLP), а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты или пептиды.

Линкер. Одна или несколько аминокислот, которые служат в качестве спейсера между двумя полипептидами слитого белка.

Матриксный белок (M1). Структурный белок вируса гриппа, обнаруженный в оболочке вируса. Полагают, что M1 участвует в сборке и отпочковании.

Нейраминидаза (NA). Мембранный гликопротеин вируса гриппа. NA участвует в разрушении клеточного рецептора к вирусному НА за счет отщепления концевых остатков сиаловой кислоты от углеводных фрагментов, расположенных на поверхности инфицированных клеток. NA также отщепляет остатки сиаловой кислоты от вирусных белков, предупреждая агрегацию вирусов. NA (наряду с НА) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Функционально связанный. Первая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связаннойй со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в том случае, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если этот промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и, при необходимости, соединения двух областей, кодирующих белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Оптимизированный белок НА вируса гриппа. Как применяется в данном документе, "оптимизированный белок НА вируса гриппа" относится к консенсусной последовательности белка НА, полученной с помощью выравниваний последовательностей изолятов вирусов гриппа H2N2, H3N2 или В (как описано в примерах 1-3 ниже). Нуклеотидные последовательности, кодирующие оптимизированные белки HA, могут быть дополнительно оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих посредством оптимизации кодонов и оптимизации РНК (так, чтобы повысить стабильность РНК). Оптимизированные белки HA вируса гриппа, раскрытые в данном документе (и приведенные в данном документе как SEQ ID NO: 1-11), также называют последовательностями “COBRA” (оптимизированного с помощью компьютера антигена с широким спектром реактивности). Оптимизированные полипептиды HA предназначены для того, чтобы вызывать у субъекта иммунный ответ с широким спектром реактивности. В контексте настоящего раскрытия “с широким спектром реактивности” означает, что белковая последовательность вызывает такой иммунный ответ у субъекта, который является достаточным для ингибирования, нейтрализации или предупреждения инфицирования широким спектром вирусов гриппа (таких как большинство или все вирусы гриппа в рамках определенного подтипа). В некоторых случаях оптимизированный белок HA вируса гриппа способен вызывать иммунный ответ, такой как защитный иммунный ответ, в отношении большинства или всех изолятов вируса гриппа H3N2, большинства или всех изолятов вируса гриппа H2N2 или большинства или всех изолятов вируса гриппа B.

Вспышка. Как применяется в данном документе, “вспышка” вируса гриппа относится к накоплению изолятов вируса внутри отдельной страны в определенный год.

Фармацевтически приемлемые среды. Фармацевтически приемлемые носители (среды), применимые в настоящем раскрытии, являются традиционными. В Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) описаны композиции и составы, пригодные для фармацевтической доставки одной или нескольких терапевтических композиций, таких как одна или несколько вакцин против гриппа, и дополнительные фармацевтические средства.

В целом, природа носителя будет зависеть от конкретного используемого способа введения. Например, составы для парентерального применения обычно содержат инъекционные жидкости, которые в качестве среды включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или т.п. В случае твердых композиций (например, в форме порошка, драже, таблеток или капсул) обычные нетоксичные твердые носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической степени чистоты. Вводимые фармацевтические композиции в дополнение к биологически нейтральным носителям могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты и буферные средства, поддерживающие pH, и т.п., например, ацетат натрия или сорбитанмонолаурат.

Полипептид. Полимер, мономерами в котором являются аминокислотные остатки, соединенные друг с другом посредством амидных связей. Если аминокислоты представляют собой альфа-аминокислоты, то можно применять либо L-оптический изомер, либо D-оптический изомер. Выражения “полипептид” или “белок”, применяемые в данном документе, предназначены охватывать любую аминокислотную последовательность и включать модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. Выражение “полипептид” конкретно предназначено охватывать белки, встречающиеся в природе, а также белки, полученные рекомбинантным или синтетическим путем. Выражение “остаток” или “аминокислотный остаток” включает ссылку на аминокислоту, которая встроена в белок, полипептид или пептид.

Консервативные аминокислотные замены являются заменами, которые в случае их осуществления нарушают свойства исходного белка в наименьшей степени, то есть структура и, в особенности, функция белка сохраняются и существенно не изменяются вследствие таких замен. Примеры консервативных замен показаны ниже.

При консервативных заменах, как правило, сохраняется (a) структура полипептидного остова в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряд или гидрофобность молекулы в целевом сайте или (c) объем боковой цепи.

Замены, которые в общем, как ожидается, приведут к наибольшим изменениям свойств белка, будут неконсервативными, например, изменениями, при которых (а) гидрофильный остаток, например, серил или треонил, заменяют на гидрофобный остаток (гидрофобным остатком), например, лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; (b) цистеин или пролин заменяют на любой другой остаток (любым другим остатком), (с) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил или гистидил, заменяют на электроотрицательный остаток (электроотрицательным остатком), например, глутамил или аспартил; или (d) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например, фенилаланин, заменяют на остаток (остатком), который не имеет боковой цепи, например, глицин.

Предупреждение, лечение или уменьшение интенсивности заболевания. “Предупреждением” заболевания называют ингибирование полного развития заболевания. “Лечением” называют терапевтическое вмешательство, которое уменьшает интенсивность признака или симптома заболевания или патологического состояния после начала его развития. “Уменьшением интенсивности” называют снижение числа или уменьшение степени тяжести признаков или симптомов заболевания.

Промотор. Промотор представляет собой совокупность контрольных последовательностей нуклеиновых кислот, управляющих транскрипцией нуклеиновой кислоты. Промотор включают необходимые последовательности нуклеиновых кислот, располагающиеся возле сайта инициации транскрипции. Промотор также необязательно содержит дистальные энхансерные или репрессорные элементы. “Конститутивный промотор” представляет собой промотор, который является постоянно активным и не подвергается регуляции внешними сигналами или молекулами. В отличие от этого, активность “индуцибельного промотора” регулируется внешними сигналами или молекулами (например, фактором транскрипции). В некоторых вариантах осуществления, представленных в данном документе, промотор представляет собой промотор CMV.

Очищенный. Выражение “очищенный” не подразумевает абсолютную чистоту; его, скорее, предполагается использовать как относительное выражение. Таким образом, например, очищенные пептид, белок, вирус, VLP или другое активное соединение представляют собой таковые, которые отделены полностью или частично от белков и других примесей, которые в естественных условиях ассоциированы с ними. В некоторых вариантах осуществления выражение “практически очищенный” относится к пептиду, белку, вирусу, VLP или другому активному соединению, выделенным из клетки, среды для культивирования клеток или другого неочищенного препарата и подвергнутым фракционированию для удаления различных компонентов из исходного препарата, таких как белки, клеточный детрит и другие компоненты.

Рекомбинантный. Рекомбинантные нуклеиновая кислота, белок, вирус или VLP представляют собой таковые, имеющие последовательность, которая не встречается в природе, или имеющие последовательность, полученную путем искусственного объединения двух сегментов последовательности, которые в остальных случаях отделены друг от друга. Это искусственное объединение часто выполняют путем химического синтеза или путем искусственного воздействия на выделенные сегменты нуклеиновых кислот, например, при помощи методик генной инженерии.

Идентичность последовательностей. Подобие между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот выражается в аспекте подобия между последовательностями, которое иначе называют идентичностью последовательностей. Идентичность последовательностей часто выражается в аспекте процентной идентичности (или подобия, или гомологии); чем выше процентное значение, тем более высоким является подобие двух последовательностей. Гомологи или варианты данного гена или белка будут обладать относительно высокой степенью идентичности последовательностей при выравнивании с применением стандартных способов.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данном уровне техники. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; и Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119-129, 1994.

Cредство поиска основного локального выравнивания (BLAST^TM) NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) доступно из нескольких источников, включая Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, Бетесда, Мэриленд) и Интернет, для применения вместе с программами анализа последовательностей blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx.

Субъект. Живые многоклеточные позвоночные организмы, категория, которая включает как человека, так и млекопитающих, отличных от человека, таких как приматы, отличные от человека.

Терапевтически эффективное количество. Количество определенного средства, достаточное для достижения необходимого эффекта у субъекта, подвергающегося лечению с помощью этого средства. Например, это может быть количество вакцины против вируса гриппа, пригодное для вызова иммунного ответа у субъекта и/или предупреждения инфекции или заболевания, вызываемых вирусом гриппа. Идеально, в контексте настоящего раскрытия, терапевтически эффективным количеством вакцины против гриппа является количество, достаточное для повышения резистентности к инфекции, вызываемой вирусом гриппа, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, которое при этом не вызывает значительного цитотоксического эффекта у субъекта. Эффективное количество вакцины против гриппа, пригодное для повышения резистентности к инфекции, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, будет зависеть, например, от субъекта, подвергающегося лечению, способа введения терапевтической композиции и других факторов.

Трансформированный. Трансформированная клетка представляет собой клетку, в которую ввели молекулу нуклеиновой кислоты при помощи методик молекулярной биологии. Как применяется в данном документе, выражение “трансформация” охватывает все способы, при помощи которых молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в такую клетку, в том числе трансфекцию с применением вирусных векторов, трансформацию с применением плазмидных векторов и введение “голой” ДНК путем электропорации, липофекции и ускорения частиц при помощи генной пушки.

Вакцина. Препарат на основе иммуногенного материала, способного стимулировать иммунный ответ, вводимый для предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения заболевания, такого как инфекционное заболевание. Иммуногенный материал может включать, например, ослабленные или убитые микроорганизмы (например, ослабленные вирусы) или антигенные белки (в том числе VLP), пептиды или ДНК, полученные из них. Вакцины могут вызвать как профилактический (предупредительный), так и терапевтический ответ. Способы введения варьируют в зависимости от вакцины, но могут включать прививку, проглатывание, ингаляцию или другие формы введения. Прививки могут производиться с помощью ряда различных путей, включая парентеральный, например, внутривенный, подкожный или внутримышечный. Вакцины можно вводить с адъювантом, чтобы усилить иммунный ответ.

Вектор. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая позволяет производить вставку чужеродной нуклеиновой кислоты без нарушения способности вектора к репликации и/или интеграции в клетке-хозяине. Вектор может включать последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, например, точку начала репликации. Инсерционный вектор способен вставляться в нуклеиновую кислоту хозяина. Вектор также может включать один или несколько селектируемых маркерных генов и других генетических элементов. Вектор экспрессии представляет собой вектор, который содержит необходимые регуляторные последовательности для осуществления транскрипции и трансляции вставленного гена или генов. В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия вектор кодирует белок HA, NA или М1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США № 2002/0106798; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

Вирусоподобная частица (VLP). Вирусные частицы, образованные одним или несколькими структурными белками вируса, но не имеющие вирусного генома. Поскольку VLP не имеют вирусного генома, они являются неинфекционными. Кроме того, VLP часто могут быть получены путем гетерологичной экспрессии и могут быть легко очищены. Большинство VLP содержат по меньшей мере сердцевинный вирусный белок, который управляет отпочкованием и высвобождением частиц из клетки-хозяина. Одним из примеров такого сердцевинного белка является M1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления, описываемых в данном документе, VLP, сходная с частицей вируса гриппа, содержит белки HA, NA и/или М1. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут быть получены путем трансфекции клеток-хозяев с помощью плазмид, кодирующих белки HA и NA и необязательно белок М1. После инкубирования трансфицированных клеток в течение соответствующего периода времени, необходимого для обеспечения экспрессии белка (как, например, в течение приблизительно 72 часов), VLP можно выделять из надосадочной жидкости культуры клеток. В примере 5 приводится иллюстративный протокол очистки VLP, сходных с частицами вируса гриппа, от надосадочной жидкости культуры клеток. В этом примере VLP выделяют путем низкоскоростного центрифугирования (для удаления клеточного детрита), вакуум-фильтрации и ультрацентрифугирования в 20% глицерине. Другие способы получения VLP, сходных с частицами вируса гриппа, известны в данном уровне техники (см., например, публикации заявки на патент США №№ 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769 и 2010/0239610).

Если не истолковывается иначе, все технические и научные выражения, применяемые в данном документе, имеют то же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Выражения в единственном числе включают в себя определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. “Содержащий A или B” означает включающий А или В или А и B. Также следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описываемым в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или тестировании настоящего раскрытия, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта в качестве контрольного документа будет выступать настоящее описание, включая пояснения выражений. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими.

III. Обзор некоторых вариантов осуществления

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью компьютера полипептидов HA вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B. Способы, применяемые для получения оптимизированных консенсусных последовательностей HA, описаны в примерах 1-3 и показаны на фиг. 1-7. Аминокислотные последовательности 10 определенных полипептидов HA приведены в данном документе как SEQ ID NO: 1-11.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, имеющие оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид HA вируса гриппа содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную остаткам 2-562 из SEQ ID NO: 1; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,4% идентичную остаткам 2-562 из SEQ ID NO: 2; аминокислотную последовательность, содержащую остатки 2-562 из SEQ ID NO: 3; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,7% идентичную остаткам 2-562 из SEQ ID NO: 4; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную остаткам 2-584 из SEQ ID NO: 5; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,8%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-585 из SEQ ID NO: 6; аминокислотную последовательность, содержащую остатки 2-585 из SEQ ID NO: 7; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 97,7%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 98,5%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-566 из SEQ ID NO: 8; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,4%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-566 из SEQ ID NO: 9; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 97,8%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 98,5%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-566 из SEQ ID NO: 10; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,9%, по меньшей мере на 99% или по меньше