Кирнк и их использование в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных заболеваний

Кирнк и их использование в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных заболеваний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Глаукома определяется как процесс разрушения глазной ткани, вызванный постоянным повышением внутриглазного давления (ВГД) выше его нормальных физиологических пределов¹. При открытоугольной глаукоме повышение ВГД вызывает прогрессирующую оптическую нейропатию из-за потери ганглиозных клеток сетчатки, что в конечном итоге приводит к слепоте². При закрытоугольной глаукоме внезапное резкое повышение ВГД часто вызывает слепоту. Глаукома является второй ведущей причиной слепоты во всем мире³, и заболеваемость возрастает во всем мире⁴. Слепота при глаукоме вызвана дегенеративным процессом в сетчатке и зрительном нерве, но функционально ассоциирована с нарушениями баланса между секрецией и оттоком водянистой влаги (ВВ). ВВ секретируется клетками цилиарного тела, а отток может обеспечиваться по одному из двух путей: по трабекулярной сети и по увеосклеральному пути⁵.

Современные методы лечения глаукомы не способны восстановить потерю зрения, вызванную глаукомой, а направлены на снижение ВГД⁶. Было показано, что контроль ВДГ защищает от повреждения зрительного нерва при глаукоме^5,7. Для снижения ВГД в настоящее время используются пять классов лекарственных соединений: α-адренергические агонисты, β-адреноблокаторы, холинергические агонисты, простагландины и ингибиторы углерод-ангидразы. Если никакие из этих лекарственных соединений не дают эффекта снижения ВДГ, то для увеличения оттока ВВ может использоваться лазерная терапия трабекулярной сети. Последним терапевтическим средством является хирургическая процедура для создания нового маршрута оттока ВВ⁸.

Современные методы лечения повышенного ВГД, ассоциированного с глаукомой, имеют относительно немного глазных побочных эффектов, но могут иметь системные побочные эффекты, если соединение попадает в кровоток^9,10,11. Методы лечения, лучше переносимые системно, такие как простагландины, имеют много проблем с местной переносимостью¹². Этот факт в совокупности с требуемой частотой инстилляций в целях поддержания адекватного уровня ВГД делает соблюдение режима лечения проблемой для пациентов¹³. Несоблюдение метода лечения может не только способствовать развитию заболевания, но также может дать «эффект перезагрузки», вызывающий внезапное повышение ВГД, что может быть очень разрушительным для зрительного нерва.

Простагландины и бета-блокаторы являются предпочтительными агентами для снижения ВГД^12,14. Простагландины снижают ВГД очень эффективно и являются безопасными системно, но обладают несколькими глазными побочными эффектами¹⁵, а именно, вызывают потемнение цвета радужки, рост ресниц, периокулярную пигментацию и гиперемию. Менее частыми глазными побочными эффектами этого класса лекарственных соединений являются внутриглазное воспаление, цистоидный макулярный отек и реактивация герпес-вирусных инфекций роговицы глаза¹⁶. Аналоги простагландинов противопоказаны во время беременности из-за потенциального риска преждевременных родов.

Местное применение бета-блокаторов снижает ВГД за счет уменьшения продукции ВВ, а не за счет увеличения ее оттока. Нанесенные местно бета-блокаторы проникают в системный кровоток через эпителий конъюнктивы, слезные каналы, слизистую оболочку носа и желудочно-кишечный тракт, вызывая системные побочные реакции^17-19. В глазе адренергические рецепторы расположены на кровеносных сосудах, которые орошают цилиарное тело, и трабекулярной сети, где их основным эффектом является вазоконстрикция, хотя также было описано их участие в секреции водянистой влаги. Предшествующие исследования на глазах кроликов показали высокую плотность β-адренорецепторов в эпителии конъюнктивы, роговицы и отростков цилиарного тела, β-адренорецепторы также присутствуют в эндотелии роговицы, эпителии хрусталика, хориоидее и экстраокулярной мышце. Большинство β-адренергических рецепторов, обнаруженных в глазу, относятся к β2-типу^20-23.

РНК-интерференция (РНКи) представляет собой технологию, основанную на принципе, что малые, специфичные по последовательности, химически синтезированные двухцепочечные фрагменты РНК могут опосредовать деградацию конкретных матричных РНК (мРНК) в цитоплазме и, следовательно, селективно ингибировать синтез конкретных белков. Эта технология стала очень мощным инструментом для разработки новых соединений, направленных на блокирование и/или снижение аномальной деятельности заданных белков^24,25. Соединения на основе РНК-интерференции может быть рационально подобраны для блокирования экспрессии любого гена-мишени, включая гены, для которых невозможно найти традиционные низкомолекулярные ингибиторы²⁶. Примеры успешного использования РНК-интерференции в терапии включают ингибирование репликации ВИЧ-1 в клетках человека²⁷ и нокдаун тау-белка и белка-предшественника аполипопротеина в животных моделях болезни Альцгеймера²⁸. Несмотря на то, что РНКи была открыта чуть более десяти лет назад, некоторые из этих соединений находятся уже на поздних стадиях клинических испытаний, а именно, RTP801 (Quark Pharmaceuticals, Fremont, PA, фаза II) для лечения возрастной макулярной дегенерации и ALN-RSV01 (Alnylam Pharmaceuticals, Cambridge, MA, фаза II) для лечения респираторно-синцитиального вируса^29,30. РНК-интерференция является очень привлекательным подходом для лечения хронических заболеваний, так как после прекращения лечения подавляемый белок должен повторно синтезироваться для восстановления своей биологической активности. Поэтому, эффекты соединений на основе РНК-интерференции в целом являются более длительными, чем у обычных методов лечения^24,31.

Глаз является относительно изолированным тканевым компартментом; эта особенность обеспечивает несколько преимуществ для использования терапии на основе киРНК. Местная доставка соединений в глаза ограничивает системное воздействие и уменьшает количество необходимого соединения. Это позволяет локальное подавление экспрессии гена и снижение вероятности широкого распространения подавления экспрессии вне глаза. Кроме того, иммунная система имеет ограниченный доступ к глазу; поэтому менее вероятно возникновение иммунного ответа на соединение³².

Продолжая работу, описанную в WO2006/021817, авторы изобретения разработали киРНК SYL040012, указанную в SEQ ID NO: 2, которая представляет собой химически синтезированный, немодифицированный, двухцепочечный олигонуклеотид длиной 19 п.о. с выступающими дезоксидимидиновыми динуклеотидами на 3'-концах, способный избирательно подавлять синтез β2-адренергических рецепторов, показанный для лечения повышенного ВГД у пациентов с глазной гипертонией, открытоугольной глаукомой и другими связанными заболеваниями.

Соединение обладает доказанной эффективностью в отношении ингибирования экспрессии своей мишени в клеточных культурах и в отношении снижения ВГД у нормотензивных кроликов и в модели повышения ВГД у кроликов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: in vitro эффективность SYL040012 в клетках человека. (А) Динамика ингибирования ADRB2 в клетках человека: клетки BxPC3 и MDA-MB-231 трансфицировали либо 100 нМ SYL040012, либо 100 нМ киРНК с перетасованной случайным образом последовательностью, выделяли РНК, и экспрессию ADRB2 анализировали в различных временных точках после трансфекции. (В) Дозозависимое ингибирование ADRB2 в ответ на SYL040012 в клетках BxPC3: клетки BxPC3 трансфицировали увеличивающимися дозами SYL040012, и экспрессию ADRB2 анализировали через 48 ч после трансфекции. (C) Экспрессия семейства адренергических рецепторов в ответ на SYL040012. К клетками BxPC3 и MDA-MB-231 добавляли любое из 100 нМ SYL040012, киРНК с перетасованной последовательностью или носитель. * указывает на статистически достоверный уровень p<0,5 относительно нулевой временной точки.

Фигура 2: стабильность SYL040012 в биологических жидкостях. Стабильность SYL040012 оценивали у кроликов в водянистой влаге и сыворотке с помощью нативной ВЭЖХ в различных временных точках путем внесения в свежеполученные образцы обеих биологических жидкостей 20 мкМ раствора SYL040012 в PBS в нулевой временной точке. Результаты представлены в виде доли от исходного количества. Данные представлены в виде среднего ± среднеквадратичное отклонение для двух независимых анализов.

Фигура 3: снижение уровня eGFP в цилиарном теле после воздействия eGFP-киРНК. eGFP-трансгенные мыши получали три дозы по 160 мкг в день. Через 48 ч после последнего введения животных забивали, и глаза энуклеировали и подготавливали для флуоресцентной микроскопии. На левых панелях показаны полученные с помощью ДИК-микроскопии Номарского микрофотографии цилиарного тела животного, получавшего PBS (A), и животного, получавшего eGFP-киРНК (B). На средних панелях показаны микрофотографии, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, для животного, получавшего PBS (С), и животного, получавшего eGFP-киРНК (D). На правой панели показано слияние микрофотографий, полученных с помощью микроскопии Номарского и флуоресцентной микроскопии. NPE: непигментированный эпителий; PE: пигментированный эпителий.

Фигура 4: in vivo эффективность SYL040012 у кроликов. (А) Понижающий ВГД эффект SYL040012: две группы кроликов NZW получали либо SYL040012 (20 нмоль/день), либо PBS в течение 4 дней. ВГД оценивали через каждые два часа до 8 часов после каждого введения, такая же схема использовалась на 5-10 день, однако соединения не вводились. (В) Специфичность эффекта SYL040012: две группы кроликов NZW получали либо 100 нМ киРНК с перетасованной последовательностью, либо PBS. ВГД оценивали как описано выше. (С) Длительный понижающий ВГД эффект SYL040012: двум группам кроликов вводили либо 20 нмоль/день SYL040012, либо PBS, двумя сериями по четыре дня с интервалом между ними в три дня без введения соединения. ВГД оценивали, как описано выше, с 1-го по 13-й день. Показаны репрезентативные эксперименты.

Фигура 5: эффективность SYL040012 в кроличьей модели высокого внутриглазного давления, индуцированного избыточным пероральным введением воды. (А) Зависимость ответа ВГД от дозы SYL040012: животным вводили либо SYL040012 в одной из следующих дозировок: 10, 20, 40 или 60 нмоль/глаз/день, либо PBS на протяжении четырех дней. Через 120 мин после введения последней дозы, глазную гипертонию индуцировали избыточным пероральным введением воды. ВГД оценивали одновременно с введением последней дозы, за 60 мин и непосредственно перед избыточным пероральным введением воды и всего 10 раз с 25-минутным интервалом между измерениями после избыточного перорального введения воды. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM) для двух животных на группу. (В) Специфичность SYL040012 в отношении ВГД: животным вводили либо 40 нмоль/глаз/день SYL040012, либо киРНК с перетасованной последовательностью, либо PBS, как указано выше. Пероральное избыточное введение воды и измерения ВГД проводили, как указано в (А). Данные представляют собой средние значения ± SEM для 12 животных для SYL040012; 11 животных для PBS и 2 животных для киРНК с перетасованной последовательностью. (C) Снижение уровня ADRB2 у животных, получавших SYL040012. Животные получали соединения, как указано в (В), и сразу после последнего измерения ВГД животных забивали, энуклеировали глаза и выделяли роговицу, слезные железы и цилиарное тело. Выделяли тотальную РНК, и экспрессию ADRB2 анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. Данные представляют собой средние значения ± SEM для 3 животных на группу. Статистическую достоверность вычисляли путем сравнения каждой структуры из обработанного глаза с противоположным глазом, который обрабатывали PBS с использованием непарного t-теста Стьюдента, и она составляла ***p<0,001.

Фигура 6: кривые зависимости ВГД от доз А и В SYL040012. А. Изменения ВГД у 12 здоровых субъектов в ответ на повторяющееся введение дозы А SYL040012; B. Изменения ВГД в подгруппе субъектов, которые показывали снижение ВГД более чем на 20% при дозе А SYL040012 (n=5). C: Изменения ВГД у 12 здоровых субъектов в ответ на многократное введение дозы В SYL040012. Данные представляют собой среднее ± SEM для 12 субъектов в (А) и (С) и 5 субъектов в (В). Статистическую достоверность вычисляли с помощью двустороннего ANOVA для повторных измерений, и для последующих парных сравнений были сделаны поправки Бонферрони, и она составляла: ***p<0,001; **p<0,01 и *p<0,05.

Фигура 7: молекулы киРНК по изобретению. На данной фигуре показаны последовательности олигонуклеотидов для молекул киРНК, охватываемых настоящим изобретением.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам, композициям и дозировкам, которые снижают ВГД глаза, включающим SYL040012, молекулу 19-нуклеотидной двухцепочечной РНК с дезокситимидиновыми динуклеотидами, выступающими на 3'-концах. Композиции по настоящему изобретению включают SYL040012 в солевом растворе, таком как PBS, и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые позволяет ее инстилляцию на глаз, а именно, в виде глазных капель. Дозировки по изобретению включают ежедневную инстилляцию глазных капель в объеме между примерно 30 мкл и примерно 40 мкл, включающем между примерно 0,6 мг и 0,9 мг SYL040012.

Настоящее изобретение относится к способам, композициям и дозировкам, которые снижают ВГД глаза. Композиции по изобретению включают молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), которые снижают экспрессию гена адренергического рецептора бета-2 (ADRB2), что, как указывалось ранее, снижает выработку внутриглазной жидкости в передней камере глаза. Композиции по изобретению могут использоваться в изготовлении лекарственного препарата для лечения глазных заболеваний, проявляющихся повышением ВГД, таких как глаукома, инфекции, воспаления, увеит и диабетическая ретинопатия. Способы по изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества одной или нескольких киНК по изобретению по эффективной схеме дозирования.

Композиции по изобретению включают молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), которые снижают или ингибируют экспрессию адренергического рецептора бета-2 (ADRB2), гена, связанного с производством внутриглазной жидкости, т.е. водянистой влаги. Настоящее изобретение охватывает композиции и способы применения коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), включающих, но не ограниченных ими, молекулы коротких интерферирующих РНК (киРНК), двухцепочечных РНК (дцРНК) и коротких шпилечных РНК (кшРНК), способных опосредовать РНК-интерференцию в отношении гена-мишени, ADRB2. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения киНК, используемые в способах по настоящему изобретению, являются дцРНК. киНК по изобретению могут быть немодифицированными или химически модифицированными.

Способы по изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества киНК по изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления способы по изобретению обеспечивают длительное снижение ВГД по сравнению с длительностью снижения ВГД, являющейся результатом введения коммерчески доступных препаратов, таких как Ксалатан, Трусопт и Тимофтол.

Способы по изобретению также включают введение одной или нескольких киНК по изобретению в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими препаратами, которые снижают ВГД, включая, но не ограничиваясь этим, коммерчески доступные препараты.

Способы по изобретению также включают введение композиции по настоящему изобретению посредством инстилляции на поверхность глаза. Когда киРНК вводят непосредственно в глаз, обычно вводят киРНК в количестве от примерно 0,01 мг до примерно 100 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,04 мг до примерно 80 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,04 мг до примерно 20 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,08 мг до примерно 10 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,08 мг до примерно 1,2 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,3 мг до примерно 0,9 мг на каждый глаз в день или от примерно 0,08 мг до примерно 0,9 мг на каждый глаз в день.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам, композициям и дозировкам, которые снижают ВГД глаза. Композиции по изобретению включают молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), которые снижают экспрессию гена бета-адренергического рецептора 2 (ADRB2), что, как указано выше, снижает продукцию водянистой влаги в передней камере глаза. Композиции по изобретению могут использоваться в изготовлении лекарственного средства для лечения глазного заболевания, проявляющегося повышением ВГД, такого как глаукома. Способы по изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества одной или нескольких киНК по изобретению по эффективной схеме дозирования

Подбор киНК

киНК по изобретению предназначены для модулирования активности за счет снижения или ингибирования экспрессии ADRB2, влияя, таким образом, на ВГД. В одном варианте осуществления изобретения снижение или ингибирование экспрессии гена-мишени уменьшает выработку внутриглазной жидкости, например, водянистой влаги. Номером доступа для ADRB2, указанного гена-мишени, в GenBank является NM_000024.

Используемый в настоящем документе термин «киНК» по изобретению относится к двухцепочечному олигонуклеотиду, способному опосредовать расщепление мРНК-мишени с помощью РНК-интерференции. Он является более предпочтительным чем «киРНК», чтобы избежать путаницы, учитывая, что обычной практикой в данной области является включение в структуру молекулы модифицированных неканонических оснований и, иногда, дезоксирибонуклеотида, включая одноцепочечные тимидиновые выступающие концы двухцепочечного участка.

Ген является «мишенью» киНК по изобретению, когда, например, молекула киНК избирательно снижает или ингибирует экспрессию гена. Фраза «избирательно снижает или ингибирует», используемая в данном документе, включает в себя киНК, которые снижают экспрессию одного гена, а также те, которые снижают экспрессию более чем одного гена. В тех случаях, когда киНК снижают экспрессию более чем одного гена, экспрессия гена, который является мишенью, снижается по меньшей мере примерно в два раза, примерно в три раза, примерно в четыре раза, примерно в пять раз, примерно в десять раз, примерно в двадцать пять раз, примерно в пятьдесят раз или примерно в сто раз относительно любого другого гена. В альтернативном варианте, ген является мишенью киНК, когда киНК гибридизуется в жестких условиях с транскриптом гена. киНК могут быть проверены либо in vitro или in vivo на способность специфично действовать на ген.

Для последовательности киНК по изобретению выбирают короткий фрагмент последовательности мРНК гена-мишени (например, 19-40 нуклеотидов в длину). В одном варианте осуществления изобретения киНК является киРНК. В предпочтительных вариантах осуществления критерии выбора фрагмента последовательности мРНК гена-мишени в качестве потенциальной молекулы киРНК включают: (1) последовательность из мРНК гена-мишени, которая отстоит по меньшей мере на 50-100 нуклеотидов от 5'- или 3'-конца нативной молекулы мРНК, (2) последовательность из мРНК гена-мишени, которая имеет содержание G/C-нуклеотидов в диапазоне от 30% до 70%, наиболее предпочтительно около 50%, (3) последовательность из мРНК гена-мишени, которая не содержит повторяющихся последовательностей (например, AAA, CCC, GGG, UUU, AAAA, CCCC, GGGG, UUUU), (4) последовательность из мРНК гена-мишени, которая доступна в мРНК, и (5) последовательность из мРНК гена-мишени, которая является уникальной для гена-мишени. Фрагмент последовательности из мРНК гена-мишени может соответствовать одному или нескольким критериям, перечисленным выше. В вариантах осуществления, где фрагмент из мРНК гена-мишени соответствует не всем вышеперечисленным критериям, исходная последовательность может быть изменена таким образом, чтобы киРНК соответствовала большему числу критериев, чем фрагмент мРНК гена-мишени. В предпочтительных вариантах осуществления киРНК имеет содержание G/C ниже 60% и/или не имеет повторяющихся последовательностей.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения участок киНК, который комплементарен области-мишени, является полностью комплементарным области-мишени. В другом конкретном варианте осуществления изобретения участок киНК, который комплементарен области-мишени, не полностью комплементарен области-мишени. киНК со вставками, делециями и точечными мутациями относительно последовательности-мишени также охвачены настоящим изобретением. Таким образом, идентичность последовательностей может быть рассчитана с помощью алгоритмов сравнения и выравнивания последовательностей, известных в данной области (см. Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press 1991, и ссылки в ней), и вычисления различий в процентах между нуклеотидными последовательностями с помощью, например, алгоритма Смита-Уотермана, реализованного в программе BESTFIT с использованием параметров по умолчанию (например, от University of Wisconsin Genetic Computing Group). Более 90%, 95% или 99% идентичности последовательностей между киНК и участком гена-мишени является предпочтительным. В альтернативном варианте, комплементарность между киНК и нативной молекулой РНК может быть определена функционально путем гибридизации. Последовательность киНК по изобретению способна гибридизоваться с участком транскрипта гена-мишени в жестких условиях (например, в 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES рН 6,4, 1 мМ EDTA, при 50°С или 70°С в течение 12-16 часов с последующей промывкой). Последовательность киНК по изобретению также могут быть определена функционально по своей способности снижать или ингибировать экспрессию гена-мишени. Способность киНК влиять на экспрессию генов может быть определена эмпирически либо in vivo, либо in vitro.

В дополнение к киНК, которые специфичны только к одному гену, для направленного воздействия на гомологичные области нескольких генов могут использоваться вырожденные последовательности киНК. В WO 2005/045037 описан подбор молекул киНК, которые специфичны к таким гомологичным последовательности, например, путем включения неканонических пар оснований, например, несоответствий и/или несовпадающих пар оснований, что может обеспечить дополнительные последовательности-мишени. В тех случаях, когда обнаружены несоответствия, могут использоваться неканонические пары оснований (например, несоответствия и/или несовпадающие основания) для создания молекул киНК, мишенями которых является несколько последовательностей генов. В неограничивающем примере неканонические пары оснований, такие как UU- и СС-пары оснований, используются для создания молекул киНК, способных к направленному действию на последовательности различных мишеней, гомологичных по последовательности. Поэтому, одним из преимуществ использования киНК по изобретению является возможность подбора одной киНК, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеотидной последовательности, которая является консервативной у гомологичных генов. При таком подходе одна киНК может использоваться для ингибирования экспрессии более чем одного гена, вместо использования нескольких молекул киНК, для специфичного воздействия на различные гены.

Предпочтительные молекулы киНК по изобретению являются двухцепочечными. В одном варианте осуществления изобретения двухцепочечные молекулы киНК содержат тупые концы. В другом варианте осуществления изобретения двухцепочечные молекулы киНК содержат выступающие нуклеотиды (например, выступающие концы из 1-5 нуклеотидов, предпочтительно из 2 нуклеотидов). В конкретном варианте осуществления изобретения выступающие нуклеотиды находятся на 3'-концах. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выступающие нуклеотиды находятся на 5'-концах. Любой тип нуклеотида может быть частью выступающего конца. В одном варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются рибонуклеиновыми кислотами. В другом варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются дезоксирибонуклеиновыми кислотами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются тимидиновыми нуклеотидами. В другом варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются модифицированными или неклассическими нуклеотидами. Выступающий нуклеотид или нуклеотиды могут иметь неклассические межнуклеотидные связи (например, отличные от фосфодиэфирной связи).

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиции киНК по изобретению подобраны для специфичного действия на SEQ ID NO: 1. Дополнительные варианты осуществления изобретения относятся к киНК, определенным в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. В другом варианте осуществления изобретения, предпочтительной киНК по изобретению является SEQ ID NO: 2 (SYL040012). Этой предпочтительной киНК, SYL040012, является молекула 19-нуклеотидной немодифицированной двухцепочечной РНК с выступающими динуклеотидами на 3'-концах, содержащими дезокситимидиновые основания, как показано на фиг. 7.

Синтез киНК

киНК, подобранные способами, описанными выше, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники. РНК предпочтительно химически синтезировать с использованием соответствующим образом защищенных рибонуклеозид-фосфорамидитов и обычного ДНК/РНК-синтезатора. Кроме того, киРНК могут быть получены из коммерческих источников синтеза олигоРНК, включающих, но не ограниченных ими, Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA), and Cruachem (Glasgow, UK), Qiagen (Germany), Ambion (USA) и Invitrogen (Scotland). В альтернативном варианте молекулы киНК по изобретению могут быть экспрессированы в клетках путем трансфекции клеток векторами, содержащими обратную комплементарную киНК последовательность под контролем промотора. После экспрессии киНК может быть выделена из клетки с помощью методик, хорошо известных в данной области техники.

В вариантах осуществления изобретения, в которых киРНК является двухцепочечной РНК (дцРНК), если получены одноцепочечные молекулы РНК, необходима стадия отжига. Кратко, объединяют 30 мл 50 мМ раствора каждого РНК-олигонуклеотида в 100 мМ ацетате калия, 30 мМ HEPES-КОН, pH 7,4, 2 мМ ацетате магния. Затем раствор инкубируют в течение 1 мин при 90°С, центрифугируют в течение 15 секунд и инкубируют в течение 1 часа при 37°С.

В вариантах осуществления изобретения, в которых киРНК представляет собой короткую шпилечную РНК (кшРНК), две цепи молекулы киРНК могут быть соединены линкерной областью (например, нуклеотидным линкером или не-нуклеотидным линкером).

5.3 Химическая модификация киНК

киНК по изобретению могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов и/или не-фосфодиэфирных связей. Химические модификации, хорошо известные в данной области техники, способны повышать стабильность, доступность и/или поглощение клетками киНК. Специалисту будет известно о других видах химических модификаций, которые могут быть включены в молекулы РНК (обзор типов модификаций см. в международных публикациях WO 031070744, WO 2005/045037 или WO 2008/104978).

В одном варианте осуществления изобретения могут использоваться модификации, чтобы обеспечить повышенную устойчивость к деградации или повышенное поглощение. Примеры таких модификаций включают фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, 2'-О-метилрибонуклеотиды (особенно на смысловой цепи двухцепочечной киРНК), 2'-дезоксифторрибонуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды, нуклеотиды с «универсальным основанием», 5-С-метилнуклеотиды и включение инвертированного дезоксинуклеотида с удаленным азотистым основанием (в общем см. GB 2406568).

В другом варианте осуществления изобретения модификации могут использоваться для повышения стабильности киРНК или для усиления специфичности. Модификации включают химическую сшивку двух комплементарных нитей киРНК, химическую модификацию 3'- или 5'-конца цепи киРНК, модификацию сахара, модификации нуклеиновых оснований и/или модификации каркасной цепи, 2'-фтор-модифицированные рибонуклеотиды и 2'-дезоксирибонуклеотиды (в общем см. международную публикацию WO 2004/029212).

В другом варианте осуществления изобретения модификации могут использоваться, чтобы увеличить или уменьшить сродство к комплементарным нуклеотидам в мРНК-мишени и/или в комплементарной цепи киНК (в общем см. международную публикацию WO 2005/044976). Например, немодифицированный пиримидиновый нуклеотид может быть замещен на 2-тио, 5-алкинил, 5-метил или 5-пропинилпиримидин. Кроме того, немодифицированный пурин может быть замещен 7-деаза, 7-алкил или 7-алкенилпурином.

В другом варианте осуществления изобретения, когда киНК представляет собой двухцепочечную киРНК, 3'-концевые выступающие нуклеотиды заменены дезоксирибонуклеотидами, см., например, Elbashir et al.³³.

Демонстрация терапевтической полезности

Композиции и способы по настоящему изобретению предпочтительно тестируют in vitro, а затем in vivo, на желаемую терапевтическую активность перед использованием в организме человека. Например, методы анализа in vitro, которые могут использоваться, чтобы определить, показано ли применение конкретного терапевтического протокола, включают методы анализа на клеточных культурах in vitro, в которых перспективную киНК вводят в клетки (например, клетки непигментированного ресничного эпителия кролика (NPE), клетки ресничного эпителия человека (OMDC) или клетки почки эмбриона человека (HEK293)) in vitro, и наблюдают влияние такого воздействия на клетки, например, снижение или ингибирование экспрессии гена-мишени.

Соединения для использования в терапии могут быть проверены в подходящих животных модельных системах до начала испытаний на человеке, включающих, но не ограниченных ими, кроликов, крыс, мышей, кур, коров, обезьян, хомяков и т.д. Например, новозеландский кролик является предпочтительным стандартом в экспериментальных платформах, предназначенных для изучения ВГД. Они просты в обращении и имеют крупные глаза, похожие по размеру на орган человека. Кроме того, существующее оборудование для измерения внутриглазного давления не подходит для использования у животных с небольшими глазами, такими как мыши или крысы. Наконец, кролики имеют ВГД, которое может быть снижено до 40% от его обычного (или до введения лекарств) показателя с использованием коммерческого местного гипотензивного лекарственного препарата. Таким образом, несмотря на возможность создания модели глаукомы у кроликов (например, хирургическим блокированием эписклеральных вен или искусственной окклюзией трабекулярной сети), обычно специалисты в данной области предпочитают модели, в которых глазные структуры остаются нетронутыми.

Терапевтические способы

Настоящее изобретение охватывает способы лечения, предупреждения или контроля глазного заболевания, ассоциированного с повышенным ВГД у пациента (например, у млекопитающего, в особенности, у человека), включающие введение эффективного количества одной или нескольких киНК по изобретению. В конкретном варианте осуществления изобретения, заболеванием, подлежащем лечению, предупреждению или контролю, является глаукома. Любой тип глаукомы, который ассоциирован с ВГД, можно лечить с помощью способов по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, открытоугольную глаукому (например, первичную открытоугольную глаукому, пигментную глаукому и эксфолиативную глаукому, глаукому низкого давления), глаукому закрытого угла (также известную клинически как закрытоугольная глаукома, узкоугольная глаукома, глаукома с зрачковым блоком и глаукома с цилиарным блоком) (например, острую закрытоугольную глаукому и хроническую закрытоугольную глаукому), глаукому при аниридии, врожденную глаукому, ювенильную глаукому, вызываемую ношением линз глаукому, неоваскулярную глаукому, посттравматическую глаукому, вызываемую стероидами глаукому, глаукому при синдроме Стерджа-Вебера и вызываемую увеитом глаукому.

Терапевтические методы с использованием киРНК, направленных на определенные гены-мишени, как ожидается, будут полезны в виде местных глазных капель, содержащих низкомолекулярные соединения, путем увеличении продолжительности времени, в течение которого наблюдается эффект, тем самым позволяя более редкое введение препарата и лучшее соблюдение пациентом схемы лечения.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения киНК, используемые в терапевтических способах по изобретению, снижают или ингибируют экспрессию генов, которые влияют на ВГД, таких как адренергический рецептор бета-2. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, киНК, используемые в терапевтических способах по изобретению, направлены на SEQ ID NO: 1. В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения, киНК имеет от 21 до 30 нуклеотидов в длину и содержит последовательность SEQ ID NO: 3. Особенно предпочтительной является SYL040012 с SEQ ID NO: 2, не имеющей модификаций, то есть без неканонических оснований, и содержащая выступающие TT-динуклеотиды на обоих 3'-концах.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, способы по настоящему изобретению обеспечивают устойчивое снижение ВГД, которое длится дольше, чем 8, 10, 12 или 14 часов, более предпочтительно в течение нескольких дней (например, в течение 2 дней, 3 дней, 4 дней или 5 дней) после последнего введения киНК. В таких вариантах осуществления, эффект (то есть, снижение ВГД) введенных киНК по изобретению длится дольше, чем продолжительность снижения ВГД, которая является результатом введения коммерчески доступных препаратов (например, Ксалатана, Трусопта и Тимофтола). киНК по изобретению, которые обеспечивают длительное снижение ВГД, можно вводить по такой схеме, чтобы ВГД непрерывно снижалось без ежедневного введения киНК. В конкретном варианте осуществления, схема лечения может включать в себя последовательные циклы с введением препарата (например, одна доза киНК ежедневно в течение четырех дней) и без введения препарата (например, 3 или 4 дня без лечения), все еще вызывая постоянное снижение ВГД.

В одном варианте осуществления изобретения единственный тип киНК вводят в терапевтических способах по изобретению. В другом варианте осуществления изобретения киНК по изобретению вводят в комбинации с другой киНК по изобретению и/или с одним или несколькими другими терапевтическими агентами (не киНК), полезными для лечения, профилактики или контроля глазного заболевания, ассоциированного с повышенным ВГД. Термин «в комбинации с» не ограничен введением терапевтических агентов точно в одно и то же время, а скорее означает, что киНК по изобретению и другой агент вводят пациенту последовательно и в течение временного интервала, так чтобы польза комбинации была выше, чем польза от их введения иным образом. Например, каждый терапевтический агент можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке в различные моменты времени; однако, если не вводить соединения одновременно, то их следует вводить достаточно близко по времени, так чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект. Каждый терапевтический агент можно вводить отдельно, в любой подходящей форме и любым подходящим способом.

Дозировка

В контексте настоящего документа «эффективное количество» относится к такому количеству киНК по изобретению, которое достаточно для лечения или контроля глазного заболевания, связанного с повышенным ВГД и предпочтительно к количеству, достаточному для снижения ВГД. Для лечения повышенного ВГД у человека, предпочтительно снижать внутриглазное давление, так чтобы ВГД находилось между примерно 14 и 20 мм рт. ст. Однако любое снижение ВГД по сравнению с ВГД до лечения является предпочтительным при введении соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другим подходящим терапевтическим средством (например, изобретение предусматривает снижение ВГД более чем примерно на 5%, примерно на 10%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 35%, примерно на 40%, примерно на 50% или примерно на 60% от ВГД до лечения). В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения по изобретению могут вызвать снижение ВГД, которое составляет от примерно 1% до примерно 99%, от примерно 5% до примерно 90%, от примерно 10% до при