Композиции коктейля, содержащие антибактериальные фаги, и способы их применения

Композиции коктейля, содержащие антибактериальные фаги, и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в формате ASCII через EFS-Web и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 14 марта 2012 г., названа 16395105.txt, и ее размер составляет 574104 байт.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области фаговой терапии для лечения и контроля бактериальных инфекций, в частности, таких хронических язв, как инфекции диабетической стопы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым коктейлям штаммов бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08, F1245/05, другого фага и/или их вариантов; и способам их применения в лечении и профилактике бактериальных инфекций, включая в себя кожные язвы, связанные с инфекциями диабетической стопы, вызванными, например, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Коктейли используются в качестве фармацевтических композиций либо отдельно, либо в дополнительной комбинации с другими видами терапии, например, антибиотиками, факторами роста или другими стандартными и нестандартными видами терапии для хронических язв.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Инфекции диабетической стопы (DFI) представляют собой частое и серьезное осложнение сахарного диабета (DM) и во всем мире они являются ведущей причиной нетравматической ампутации нижней конечности (Jeffcoate WJ, et al. 2003. Lancet 361:1545-1551). В современной клинической практике лечение DFI включает в себя иссечение нежизнеспособных тканей и применение системных антибиотиков (смотрите, например, Lipsky ΒΑ, et al. 2004. Clin Infect Dis. 39:885-910). Тем не менее вследствие неполноценной васкуляризации и локального микроокружения концентрации антибиотиков являются многократно субтерапевтическими (Lipsky ΒΑ, et al. 2009. Clin Infect Dis. 49:1541-1549). Более того, увеличивающаяся частота встречаемости таких мультирезистентных организмов, как резистентные к метициллину Staphylococcus aureus, а также панрезистентных неферментирующих отрицательных палочковидных бактерий, угрожает конечному результату в виде возрастающих количеств внебольничных и госпитализированных пациентов (Mendes JJ, et al. 2012. Diabetes Res Clin Pract. 95(1):153-161; Tascini C, et al. 2011. Diabetes Res Clin Pract 94 (1):133-139). Соответственно, остается потребность в определении новых стратегий лечения, контроля и управления DFI.

Местное лечение предоставляет преимущества в избегании системных побочных эффектов, обеспечивая повышенную концентрацию в целевом месте и позволяя использовать средства, не доступные для системной терапии. Механическое иссечение нежизнеспособных тканей улучшает местное лечение, поскольку оно снижает бионагрузку присутствующих бактерий, а также открывает зависимый от времени терапевтический диапазон для местной антибактериальной терапии (TAT) (Wolcott RD, et al. 2010. J Wound Care 19:320-328). Тем не менее в настоящее время ни одно средство ТАТ не было признано в качестве эффективного для лечения DFI (Nelson ЕА, et al. 2006. Diabet Med 23:348-359).

Бактериофаги (фаги) представляют собой вирусы, которые специфически инфицируют и лизируют бактерии. Фаговая терапия, способ применения целых фагов для лечения бактериальных инфекционных заболеваний, был введен в 1920-ых гг. Феликсом Д'Эрелем. Тем не менее с разработкой антибиотиков в 1940-ых гг. интерес к терапевтическим средствам на основе фагов в западном мире снизился. Одним из наиболее важных факторов, которые содействовали этому снижению, было отсутствие стандартизированных протоколов испытания и способов получения. Неспособность разработать стандарты промышленного масштаба для испытания видов фаговой терапии препятствовало ведению документации о результатах исследований, что привело к видимому отсутствию эффективности, а также проблемам с достоверностью, касающейся объема фаговой терапии. Другая проблема в получении фагов была связана со степенью чистоты коммерческих препаратов фагов, при этом препараты содержали нежелательные бактериальные компоненты, например, эндотоксины. Соответственно, с препаратами часто были связаны побочные события, особенно у пациентов, получающих их внутривенно.

Тем не менее в Восточной Европе и бывшем Советском Союзе, где доступ к антибиотикам был ограничен, разработка и применение фаговой терапии продолжались совместно с антибиотиками или вместо них. Кроме того, с ростом резистентных к антибиотикам штаммов многих бактерий в западном мире возродился интерес к терапевтическим средствам на основе фагов. Иными словами, даже если могут быть разработаны новые классы антибиотиков, перспектива того, что бактерии рано или поздно приобретут резистентность к новым лекарственным средствам, приводит к необходимости интенсивного поиска не химиотерапевтических средств для контроля, профилактики и лечения бактериальных инфекций.

Литический бактериофаг, особенно если он дополнен адекватным механическим иссечением нежизнеспособных тканей, предлагает решение для лечения DFI, например, для применения в качестве новых средств ТАТ. Логические бактериофаги могут предложить преимущества в специфичности и результативности в лизировании патогенных бактерий, даже с мультирезистентностью (Rossney AS, et al. 1994. J Hosp Infect 26:219-234.) Дополнительные преимущества могут включать в себя отсутствие патогенности в отношении людей и животных (Burrowes В, et al. 2011. Expert Rev Anti Infect Ther 9:775-785), антибактериальную активность против бактерий в биопленках и активность микроаэрофильном окружении, даже с высокой бактериальной нагрузкой (Azeredo J, et al. 2008. Curr Pharm Biotechnol 9:261-266), а также, как правило, приемлемую безопасность бактериофаговой терапии в некоторых частях света (Sulakvelidze A, et al., 2001, Antimicrob Agents Chemother. 45(3):649-659). Недавние испытания бактериофаговой терапии на животных показали ее потенциал в заживлении или улучшении кожных бактериальных заболеваний, как при внутренних (McVay CS, et al. 2007. Antimicrob Agents Chemother 51:1934-1938), так и наружных применениях (Soothill JS. 1994. Burns 20:209-211; Wills QF, et al. 2005. Antimicrob Agents Chemother 49:1220-1221). Тем не менее существует мало опубликованных данных в поддержку применения бактериофагов для лечения инфекций, продолжающихся в течение более длительного периода, чем несколько часов (Ryan ЕМ, et al. 2011 J Pharm Pharmacol 63:1253-1264).

В частности, фаговые коктейли могут обеспечивать преимущества для применения фагов отдельно, например, для увеличения литической активности против конкретного бактериального штамма и для снижения возможности появления бактерий, резистентных в отдельному бактериофагу. Иными словами, различные бактериофаги могут быть смешаны в виде коктейлей для расширения их свойств, предпочтительно давая в результате обобщенно больший спектр антибактериальной активности, например, расширенный круг хозяев, по отношению к которым менее вероятно развитие резистентности. Тем не менее в настоящее время существуют лишь несколько фаговых коктейлей с антибактериальной активностью против различных бактерий, возможно вследствие сложности в комбинировании различных специфичностей бактериофага при сохранении стабильности при хранении.

Следовательно, существует необходимость в разработке новых фаговых продуктов в качестве терапевтических и/или профилактических средств для применения in vivo против патогенных бактерий. Также существует потребность в лучших видах лечения, в частности, местных видов лечения для DFI. В частности, существует необходимость в бактериофаговых коктейлях, способных лизировать бактерии, обуславливающие DFI, включающие в себя Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Настоящая заявка направлена на указанные и другие потребности.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фаговые коктейли. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композиции, содержащие по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага, причем каждый характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 (F44/10), SEQ ID NO: 2 (F125/10), SEQ ID NO: 3 (F770/05), SEQ ID NO: 4 (F510/08) и SEQ ID NO: 5 (F1245/05), или ее вариант, причем вариант характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности относительно соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты и демонстрирует антибактериальную активность против по меньшей мере одного из Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Согласно некоторым вариантам осуществления один по меньшей мере из двух штаммов бактериофага представляет собой штамм с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере два штамма бактериофага представляют собой штаммы с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, или их варианты. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий и четвертый штамм бактериофага, причем каждый из третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления один по меньшей мере из двух штаммов бактериофага представляет собой штамм с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере два штамма бактериофага представляют собой штаммы с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий и четвертый штаммы бактериофага, причем каждый из третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления один по меньшей мере из двух штаммов бактериофага представляет собой штамм с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5 или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий и четвертый штаммы бактериофага, причем каждый из третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или ее вариант.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере пять выделенных штаммов бактериофага, причем штаммы характеризуются геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 или их вариант, где вариант характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности по отношению к соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты и демонстрирует антибактериальную активность против по меньшей мере одного из Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из штаммов бактериофага с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, 2, 4 и 5 или их варианты, присутствует в композиции в количестве, соответствующем приблизительно в 10 раз по сравнению с количеством штамма бактериофага с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция содержит штаммы бактериофага с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фаговые коктейли, в частности, фармацевтическим композициям, содержащим любую из описанных выше композиций и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция составлена для местного применения. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит стерильный буфер, например, буфер, содержащий приблизительно 0,05 M трис-HCl, приблизительно 0,1 M NaCl и приблизительно 10 мМ MgSO₄.7H₂O. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержится в ампуле.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительное средство, например, средство, выбранное из группы, состоящей из антибиотика, противовоспалительного средства, противовирусного средства, местноанестезирующего средства, фактора роста и кортикостероида. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, например, антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus; или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Более конкретно, согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Staphylococcus aureus, или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Staphylococcus aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Pseudomonas aeruginosa, или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Pseudomonas aeruginosa. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Acinetobacter baumannii, или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Acinetobacter baumannii. Согласно некоторым вариантам осуществления введение антибиотика предусматривает системное введение.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиция предназначения для применения в лечении бактериальной инфекции, связанной с областью неинтактной кожи, и каждый из штаммов фага присутствует в композиции в количестве, соответствующем 10³-10¹³ фаговых частиц/см² площади. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из штаммов фага присутствует в композиции в количестве, соответствующем 10⁷-10⁹ фаговых частиц/см² площади.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения или профилактики бактериальной инфекции у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающим введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную одним или несколькими из Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят местно. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой млекопитающего, например, человека. Согласно некоторым вариантам осуществления бактериальная инфекция представляет собой инфекцию диабетической стопы. Согласно некоторым вариантам осуществления инфекция диабетической стопы включает в себя кожную язву. Согласно некоторым вариантам осуществления бактериальная инфекция связана с областью неинтактной кожи, выбранной из поражения кожи, связанного с воспалением подкожной клетчатки, рожистым поражение, ожоговой раной, хронической язвой, пролежнем и намином. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение предусматривает местное введение фармацевтической композиции на кожную язву, связанную с инфекцией диабетической стопы. Согласно предпочтительным вариантам осуществления введение следует за механическим иссечением нежизнеспособных тканей язвы. Согласно некоторым вариантам осуществления введение предусматривает применение по меньшей мере одного из повязки, инстилляционного устройства и устройства для терапии ран отрицательным давлением.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят каждые 4 часа или каждые 6 часов в течение первых 24 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления после первых 24 часов фармацевтическую композицию вводят каждые 12 часов или каждые 24 часа в течение по меньшей мере 3 дополнительных дней. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят каждые 12 часов или каждые 24 часа в течение по меньшей мере 4 дополнительных дней.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ используется в комбинации со стандартной терапией инфекции диабетической стопы, например, стандартной терапией, выбранной из группы, состоящей из заместительной терапии внеклеточным матриксом, влажной терапии раны, терапии раны отрицательным давлением, терапии путем артериальной реваскуляризации, гипербарической оксигенотерапии, введения антибиотика и введения фактора роста. Согласно некоторым вариантам осуществления влажная терапия раны предусматривает применение пленки с адгезивной основой, покрытой силиконом пены, гидрогеля и/или гидроколлоида. Согласно некоторым вариантам осуществления заместительная терапия внеклеточным матриксом предусматривает применение биоконструкционной ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления введение антибиотика предусматривает системное введение. Согласно некоторым вариантам осуществления фактор роста представляет собой по меньшей мере фактор роста, выбранный из группы, состоящей из тромбоцитарного фактора роста, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов, фактора роста нервов и фактора роста сосудистого эндотелия. Согласно некоторым вариантам осуществления введение фактора роста предусматривает местное введение. Согласно некоторым вариантам осуществления способ используется в комбинации с нестандартной терапией инфекции диабетической стопы, например, если инфекция диабетической стопы рефрактерна к стандартной терапии.

Определения

Используемый в настоящем документе термин "выделенный" в контексте молекул нуклеиновой кислоты относится к первой молекуле нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в естественном источнике первой молекулы нуклеиновой кислоты. Более того, "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, по существу не содержит другой клеточный материал или культуральную среду, если она получена с помощью рекомбинантных техник, или по существу не содержит химические предшественники или другие химические средства, если она синтезирована химически, и может не содержать другие молекулы кДНК или другие молекулы геномной ДНК, например, если она была выделена из других клонов в библиотеке нуклеиновых кислот. Кроме того, "выделенная" геномная ДНК по существу не содержит другой вирусный клеточный материал или культуральную среду, если она получена с помощью рекомбинантных техник, или по существу не содержит химические предшественники или другие химические средства, если она химически синтезирована, и может не содержать другие молекулы кДНК или другие молекулы геномной ДНК, например, если она была выделена из препаратов, содержащих больше, чем штамм бактериофага и/или бактерии.

Термин "очищенный" в отношении бактериофага означает, что концентрация фага была заметно увеличена с помощью любого способа очистки, включая в себя без ограничения выделение из окружения или культуры, например, выделение из культуры после размножения и/или амплификации, центрифугирования и т.д., тем самым частично, существенно, почти полностью удаляя такие примеси, как клетки - хозяева и компоненты клеток - хозяев. Специалист в настоящей области техники определит уровень очистки, необходимый для заданного применения. Например, выделенный фаг, предусмотренный для применения в терапевтических композициях, предназначенных для введения людям, как правило, должен характеризоваться высокой степенью чистоты согласно нормативам и надлежащим способам производства.

Термин "очищенный" означает, что концентрации пептида, полипептида, белка слияния или молекулы нуклеиновой кислоты увеличили с помощью любого способа очистки, включая в себя без ограничения колоночную хроматографию, ВЭЖХ, осаждение, электрофорез и т.д., тем самым частично, существенно, почти полностью или полностью удаляя такие примеси, как предшественники или другие химические средства, вовлеченные в получение пептида, полипептида, белка слияния или молекулы нуклеиновой кислоты. Специалист в настоящей области техники определит уровень очистки, необходимый для заданного применения. Например, выделенная геномная ДНК, предусмотренная для применения в терапевтических композициях, предназначенных для введения людям, как правило, должна характеризоваться высокой степенью чистоты согласно нормативам и надлежащим способам производства.

Используемый в настоящем документе термин "вариант" в контексте последовательностей нуклеиновой кислоты относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к эталонной последовательности нуклеиновой кислоты. Может быть выбран вариант, который сохраняет одну или несколько функций эталонной последовательности нуклеиновой кислоты. Например, вариантный бактериофаг может проявлять по меньшей мере одну биологическую активность, например, антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) бактериофага, из которого он происходит.

Используемый в настоящем документе термин "клетка - хозяин" относится к конкретной клетке субъекта, трансфектированной молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или потенциальному потомству такой клетки, которое содержит молекулу нуклеиновой кислоты или ее хромосомно интегрированную версию. Потомство такой клетки может не быть идентичным родительской клетке, трансфектированной молекулой нуклеиновой кислоты, вследствие мутаций или воздействий окружающей среды, которые могут происходить в последующих поколениях, или интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки - хозяина. Для поколения бактериофага клетка - хозяин может относиться или не относиться к тому же виду или штамму, из которого был выделен или культивирован бактериофаг.

Используемый в настоящем документе термин "в комбинации" или "в дополнительной комбинации" или "дополнительно в комбинации" относится к применению дополнительного профилактического и/или терапевтического средства, а также фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Использование термина "в комбинации" не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические средства вводят субъекту. Первое профилактическое или терапевтическое средство могут вводить перед (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель до), одновременно или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель после) введения второго профилактического или терапевтического средства (отличного от первого профилактического или терапевтического средства) субъекту.

Используемые в настоящем документе термины "профилактическое средство" и "профилактические средства" относятся к такому средству, как бактериофаговый коктейль согласно настоящему изобретению, который может использоваться в профилактике, ведении или контроле одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения, в частности, заболевания или нарушения, связанного с такой бактериальной инфекцией, как инфекция диабетической стопы.

Используемые в настоящем документе термины "терапевтическое средство" и "терапевтические средства" относятся к такому средству, как бактериофаговый коктейль согласно настоящему изобретению, который может использоваться в лечении, ведении или контроле одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения, в частности, заболевания или нарушения, связанного с такой бактериальной инфекцией, как инфекция диабетической стопы.

Используемые в настоящем документе термины "лечить", "лечение" и "проведение лечение" относятся к получению терапевтического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию. В отношении достижения терапевтического эффекта, целью является устранить, уменьшить, снизить тяжесть, улучшить или замедлить прогрессирование симптомов или первопричины (например, бактериальной инфекции), связанных с патологическим состоянием или нарушением. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству такого терапевтического средства, как фармацевтическая композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению, достаточному для достижения по меньшей мере одного терапевтического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию.

Используемые в настоящем документе термины "предотвратить", "профилактика" и "осуществление профилактики" относятся к получению профилактического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию. В отношении достижения профилактического эффекта целью является отсрочить или предотвратить симптомы или первопричину (например, бактериальную инфекцию), связанные с патологическим состоянием или нарушением. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству такого профилактического средства, как фармацевтическая композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению, достаточному для достижения по меньшей мере одного профилактического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию.

Используемые в настоящем документе термины "антибактериальная активность" и "противомикробная активность" в отношении бактериофага (или его варианта или фрагмента) или продукта бактериофага, используются взаимозаменяемо для обозначения способности уничтожать и/или ингибировать рост или репродукцию микроорганизма, в частности, бактерий того вида или штамма, который инфицирует бактериофаг. Согласно определенным вариантам осуществления антибактериальная или противомикробная активность оценивается путем культивирования бактерий, например, грамположительных бактерий (например, S. aureus), грамотрицательных бактерий (например, A. baumannii, Ε. coli, и/или P. aeruginosa) или бактерий, не классифицированных ни как грамположительные, ни как грамотрицательные, согласно стандартным техникам (например, в жидкой культуре или на планшетах с агаром), приведения культуры в контакт с бактериофагом или его вариантом согласно настоящему изобретению и мониторинга роста клеток после указанного приведения в контакт. Например, в жидкой культуре бактерии могут выращивать до оптической плотности ("OD"), представляющей собой среднее значение в экспоненциальном росте культуры; культуру подвергают воздействию одной или нескольких концентраций одного или нескольких бактериофагов согласно настоящему изобретению или их вариантов, и OD подвергают мониторингу относительно контрольной культуры. Сниженная OD относительно контрольной культуре характерна для бактериофага, проявляющего антибактериальную активность (например, проявляется литическую цитотоксическую активность). Аналогично, на планшете с агаром могли формировать бактериальные колонии, планшет подвергали воздействию одного или нескольких бактериофагов согласно настоящему изобретению или их вариантов, и последующий рост колоний оценивали относительно контрольных планшетов. Уменьшенный размер колоний или уменьшенные общие количества колоний указывают на бактериофаг с антибактериальной активностью.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 проиллюстрировано получение иллюстративной композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 2 проиллюстрирован протокол исследования, используемый для демонстрации in vivo эффективности на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 3 проиллюстрирован протокол исследования, используемый для демонстрации in vivo эффективности на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 4 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Staphylococcus aureus 743/06, демонстрирующие in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 5 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Pseudomonas aeruginosa 433/07, демонстрирующих in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 6 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Acinetobacter baumannii 1305/05, демонстрирующие in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 7 проиллюстрированы результаты анализов микробиологической нагрузки для контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 8 проиллюстрированы результаты анализов закрытия раны для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животные, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 9 проиллюстрированы результаты гистологических анализов для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 10 проиллюстрированы результаты анализов микробиологической нагрузки для контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 11 проиллюстрированы результаты анализов закрытия раны для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 12 проиллюстрированы результаты гистологических анализов для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 13 проиллюстрированы классификации инфекций диабетической стопы и применение к ним фаговой терапии с использованием иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 14 проиллюстрирована схема клинического исследования для иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению для применения в терапии язв диабетической стопы.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к фаговой терапии для лечения и контроля бактериальных инфекций, в частности, инфекций диабетической стопы. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к новым композициям коктейля различных штаммов бактериофага. "Коктейль" может содержать по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше различных выделенных штаммов бактериофага. Коктейль может использоваться отдельно или в дополнительной комбинации с другими видами терапии, например, антибиотиками и/или факторами роста.

Фаговые коктейли предоставляют преимущества в применении фагов отдельно, например, для увеличения литической активности против конкретного бактериального штамма и/или для снижения возможности появления бактерий, резистентных в отдельному бактериофагу. Различные бактериофаги могут быть смешаны в виде коктейлей для расширения их свойств, предпочтительно давая в результате обобщенно больший спектр антибактериальной активности. Тем не менее существует лишь несколько фаговых коктейлей с антибактериальной активностью против различных бактерий, вероятно, вследствие сложности комбинирования различных специфичностей штаммов бактериофага при сохранении инфицирующей способности и/или литической активности отдельного бактериофага в присутствии отличающихся штаммов бактериофага.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую пять выделенных штаммов бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05, причем композиция коктейля составлена в виде местного состава и находит применение в лечении и/или профилактике инфекций диабетической стопы.

Настоящее изобретение согласно некоторым вариантам осуществления предусматривает композиции коктейля, содержащие по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага с антибактериальной активностью против одинаковых или различных бактериальных видов или штаммов. Согласно предпочтительным вариантам осуществления терапевтические компоненты коктейля нацелены на два или больше видов или штаммов бактерий. Согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль содержит по меньшей мере 2 штамма фага, по меньшей мере 3 штамма фага, по меньшей мере 4 штамма фага, по меньшей мере 5 штаммов фага, по меньшей мере 6 штаммов фага, по меньшей мере 7 штаммов фага, по меньшей мере 8 штаммов фага, по меньшей мере 9 штаммов фага, по меньшей мере 10 штаммов фага или больше. Согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль содержит 2-20 штаммов фага, 2-15 штаммов фага, 2-10 штаммов фага, 3-8 штаммов фага или 4-6 штаммов фага. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления комбинация не ослабляет или не снижает (или существенно или значительно не ослабляет или не снижает) инфицирующую способность и/или литическую активность отдельного бактериофага в присутствии отличающихся штаммов бактериофага.

Согласно некоторым вариантам осуществ