Полипептиды, связывающиеся с компонентом с5 системы комплемента человека

Полипептиды, связывающиеся с компонентом с5 системы комплемента человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые связываются с компонентом 5 (C5) системы комплемента человека, и к применению таких полипептидов в терапии.

Предпосылки создания изобретения

Белок С5 комплемента является центральным компонентом системы комплемента, ключевой части врожденной иммунной системы. Система комплемента является сложной системой иммунного выживания с многочисленными задачами в жестко контролируемых, разнообразных процессах. Одной из ее функций является как раз первая линия обороны организма против инфекции, вызванной другими организмами, за счет способности отличать здоровые ткани хозяина от клеточного дебриса и апоптотических и некротических клеток. Кроме того, эта система участвует в клиренсе иммунных комплексов, регулировании адаптивного иммунного ответа, стимуляции регенерации тканей, ангиогенезе, мобилизации стволовых клеток и развитии центральной нервной системы (Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48(14):1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9):785-795). Любой пусковой фактор, например, ошибочная или неограниченная активация или недостаточное регулирование, которые нарушают тонкий баланс активации и регулирования комплемента, могут привести к патологическим состояниям, включая аутоиммунную атаку на клетки организма-хозяина, приводящую к обширному повреждению тканей.

Система комплемента состоит примерно из 30 белков. Существует три пути для активации системы комплемента: классический путь, в котором для распознавания иммунных комплексов на поверхности клеток используется C1q; лектиновый путь, который инициируется при распознавании маннозосвязывающим лектином (MBL) определенных сахаров; и альтернативный путь, который инициируется спонтанно путем гидролиза фактора комплемента 3 (C3), причем процесс подавляется некоторыми молекулами на поверхности клеток млекопитающих, которые отсутствуют на поверхности болезнетворных микроорганизмов. Альтернативный путь также выступает в качестве усилительной петли для системы комплемента. Все три пути сходятся на уровне С3. Расщепление С3 на C3b и С3а приводит к образованию конвертазы, которая, в свою очередь, расщепляет фактор комплемента 5 (C5) на С5а и C5b. С5а является очень мощным аттрактантом различных иммунных клеток, в то время как C5b олигомеризуется с C6-9 с образованием поры, известной как мембраноатакующий комплекс (MAC) или, иногда, терминальный комплекс комплемента (TCC). Активация системы комплемента запускает ряд механизмов с целью нейтрализации патогена: образование MAC на поверхности клетки, такой как болезнетворная бактерия, приводит к лизису; отложение продуктов расщепления С3 и С4 (C3b и C4b) способствует опсонизации, которая приводит к фагоцитозу возбудителя макрофагами, а анафилотоксины, такие как С3а и C5a, привлекают моноциты и нейтрофилы к месту активации, активируют поверхностные маркеры, что приводит к увеличению иммунологической чувствительности и высвобождению цитокинов.

C5 представляет собой гликопротеин весом 190 кДа, содержащий две связанные дисульфидной связью полипептидные цепи - альфа и бета, с молекулярной массой 115 и 75 кДа, соответственно (Tack et al. Biochem 1979, 18:1490-1497). Haviland et al. (J. Immun 1991, 146:362-368) сконструировали полную последовательность кДНК пробелка C5 комплемента человека, которая предположительно кодирует 1676-аминокислотную промолекулу, содержащую 18-аминокислотный лидерный пептид и 4-аминокислотный линкер, разделяющий бета- и альфа-цепи. Блокирование расщепления C5 на C5a и C5b предупреждает образование MAC и провоспалительного C5a, но оставляет нетронутой вышестоящую эффекторную систему комплемента, позволяя C3/C4-опосредованную опсонизацию.

Ключевая роль системы комплемента в защите от патогенов в целом делает ее интересным объектом для фармацевтического вмешательства. Это подчеркивается тем фактом, что многие мутации или нарушенная регуляция системы комплемента связаны с различными заболеваниями и болезненными состояниями. Они включают в себя повышение вероятности возникновения аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (SLE), при которой отложение иммунных комплексов запускает классический путь (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22:431-456). Кроме того, мутации в белках комплемента C1-C5 часто приводят к SLE или SLE-подобным симптомам. Другими аутоиммунными заболеваниями с заметным вкладом системы комплемента являются ревматоидный артрит (RA), при котором иммунные комплексы могут активировать систему комплемента в пораженном RA суставе, синдром Шегрена, дерматомиозит и другие заболевания, вызываемые аутоантителами, такие как синдром Гийена-Барре (GBS), синдром Фишера (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223:5-12), различные типы васкулита, системный склероз, антитела к клубочковой базальной мембране (анти-GBM) и антифосфолипидный синдром (АФС) (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34:J276-J286).

Система комплемента, кроме того, участвует в нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера (AD), при которой амилоидные (Аβ) бляшки непосредственно активируют систему комплемента, приводя к С5а-опосредованному привлечению микроглии. Это было дополнительно подтверждено демонстрацией нейропротекторного действия антагониста C5aR в мышиной модели AD (Fonseca et al. J Immunol 2009, 183:1375-1383). Аутоантитела к ацетилхолиновому рецептору и последующая активация комплемента являются наиболее распространенной причиной миастении гравис, болезни, затрагивающей нервно-мышечные соединения (Toyka and Gold, Schweizer Archive Neurol Psych 2007, 158:309-321). Образование MAC участвует в патофизиологии рассеянного склероза (MS) (Oh et al. Immunol Res 2008, 40:224-234). Также при болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и прионных заболеваниях, таких как болезнь Крейтцфельда-Якоба, активация комплемента является частью патологического процесса (Bonifati and Kishore, Mol Immunol 2007, 44:999-1010). В процессе заживления ран воспалительные реакции являются ключевым компонентом восстановления тканевого гомеостаза, а система комплемента участвует в ранней диагностике поврежденных тканей. Тем не менее в моделях хронических ран и сильных ожогов ингибирование системы комплемента, например, ингибитором C1, приводило к улучшению заживления и уменьшению повреждения тканей, что позволяет предположить участие системы комплемента. Кроме того, было найдено, что различные нарушения в системе комплемента, такие как, например, у мышей, нокаутных по C4, защищают от долгосрочного повреждения тканей в результате ран (обзор приведен в статье Cazender et al. Clinical and Developmental Immunology 2012, опубликованной он-лайн). В последнее время было показано, что росту опухоли и пролиферации способствует активация системы комплемента, в частности С5а, а блокирование рецептора С5а замедляет этот процесс. Кроме того, у мышей, лишенных C3, наблюдался значительно более медленный рост опухоли, чем у их однопометников дикого типа (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9:1225-1235).

Нарушенное регулирование системы комплемента является причиной нескольких редко встречающихся или ультраредко встречающихся болезненных состояний, таких как пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH) и атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), при которых гемолиз является ключевой особенностью патологии. При PNH клон гематопоэтических стволовых клеток с мутациями в гене PIG-A, кодирующем субъединицу А фосфатидилинозит-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, занимает весь пул клеток крови. Эта мутация приводит к потере белков, заякоренных через GPI на поверхности клеток, таких как регуляторы комплемента, CD55 и CD59. Красные кровяные клетки, лишенные CD55 и CD59 на поверхности, подвергаются комплемент-опосредованному лизису с помощью MAC. Клинически PNH проявляется гемолизом, приводящим к анемии, тромбозу и нарушениям работы костного мозга. Атипичный HUS вызывается мутациями в регуляторных белках, главным образом, альтернативного пути, такими как мутации в факторе H.

Достоверно показано, что глаз является участком, затрагиваемым патологическими процессами при нарушениях работы комплемента. Наиболее распространенной причиной потери зрения является возрастная макулярная дегенерация (AMD), при которой в ее более тяжелой форме (экссудативная или влажная AMD) под сетчаткой развиваются патологические хориоидальные нейроваскулярные мембраны. В США около 10% населения в возрасте 65-74 лет имеет признаки макулярной дегенерации и до 5% имеют нарушения зрения в результате AMD. Эти цифры резко увеличиваются с возрастом, но также присутствуют и генетические факторы. Из генов наиболее сильно связанными с AMD белками системы комплемента являются факторы H, B и С3 и ингибитор С1 (Bradley et al. Eye 2011, 25:683-693). Кроме того, несколько исследований и клинических испытаний с использованием различных блокирующих систему комплемента молекул доказали их эффективность при этом заболевании, позволяя предположить, что молекула, блокирующая С5, может помочь этой группе пациентов. Тем не менее, современные методы лечения поздних стадий AMD направлены на ингибирование васкуляризации, индуцированной фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), путем интравитреальных инъекций, например, Ранибизумаба (фрагмента моноклонального антитела) и Бевацизумаба (моноклонального антитела). В животных моделях увеита, воспаления глаз из-за иммунного ответа на глазные антигены, блокирующие антитела к фактору В альтернативного пути (Manickam et al. J. Biol Chem 2011, 286:8472-8480), а также к фактору C5 (Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159:303-314), улучшали состояние заболевания.

При трансплантации солидных органов существуют два основных механистических пути, ведущих к отказу или задержке/нарушению функций трансплантата: 1) иммунологические барьеры между донором и реципиентом по группе крови (АВО) и классам MCH, а также степень предварительной сенсибилизации реципиента к донору, то есть появление донор-специфических антител (DSA), ведущих к острому антитело-опосредованному отторжению (AMR); и 2) состояние трансплантируемого органа, а также период времени, в течение которого он хранился без постоянного кровотока, т.е. степень ишемического повреждения или ишемического-реперфузионного повреждения (IRI) трансплантата. В обоих случаях AMR и IRI, система комплемента атакует орган, распознаваемый как чужеродный, и, следовательно, объект, который должен быть отторгнут. При AMR уже существующие антидонорные антитела быстро образуют иммунные комплексы на внешней поверхности органа, приводящие к узнаванию его C1q и последующей активации системы комплемента по классическому пути. Этот процесс, известный как сверхострое отторжение, происходит в течение нескольких минут, и поэтому современная трансплантация несовместимых органов включает в себя ликвидацию DSA перед трансплантацией с помощью плазмафереза или обмена плазмы и внутривенного введения IgG в сочетании с различными иммунодепрессантами. Новые методики также включают истощение В-клеток с использованием анти-CD20 антитела ритуксимаба (Genberg et al. Transplant 2008, 85:1745-1754). Эти протоколы значительно снижают возникновение сверхострого отторжения, но все еще у сильно сенсибилизированных больных заболеваемость острым AMR (в течение недель-месяцев) достигает 40% (Burns et al. Am J Transplant 2008, 6:2684-2694; Stegall et al. Am J Transplant 2011, ранняя публикация он-лайн). В отношении IRI, в качестве основной причины повреждения тканей большинство данных указывает на терминальный путь с последующим образованием MAC и лизиса. Таким образом, блокирование полипептида С5 будет защищать от отторжения, независимо от его причины, которой является AMR, IRI или, как это часто бывает, комбинация обоих AMR и IRI. Как и ожидалось, сильно перфузированные органы, такие как печень (Qin et al. Cell Mol Immunol 2006, 3:333-340), сердце и почки, особенно подвержены повреждениям, опосредованным системой комплемента.

Центральная позиция белка C5, соединяющего проксимальную и терминальную части каскада системы комплемента, делает его привлекательной мишенью для фармацевтического вмешательства. Поскольку C5 является общим для всех путей активации комплемента, блокирование С5 остановит развитие каскада независимо от стимула и тем самым предупредит патологические свойства терминальной активации комплемента, оставляя нетронутыми иммунозащитные и иммунорегуляторные функции проксимального участка каскада комплемента.

Известны антитела, направленные на белок С5 системы комплемента человека, например, указанные в патентах WO 95/29697, WO 02/30985 и WO 2004/007553. Экулизумаб (Солирис™) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против белка C5, которое предупреждает расщепление C5 на С5а и C5b. Было показано, что экулизумаб эффективен при лечении PNH, редкого и иногда угрожающего жизни заболевания крови, характеризующегося внутрисосудистой гемолитической анемией, тромбофилией и нарушениями работы костного мозга, и этот препарат был одобрен для лечения этого заболевания. Экулизумаб также недавно был одобрен FDA для лечения атипичного гемолитического синдрома (aHUS), редкого, но опасного для жизни заболевания, вызванного потерей контроля альтернативного пути комплемента, приводящей к избыточной его активации, проявляющейся в виде тромботической микроангиопатии (TMA), которая приводит к постоянному риску повреждения жизненно важных органов, таких как почки, сердце и мозг. При aHUS трансплантация поврежденного органа только временно помогает пациенту, так как печень продолжает производить мутантную форму белка-регулятора (наиболее часто, фактора Н системы комплемента или других белков альтернативного пути). Родственным заболеванием с временной острой патофизиологией является HUS, вызванный инфекцией положительной по Шига-токсину E. coli (STEC-HUS), и уже есть многообещающие клинические данные, свидетельствующие об эффективности также и для этого болезненного состояния (Lapeyraque et al. N Engl J Med 2011, 364:2561-2563). Наконец, было доказано, что блокирующее С5 антитело экулизумаб эффективно для предупреждения AMR у реципиентов почек, являющихся высоко несовместимыми (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11:2405-2413).

Помимо полноразмерных антител, в литературе описаны одноцепочечные фрагменты вариабельных областей (ScFv), миниантитела и аптамеры, направленные на C5. Эти ингибиторы C5 могут связываться с различными участками (эпитопами) на молекуле C5 и могут иметь различные способы действия. Например, тогда как Экулизумаб взаимодействует с C5 на некотором удалении от сайта расщепления конвертазы, миниантитело Мубодина® взаимодействует с участком расщепления С5. Было высказано предположение, что ингибитор комплемента из мягкого клеща Ornithodoros moubata, ингибирующий белок C5 (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174:2084-2091), связывается с удаленным концом супердомена CUB-C5d-MG8, который находится рядом с участком расщепления конвертазой (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9(7):753-760). В отличие от указанных выше трех белков, ингибирующих расщепление C5, моноклональное антитело TNX-558 связывается с эпитопом С5а, присутствующим как на исходном C5, так и на высвобождаемом C5a, и не ингибирует расщепление C5. (Fung и et al. Clin Exp Immunol 2003, 133(2):160-169).

Антитела с их сложной мультидоменной структурой, 12 внутрицепочечными и 4 межцепочечными дисульфидными мостиками и сложной схемой гликозилирования, имеют ряд собственных недостатков, связанных со своей молекулярной структурой. Например, размер Экулизумаба составляет примерно 148 кДа. Концентрация C5 в крови человека составляет около 400 нМ, и для полного блокирования активности C5 концентрация ингибитора по меньшей мере должна быть равна ей или превышать ее. Таким образом, стандартной пожизненной схемой лечения PNH с использованием Солириса™ является внутривенная инфузия 900 мг белка каждую вторую неделю, которую в основном проводят в клинике, что приводит к большим неудобствам для пациента и затратам для общества. Также было опубликовано, что Солирис™ вызывает боль в груди, лихорадку, озноб, зуд, крапивницу, гиперемию кожи лица, сыпь, головокружение, проблемы с дыханием или отек лица, языка и горла, хотя причины этих побочных эффектов не ясны. Кроме того, Экулизумаб не активен ни в одной из протестированных животных моделей, в том числе на приматах, что делает исследования действующего препарата на животных невозможными. Как указано выше, существующие методы лечения AMD также зависят от антител и, таким образом, существует сильная потребность в процедурах, основанных на инъекциях или других способах введения молекул с низкой молекулярной массой.

Кроме того, получение антител сложнее и дороже, чем получение небольших белков (Kenanova et al. Expert Opin Drug Deliv 2006, 3(1):53-70). Другие недостатки, обычно связанные с антителами, перечислены в статье Reilly et al. (Clin Pharmacokinet 1995, 28:126-142), например, перекрестная реактивность и неспецифическое связывание в нормальных тканях, ускорение метаболизма вводимых антител и образование у человека антител к антителам человека (НАМА), вызывающее снижение или потерю терапевтического эффекта.

Таким образом, дальнейший поиск агентов с сопоставимой блокирующей С5 активностью по-прежнему вызывает значительный интерес в этой области. В частности, существует постоянная потребность в молекулах, предупреждающих терминальный каскад комплемента, а также образование провоспалительной молекулы С5а. Большой интерес вызывает также предоставление вариантов применения таких молекул при лечении заболеваний.

Описание

Задачей настоящего изобретения является предоставление новых агентов, связывающих белок C5. Кроме этого, задачей изобретения является предоставление новых агентов, связывающих белок C5, для применения в терапии.

В одном аспекте изобретение относится к С5-связывающему полипептиду, содержащему С5-связывающий мотив, BM, причем данный мотив состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из:

в которой, независимо друг от друга,

X₂ выбран из Н, Q, S, T и V;

X₃ выбран из I, L, M и V;

X₄ выбран из A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T и Y;

X₆ выбран из N и W;

X₇ выбран из A, D, E, H, N, Q, R, S и T;

X₁₁ выбран из A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T и Y;

X₁₆ выбран из N и T;

X₁₇ выбран из I, L и V;

X₁₈ выбран из A, D, E, H, K, N, Q, R, S и T;

X₂₁ выбран из I, L и V;

X₂₅ выбран из D, E, G, H, N, S и T;

X₂₆ выбран из K и S;

X₂₈ выбран из A, D, E, H, N, Q, S, T и Y;

и

ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 86%-ную идентичность с последовательностью по п. i), причем полипептид связывается с C5.

Определенный выше класс родственных по последовательности полипептидов, имеющих аффинность связывания к C5, происходит от общей родительской полипептидной последовательности. Более конкретно, определение класса основано на анализе большого числа случайных полипептидных вариантов родительского полипептида, которые были выбраны в экспериментах по отбору по их взаимодействию с С5. Идентифицированный С5-связывающий мотив, или ВМ, соответствует целевой области связывания в родительском полипептидном каркасе, причем область составляют две альфа-спирали внутри белкового домена, представляющего пучок из трех спиралей. В родительском полипептидном каркасе варьируемые аминокислотные остатки двух спиралей BM составляют связывающую поверхность для взаимодействия с константной частью антител, Fc. Путем случайного изменения остатков связывающей поверхности и последующего отбора вариантов, способность связывающей поверхности взаимодействовать с Fc была заменена способностью взаимодействовать с C5.

Как пояснено в нижеследующих примерах, отбор связывающих С5 полипептидных вариантов можно провести, например, с помощью фагового дисплея для отбора исходных вариантов белкового каркаса, необязательно, с последующим созреванием аффинности и клеточным дисплеем для отбора аффинно зрелых вариантов, связывающих C5. Однако следует понимать, что для отбора C5-связывающих полипептидов может использоваться любая система отбора, будь то фаговая, бактериальная, клеточная или какая-либо другая система отбора.

Термины «связывание с C5» и «аффинность связывания с С5», используемые в данном описании, относятся к свойству полипептида, которое может быть проверено, например, путем использования методики поверхностного плазмонного резонанса, например, в приборе Biacore (GE Healthcare). Аффинность связывания с C5 может, например, быть проверена в эксперименте, в котором С5 иммобилизован на чипе датчика инструмента Biacore, а образец, содержащий полипептид, подлежащий проверке, пропускают через чип. В альтернативном варианте проверяемый полипептид иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, а образец, содержащий С5 или его фрагмент, пропускают через чип. Специалист в данной области может затем интерпретировать результаты, полученные в таких экспериментах, чтобы установить по меньшей мере качественное измерение связывания полипептида с C5. Если желательно количественное измерение, например, для определения кажущейся равновесной константы диссоциации K_D для взаимодействия, также могут использоваться способы поверхностного плазмонного резонанса. Величина связывания, например, может быть определена на приборе Biacore 2000 (GE Healthcare). C5 иммобилизуют на чипе измерительного датчика, а образцы полипептида, аффинность которого необходимо определить, получают путем серийного разведения и вводят в поток, проходящий через чип. Величины K_D можно рассчитать по результатам с использованием, например, Ленгмюровской модели связывания 1:1 в программном обеспечении BIAevaluation, предоставленном изготовителем прибора. C5 или его фрагмент, используемый в определении K_D, может, например, содержать аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:760.

В одном варианте С5-связывающего полипептида по настоящему изобретению С5-связывающий полипептид связывается с C5 таким образом, что величина K_D для взаимодействия составляет не более 1×10^-6 М, например, не более 1×10^-7 М, 1×10^-8 M или 1×10^-9 М.

С5-связывающий полипептид по настоящему изобретению может использоваться в качестве альтернативы обычным антителам или низкомолекулярным веществам для различных вариантов применения в медицине, ветеринарии и диагностике. В частности, С5-связывающий полипептид может быть полезен в любом способе, требующем от реагента аффинности к C5. Соответственно, С5-связывающий полипептид может использоваться в качестве детектирующего реагента, захватывающего реагента, разделяющего реагента, диагностического агента или терапевтического агента в таких способах.

Как будет понятно специалистам в данной области, функция любого полипептида, например, сила связывания с C5 полипептидов, определенных в настоящем документе, зависит от третичной структуры полипептида. Таким образом, можно осуществить незначительные изменения в аминокислотной последовательности полипептида без значительного влияния на их третичную структуру и функцию. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения полипептид включает модифицированные варианты BM по п. i), которые представляют собой такие варианты, что полученная последовательность по меньшей мере на 89% идентична последовательности, принадлежащей классу по п. i), например, по меньшей мере, на 93% идентична, например, по меньшей мере на 96% идентична последовательности, принадлежащей к классу по п. i). Например, возможно, что аминокислотный остаток, принадлежащий к определенной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобной, гидрофильной, полярной и т.д.), может быть заменен на другой аминокислотный остаток из той же функциональной группы.

В другом варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, аминокислотная последовательность выбрана из i), определенного выше, и iii) аминокислотной последовательности, которая в 13 вариабельных позициях, обозначенных X_n, где n составляет 2-4, 6-7, 11, 16-18, 21, 25-26 и 28, имеет по меньшей мере 84%-ную идентичность с последовательностью по п. i), и которая в положениях 1, 5, 8-10, 12-15, 19-20, 22-24, 27 и 29 имеет по меньшей мере 87%-ную идентичность с последовательностью по п. i).

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₂ выбран из H, T и V. В другом варианте X₂ выбран из Т и V. В еще одном варианте осуществления X₂ является V.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₃ выбран из I, L и V. В другом варианте осуществления X₃ выбран из I и L. В еще одном варианте осуществления, X₃ является I. В альтернативном варианте осуществления, X₃ является L.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₄ выбран из A, D, E, K, L, Q и R. В другом варианте X₄ выбран из A, D, E, K и R. В еще одном родственном варианте X₄ выбран из D и E.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₆ представляет собой W.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₇ выбран из A, D, N и Т. В другом варианте осуществления X₇ выбран из D и N. В еще одном родственном варианте осуществления X₇ является D. В альтернативном варианте осуществления X₇ является N.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₁₁ выбран из A, H, K, Q, R и S. В другом варианте X₁₁ выбран из A, H, K и R. В еще одном родственном варианте осуществления X₁₁ выбран из A, K и R. В еще одном родственном варианте осуществления X₁₁ выбран из K и R.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₁₆ является T.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₁₇ выбран из I и L. В другом варианте X₁₇ является I. В альтернативном варианте X₁₇ является L.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₁₈ выбран из A, D, E, N, Q, S и T. В другом варианте X₁₈ выбран из A, D, E, Q и S. В еще одном родственном варианте X₁₈ выбран из D, E и Q. В еще одном родственном варианте X₁₈ выбран из D и E. В еще одном родственном варианте X₁₈ является D. В альтернативном варианте X₁₈ является E.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₂₁ выбран из I и L. В другом варианте X₂₁ является I. В альтернативном варианте X₂₁ является L.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₂₅ выбран из E, H, N и T. В другом варианте X₂₅ выбран из E и N. В еще одном родственном варианте X₂₅ является N.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₂₆ является K.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₂₈ выбран из A, D, E, H, N, Q и S. В другом варианте вышеописанного полипептида, X₂₈ выбран из A, D, E и S. В еще одном родственном варианте X₂₈ выбран из A, D и Е. В еще одном родственном варианте X₂₈ выбран из D и E. В еще одном родственном варианте X₂₈ является D.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₃X₄ выбран из LE и LD.

В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X₁₇X₁₈ выбран из IE и LD.

В вышеописанных вариантах осуществления первого аспекта изобретения, идентифицированы примеры С5-связывающих полипептидов, входящих в класс полипептидов. Следует понимать, что вышеуказанные отдельные варианты осуществления могут быть объединены всеми мыслимыми способами и при этом все еще входить в объем настоящего изобретения. Такие комбинации отдельных вариантов осуществления определяют ограниченную, в одном или нескольких положениях X₂-X₂₈, аминокислотную последовательность, по сравнению с определением аминокислотной последовательности в i).

Вышеуказанные варианты осуществления С5-связывающего полипептида, например, могут быть объединены таким образом, что аминокислотная последовательность i) соответствует по меньшей мере четырем из следующих восьми условий I-VIII:

I. X₂ является V;

II. X₃ выбран из I и L;

III. X₆ является W;

IV. X₇ выбран из D и N;

V. X₁₇ выбран из I и L;

VI. X₂₁ является L;

VII. X₂₅ является N;

VIII. X₂₈ является D.

В некоторых примерах С5-связывающего полипептида по первому аспекту изобретения, аминокислотная последовательность i) соответствует по меньшей мере пяти из восьми условий I-VIII. В частности, аминокислотная последовательность i) может соответствовать по меньшей мере шести из восьми условий I-VIII, например, по меньшей мере семи из восьми условий I-VIII, например, всем восьми условиям I-VIII.

Как описано в следующих примерах, отбор С5-связывающих вариантов привел к идентификации индивидуальных последовательностей с С5-связывающим мотивом (BM). Эти последовательности представляют собой индивидуальные варианты С5-связывающих полипептидов по этому аспекту. Последовательности индивидуальных C5-связывающих мотивов представлены на фигуре 1 и в качестве SEQ ID NO:1-248. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта, BM-последовательность i) выбрана из любой одной из SEQ ID NO:1-12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23-24, SEQ ID NO:26-28, SEQ ID NO:32-35, SEQ ID NO:38-39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56-57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:78-79, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:215 и SEQ ID NO:243. Более конкретно, BM-последовательность i) выбрана из любой одной из SEQ ID NO:1-12, например, из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. В частности, BM-последовательность i) может быть выбрана из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:4.

В конкретных вариантах осуществления С5-связывающий мотив (ВМ) является частью белкового домена, представляющего пучок из трех спиралей. Например, BM может по существу составлять две альфа-спирали с соединительной петлей, внутри указанного трехспирального пучка белкового домена.

Белковый домен, представляющий собой трехспиральный пучок, в другом варианте осуществления изобретения, выбран из доменов бактериальных рецепторных белков. Неограничивающими примерами таких доменов являются пять различных трехспиральных доменов белка A из Staphylococcus aureus, такие как домен B и его производные. В некоторых вариантах осуществления изобретения трехспиральный пучок белкового домена представляет собой вариант белка Z, который является производным от указанного домена B стафилококкового белка А.

В вариантах осуществления, в которых С5-связывающий полипептид по изобретению образует часть белкового домена в виде трехспирального пучка, С5-связывающий полипептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из:

в которой

[BM] является С5-связывающим мотивом, определенным выше;

X_а выбран из A и S;

X_b выбран из N и E;

X_с выбран из A, S и C;

X_d выбран из A и S;

и

ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 79%-ную идентичность с любой одной из последовательностей, определенных выше. Указанная аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 81%, например, по меньшей мере 83%, например, по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 87%, например, по меньшей мере 89%, например, по меньшей мере 91%, например, по меньшей мере 93%, например, по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 97% идентичности с любой одной из последовательностей, определенных выше.

В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_а является А. В альтернативном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_а является S.

В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_b является N. В альтернативном варианте X_b является E.

В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_с является A. В альтернативном варианте X_с является S. В еще одном альтернативном варианте X_с является C.

В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_d является А. В альтернативном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_d является S.

В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_а является A; X_b является N; X_с является A; и Х_d является А.

В дополнительном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_а является A; X_b является N; X_с является C; и Х_d является А.

В дополнительном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_а является S; X_b является E; X_с является S; и Х_d является S.

В дополнительном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X_а является S; X_b является E; X_с является C; и Х_d является S.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность С5-связывающего полипептида, определенного выше, выбрана из SEQ ID NO:249-496, в частности из SEQ ID NO:249-260, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:271-272, SEQ ID NO:274-276, SEQ ID NO:280-283, SEQ ID NO:286-287, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:304-305, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:326-327, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:451, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:463 и SEQ ID NO:491, например, из SEQ ID NO:249-260. В дополнительном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252 и SEQ ID NO:253, например, из SEQ ID NO:249 и SEQ ID NO:252.

Таким образом, в дополнительном варианте осуществления изобретение относится к С5-связывающему полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:

в которой [BM] является С5-связывающим мотивом, определенным выше и

X_с выбран из S и C; и

ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 81%-ную идентичность с любой одной из последовательностей по п. i) выше.

В альтернативном варианте изобретение относится к С5-связывающему полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:

в которой [BM] является С5-связывающим мотивом, определенным выше, и

X_с выбран из A и С; и

ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 81%-ную идентичность с любой одной из последовательностей по п. i) выше.

Как обсуждалось выше, полипептиды, содержащие незначительные изменения в указанных выше аминокислотных последовательностях, которые значительно не влияют на их третичную структуру и функции, также входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, C5-связывающие полипептиды, определенные выше, могут иметь, например, последовательность, которая по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности по п. i).

В некоторых вариантах осуществления изобретения и, как раскрыто в приведенных ниже примерах, С5-связывающий мотив может образовывать часть 58- или 60-аминокислотного полипептида. Такой полипептид может, например, содержать последовательность, выбранную из любой одной из SEQ ID NO:497-757, в частности, последовательность, выбранную из любой одной из SEQ ID NO:497-508, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:519-520, SEQ ID NO:522-524, SEQ ID NO:528-531, SEQ ID NO:534-535, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:552-553, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:602, SEQ ID NO:606, SEQ ID NO:615, SEQ ID NO:621, SEQ ID NO:637, SEQ ID NO:647, SEQ ID NO:657, SEQ ID NO:662, SEQ ID NO:683, SEQ ID NO:693, SEQ ID NO:699, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:711, SEQ ID NO:739 и SEQ ID NO:745-757, например, последовательность, выбранную из SEQ ID NO:497-508 и SEQ ID NO:745-757. В другом варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:746, SEQ ID NO:747, SEQ ID NO:748, SEQ ID NO:750 и SEQ ID NO:753, например, из любой одной из SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:748 и SEQ ID NO:753.

Связывание молекулы с С5 не обязательно ингибирует расщепление C5. Ингибирование зависит от сайта связывания, и так как еще не совсем понятно, какие эффекты дает взаимодействие с конкретными областями C5, некоторые C5-связывающие молекулы могут взаимодействовать с С5, не препятствуя его расщеплению на C5a и C5b. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, С5-связывающий полипептид при его введении млекопитающему ингибирует расщепление C5. С5-связывающий полипептид по изобретению может более специфически ингибировать расщепление C5 человека при введении человеку.

Структура C5 несколько отличается между видами, и поэтому вещество, связывающее C5 из одного вида, может быть неактивным в случае другого биологического вида. Например, гуманизированное антитело Экулизумаб связывается с доменом C5, часто называемым MG7. Эта область сильно варьирует между видами, и поэтому Экулизумаб связывается только с C5 человека. С5-связывающий полипептид по настоящему изобретению, однак