Способ разделения молекул днк

Способ разделения молекул днк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии, а именно, к получению очищенных из исходного раствора смеси целевых и нецелевых двухцепочечных молекул ДНК препаратов целевых молекул ДНК. В частности, настоящее изобретение относится к способам очистки фрагментов двухцепочечной рекомбинантной ДНК, получаемых в результате расщепления плазмидной ДНК, от векторных последовательностей.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Получение очищенных из исходного раствора смеси целевых и нецелевых двухцепочечных молекул ДНК препаратов целевых молекул ДНК является рутинной процедурой в области молекулярной биологии. Одной из областей, где часто требуется разделение и очистка целевого фрагмента ДНК, является+ генная инженерия, например, при создании рекомбинантных ДНК с заданными свойствами.

Плазмидные векторы рутинно используются в генной инженерии как инструмент для манипуляций с целевыми фрагментами ДНК, обеспечивая их пропагацию в клетках E.coli. Однако векторная часть плазмиды в данном случае выполняет служебную функцию, и для манипуляций с целевыми фрагментами ДНК и их использования в некоторых приложениях требуется отделение векторных последовательностей от целевого фрагмента ДНК. Технически это реализуется с помощью ферментов (эндонуклеаз рестрикции), которые позволяют физически разделить кольцевую молекулу плазмиды на линейные фрагменты, в том числе физически отделить целевой фрагмент ДНК от вектора, с последующим разделением продуктов расщепления и очисткой целевого фрагмента ДНК от фрагмента, содержащего последовательность вектора. Очистка целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК используется при проведении генно-инженерных работ, а также в области трансгенеза животных. В последнем случае при получения трансгенных животных для инъекции эмбрионов используют линейные фрагменты ДНК, содержащие трансген, свободный от векторных последовательностей, присутствие которых может негативно влиять на экспрессию трансгена (Kjer-Nielsen et al., 1992).

Концептуально разделение гетерогенной смеси молекул ДНК на гомогенные фракции и селективный отбор целевых молекул ДНК из смеси осуществляться на основании различий в свойствах молекул ДНК в смеси. Эти свойства могут быть как эндогенными, так и привнесенными.

При манипуляции с молекулами ДНК in vitro, в частности, при генно-инженерных манипуляциях, селекцию целевых молекул ДНК преимущественно осуществляют на основании различий в их молекулярной массе, что эквивалентно их длине в нуклеотидах. Разделение молекул ДНК на основании их длин может осуществляться различными способами, такими как гель-фильтрационная хроматография, центрифугирование в градиенте плотности, гель-электрофорез. Разделение первыми двумя упомянутыми способами основано на различии молекулярных масс молекул ДНК различной длины, в то время как последний способ также использует различия в суммарном заряде молекул, который пропорционален длине молекулы ДНК. Общим для методов разделения молекул ДНК, основанных на различия в длинах, является отсутствие при разделении селективности в отношении нуклеотидных последовательностей разделяемых молекул ДНК, то есть две молекулы ДНК с различными последовательностями, но имеющие одинаковую длину в нуклеотидах, такими методами разделены быть не могут, а при уменьшении различий в длинах разделяемых фрагментов ДНК качество разделения будет снижаться, особенно в случае использования методов, в которых разделение происходит на основании только молекулярных масс, в то время как гель-электрофорез, в котором на процесс разделения дополнительно оказывает влияние заряд молекул, позволяет более качественно разделять молекулы ДНК различной длины, чем гель-фильтрационная хроматография или центрифугирование в градиенте плотности.

В области молекулярной биологии часто используются методы разделения молекул ДНК, основанные на наличии/отсутствии уникальных признаков. Данные методы позволяют сепарировать молекулы ДНК вне зависимости от их длины, однако требуют предварительной модификации целевых молекул ДНК, что в последующем после смешивания в рамках проведения эксперимента позволяет сепарировать их от немодифицированных молекул ДНК. Примером часто используемой для этих целей модификаций является биотин, ковалентное присоединение которого к молекулам ДНК позволяет селективно сепарировать их от немодифицированных молекул с использованием иммобилизованного на твердом носителе стрептавидина, например, после проведения гибридизации при создании библиотек вычитания (Коробко и др., 1997). Ограничением для этого способа сепарации молекул ДНК является необходимость предварительной модификации очищенных целевых молекул ДНК in vitro.

Перечисленные выше способы разделения молекул ДНК также различаются по необходимым процедурам по очистке целевых молекул ДНК после проведения селекции.

При разделении молекул с помощью гель-фильтрационной хроматографии целевой фрагмент находится в хроматографическом буфере и, в зависимости от его состава, может не требовать дальнейшей очистки или требовать минимальной очистки путем переосаждения ДНК и растворения в буфере необходимого состава для получения очищенного препарата ДНК с минимальным присутствием нежелательных примесей.

При разделении молекул с помощью центрифугирования в градиенте плотности, фракция, содержащая целевые молекулы ДНК, требует очистки от веществ, использованных для создания градиента плотности (например, часто используемого для создания градиента плотности хлорида цезия). Присутствие ионов цезия негативно влияет на многие дальнейшие аппликации препарата ДНК, что требует тщательной очистки от хлорида цезия, осуществляемого, например, с помощью повторных диализов.

При разделении молекул ДНК с помощью гель-электрофореза, который является рутинным и наиболее часто используемым для этих целей методом, целевая фракция молекул ДНК находится в физически ограниченном объеме геля, из которого ДНК должна быть экстрагирована, что может осуществляться различными способами. Одним из способов экстракции ДНК из геля является пассивная элюция из фрагмента геля. Данный способ малоэффективен и характеризуется существенными потерями материала, а также требует последующей очистки от следовых количеств компонентов геля, присутствие которых может негативно влиять на дальнейшее целевое использование изолированной ДНК. Другой способ экстракции ДНК из геля, электроэлюция, состоит в продолжении процесса гель-электрофореза после разделения смеси молекул ДНК в геле, в результате которого целевая фракция молекул ДНК сорбируется на положительно заряженный бумажный носитель (бумага DEAE), врезанный в гель перед областью, содержащей целевые молекулы ДНК; далее иммобилизованная на бумаге DEAE ДНК элюируется в раствор. Альтернативно, молекулы ДНК могут быть переведены в раствор буфера для гель-электрофореза из вырезанного фрагмента геля, помещенного в специальную камеру, объем которой ограничен диализной пленкой, препятствующей выходу молекул ДНК из камеры в ходе электрофореза. В обоих случаях, помимо трудоемкости, полученные препараты молекул целевой ДНК в растворе требуют дальнейшей очистки от примесей компонентов геля, присутствие которых может негативно влиять на дальнейшее использование изолированной целевой ДНК.

Наиболее часто и рутинно используемым способом очистки молекул ДНК сегодня является экстракция ДНК из геля с использованием его химического разрушения, с последующей очисткой ДНК из полученного раствора на аффинном носителе, специфически сорбирующем молекулы ДНК. Данный способ позволяет получать препараты целевых молекул ДНК достаточной для большинства аппликаций чистоты, однако при существенной длине целевых молекул ДНК выход очищенного фрагмента после процесса очистки падает, и могут происходить физические разрывы длинных молекул ДНК в результате механического воздействия во время нахождения молекулы ДНК в связанном состоянии на сорбенте.

Существенными преимуществами перед методами, основанными на сепарации молекул ДНК на основании их размера, обладают методы, использующие модифицированные молекулы ДНК для их отделения от немодифицированных молекул, которые обладают высокой селективностью, не зависящей от длин разделяемых молекул ДНК. Эти методы позволяют избежать присутствия нежелательных примесей, таких как компоненты геля, а также - в случае негативной селекции (то есть истощения из раствора модифицированных молекул ДНК и получения раствора целевой немодифицированной ДНК) исключают риск повреждения целевой ДНК в результате механического воздействия. Однако данные методы имеют ограниченную область применения, поскольку требуют предварительной модификации пула молекул ДНК in vitro, то есть априори сначала требуют выделения молекул ДНК для их модификации.

Таким образом, оптимальным методом селекции целевых фрагментов ДНК стал бы метод, позволяющий разделять молекулы ДНК по принципу наличия у них уникальных характеристик, который бы не требовал предварительных манипуляций in vitro для их внесения в молекулы ДНК. Такими характеристиками могут являться специфические последовательности ДНК, присутствие или отсутствие которых потенциально может быть использовано как основа для разделения гетерогенной смеси молекул ДНК.

Действительно, на сегодняшний день известно несколько подходов к практической реализации разделения или очистки молекул ДНК, основанных на присутствии в молекулах ДНК специфических нуклеотидных последовательностей. К ним относятся методы, основанные на образовании последовательность-специфичных триплексных структур с иммобилизованным на твердом носителе олигонуклеотиде (Ito et al., 1992), или основанные на аффинном взаимодействии белков со специфическими последовательностями в целевой ДНК - Lac-penpeccopa (или его ДНК-связывающего фрагмента) с включенной во фрагмент ДНК нуклеотидной последовательностью оператора LacO (Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), домена цинковых пальцев фактора транскрипции со специфической последовательностью для его узнавания (Woodgate et al., 2002) или металлорегуляторного бактериального белка MerR с его сайтом узнавания, включенным в молекулы ДНК (Kostal et al., 2004). При использовании белков для селекции молекул ДНК за счет связывания специфической последовательности ДНК, белок, как и олигонуклеотид, может быть иммобилизован на твердом носителе, что позволяет отбирать связавшиеся молекулы ДНК из раствора. В частности, для иммобилизации белка на твердом носителе возможно использование носителя с ковалентно связанным глутатионом, в случае, когда сам белок представляет собой химеру специфически взаимодействующего с ДНК белка (или его части, достаточной для такого взаимодействия) с глутатион-S-трансферазой, которая, за счет взаимодействия с глутатионом, обеспечивает иммобилизацию на твердом носителе (Woodgate et al., 2002).

Метод очистки, основанный на образовании триплексных структур, использует способность гомопиримидиновых нуклеотидов формировать такие структуры с гомопуриновыми последовательностями двухцепочечной ДНК (Ito et al., 1992). Очевидно, что присутствие гомопуриновых последовательностей часто может не являться специфическим признаком одного пула молекул ДНК, который необходимо сепарировать от другого, из-за случайного присутствия сходных по составу последовательностей в молекулах ДНК другого пула, вероятность чего возрастает с увеличением длины молекул ДНК. Кроме того, данный метод характеризуется медленной кинетикой образования комплексов, что непосредственно влияет на его эфективность.

Использование Lac-репрессора для аффинной очистки молекул ДНК, содержащих узнаваемую им нуклеотидную последовательность LacO-оператора, было предложено как способ очистки свободной от вектора ДНК - суперспирализованных мини-кольцевых молекул с целью их применения в области генной терапии (Mayrhofer et al., 2008). Однако для целей сепарации линейных или кольцевых релаксированных молекул ДНК данный подход не является оптимальным, поскольку аффинность Lac-penpeccopa к ZacO-сайтам ослабляется при нахождении ДНК в релаксированном, а не сверхскрученном состоянии (Whitson et al., 1987а; Whitson et al., 1987b), что будет негативно сказываться на эффективности аффинной сорбции.

Два других упомянутых выше известных подхода, в которых используются домен цинковых пальцев и белок MerR, также основаны на принципе селекции молекул ДНК при наличии в их составе специфических нуклеотидных последовательностей, узнаваемых этими транскрипционными факторами. Оба метода были разработаны для очистки интактных молекул плазмидной ДНК из клеток E.coli по принципу положительной селекции, когда специфические последовательности включены в состав последовательности вектора.

Следует отметить, что все вышеперечисленные методы основаны на принципе положительной селекции и требуют присутствия в целевых молекулах ДНК специфических нуклеотидных последовательностей. В то же время, включение таких последовательностей в целевые молекулы ДНК для возможности их селекции при очистке может потенциально оказывать влияние на их целевые функции, и присутствие таких дополнительных последовательностей в целом является нежелательным.

Как изложено выше, для основанной на принципе присутствия специфической нуклеотидной последовательности очистке молекул ДНК в качестве лиганда возможно применение белков, способных узнавать такие последовательности. В частности, приведенные примеры включают использование белков-регуляторов транскрипции (транскрипционных факторов), которые специфически узнают определенные последовательности ДНК, вводимые в целевые молекулы ДНК. Помимо факторов транскрипции, к белкам, способным узнавать определенные последовательности ДНК и связываться с ними, относятся эндонуклеазы рестрикции и сайт-специфические рекомбиназы. Однако, в отличие от факторов транскрипции, которые не модифицируют молекулу ДНК при связывании, взаимодействие эндонуклеаз рестрикции и сайт-специфических рекомбиназ с ДНК приводит к расщеплению ДНК в месте связывания или рекомбинационному событию, соответственно, ковалентно изменяя структуру молекулы ДНК.

Cre является одной из известных сайт-специфических рекомбиназ, кодируемой геномом бактериофага Р1. Сайт рекомбинации для рекомбиназы Cre, LoxP, представляет собой последовательность из двух инвертированных повторов длинною 13 пар нуклеотидов (п.н.), разделенных спейсером в 8 п. н. (Sadowski, 1986). Cre-рекомбиназа связывается с ZoxP-сайтом, после чего за счет белок-белковых взаимодействий формируется структура, называемая синапсом, состоящая из двух сближенных LoxP-сайтов со связанными с ними молекулами Cre, после чего происходит расщепление цепей ДНК и обмен одной или двумя цепями с последующей диссоциацией молекул рекомбиназы с ДНК (Ghosh et al., 2007; Ringrose et at., 1998). Существенным отличием рекомбиназы Cre от ряда других рекомбиназ является то, что ее эффективное связывание с сайтами узнавания не зависит от наличия сверхспирализации в молекуле ДНК (Sadowski, 1986), что позволяет эффективно взаимодействовать с ZoxP-сайтом не только в замкнутых кольцевых сверхспирализованных молекулах ДНК, но и в релаксированных кольцевых и линейных молекулах ДНК, в которых отсутствует сверхспирализация.

Раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к новому способу разделения молекул ДНК, позволяющему проводить очистку целевых молекул ДНК от нецелевых молекул ДНК из их смеси в растворе. В частности, настоящее изобретение позволяет осуществлять очистку целевых двухцепочечных молекул ДНК от иных молекул двухцепочечной ДНК, как кольцевых, так и линейных, непосредственно в растворе, что исключает необходимость проведения дополнительных манипуляций, таких как рутинно используемое для этих целей разделение продуктов расщепления с использованием гель-электрофореза.

В настоящем изобретении, в отличие от иных способов очистки целевых молекул ДНК, селекция молекул ДНК реализуется не на основании различия в их длинах. Отсутствие необходимости селекции целевых молекул ДНК от нецелевых на основании различий в их размерах, в частности, позволяет исключить невозможность (при использовании, например, гель-электрофореза) очистки целевого фрагмента при его длине, равной или близкой к длине нецелевого фрагмента. При необходимости очистки фрагмента-вставки плазмидного вектора после расщепления плазмиды в случае, когда длина вектора мала по сравнению с длинной целевого фрагмента, предложенный способ также позволяет исключить контаминацию целевого фрагмента линейными продуктами неполного расщепления плазмидной ДНК, содержащей последовательности целевого фрагмента и вектора, из-за невозможности их качественного разделения в результате гель-электрофореза или иными методами, основанными на различиях в длинах молекул ДНК, что обусловлено малыми различиями в их длинах. Ситуации, в которых затруднительно или невозможно получение неконтаминированного иными продуктами расщепления целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК с помощью разделения на основании различий в длинах молекул ДНК, проиллюстрированы на фиг. 1.

В настоящем изобретении для разделения молекул ДНК используется принцип негативной селекции. Это позволяет избежать необходимости иммобилизации целевого фрагмента ДНК на твердом носителе в процессе очистки, на чем основаны многие традиционные методы разделения и очистки молекул ДНК и что может приводить к механическим повреждениям длинных молекул ДНК (разрывам). Кроме того, исключение процесса электрофореза в геле, широко используемого при разделении молекул ДНК, исключает риск контаминации целевого фрагмента ДНК компонентами геля, что может негативно влиять на результаты его дальнейшего использования.

В настоящем изобретении, как и в известных из уровня техники аналогах (Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), (Woodgate et al., 2002), (Kostal et al., 2004), (Ito et al., 1992), разделение молекул ДНК осуществляется с использованием агента, способного взаимодействовать и связывать молекулы ДНК, имеющие в своем составе специфические нуклеотидные последовательности. Благодаря способности агента быть иммобилизованным на твердой фазе или быть переведенным в твердую фазу, становится возможным иммобилизация таких молекулы ДНК, связанных с агентом, из жидкой фазы на твердую фазу, тем самым осуществляя разделение молекул ДНК, имеющих в своем составе специфическую нуклеотидную последовательность, и не имеющую ее. Однако в приведенных выше существующих аналогах целевые молекулы ДНК должны содержать в своем составе дополнительную последовательность нуклеотидов, обеспечивающих их селективное взаимодействие с агентом для связывания ДНК. В отличие от существующих аналогов, в настоящем изобретении описан способ разделения целевых и нецелевых молекул ДНК, не требующий внесения дополнительных последовательностей в целевые молекулы ДНК, что достигается за счет использования принципа негативной селекции. Для этого специфическая нулеотидная последовательность, обеспечивающая селективное взаимодействие с агентом для перевода фрагмента ДНК на твердую фазу из раствора, включается в последовательность нецелевых молекул ДНК, что позволяет селективно деплицировать такие молекулы из исходного раствора ДНК, содержащего смесь целевых и нецелевых молекул ДНК, тем самым позволяя получить раствор, содержащий только целевые молекулы ДНК без примеси нецелевых молекул ДНК. Реализованный в настоящем изобретении принцип очистки целевых молекул ДНК проиллюстрирован на фиг. 2.

Агент, способный связываться с нецелевыми молекулами ДНК, должен обеспечивать их перевод из жидкой фазы на твердую фазу. Специалисту в данной области очевидно, что это может быть реализовано двумя способами - до проведения связывания агента с молекулами ДНК или после него. При этом при иммобилизации на твердой фазе агента до связывания с ДНК, иммобилизация может обеспечиваться как с помощью ковалентной сшивки молекул агента с твердым носителем (в качестве примера можно привести ковалентную кросс-сшивку агента, являющегося белковой молекулой, с CNBr-активированной сефарозой; специалисту в данной области очевидно, что приведенный пример не является единственным и не исчерпывает все возможные способы ковалентной иммобилизации агентов различной природы на твердом носителе) или обеспечиваться за счет нековалентного взаимодействия (в качестве примера можно привести взаимодействие агента, в состав которого входит биотин, с предварительно иммобилизованным на твердой фазе белком стрептавидином; специалисту в данной области очевидно, что приведенный пример не является единственным и не исчерпывает все возможные способы нековалентной иммобилизации агентов различной природы на твердом носителе). Специалисту также очевидно, что технически процесс сорбции нецелевых молекул ДНК на твердой фазе может осуществляться как в формате batch, так и в форме хроматографии на колонке с аффинным носителем. Также из существующего уровня техники известно, что перевод агента в твердую фазу может достигаться за счет присоединения к нему специфических белковых последовательностей, обеспечивающих фазовый переход при изменении температуры (Kostal et al., 2004). Возможные принципиальные варианты иммобилизации агента и связанных с ним молекул ДНК на твердой фазе проиллюстрированы на фиг. 3.

В качестве агентов, обеспечивающих взаимодействие с молекулами ДНК, имеющими в своем составе специфические нуклеотидные последовательности, могут быть использованы белки, обладающие способностью узнавать и связываться с такими последовательностями. Из существующего уровня техники известно, что роль таких белков могут играть белки, являющиеся транскрипционными факторами, которые участвуют в регуляции транскрипции и специфически взаимодействуют со своими цис-действующими элементами, или домены таких белков, достаточные для такого взаимодействия ((Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), (Woodgate et al., 2002), (Kostal et al., 2004)). Данный тип агентов, способных связывать специфические последовательности ДНК, не приводит к модификации ДНК, и позволяет реализовать эффективное связывание молекул ДНК, имеющих в своем составе последовательности, узнаваемые транскрипционным фактором, как это известно из существующего уровня техники. Соответственно, в одном из своих воплощений в настоящем изобретении для специфического связывания ДНК могут использоваться в качестве агентов белки из числа транскрипционных факторов, а также их части, способные специфически взаимодействовать со своими цис-действующими элементами, и специфические нуклеотидные последовательности, узнаваемые транскрипционным фактором, которые включены в состав нецелевых молекул ДНК.

Помимо транскрипционных факторов, еще некоторые типы белков способны узнавать специфические нуклеотидные последовательности. Однако, в отличие от известных их настоящего уровня техники примеров реализации разделения молекул ДНК, основанных на взаимодействии белков со специфическими нуклеотидными последовательностями, в которых используются белки, не способные к внесению изменений в ковалентную структуру ДНК после связывания, эти белки после связывания вносят ковалентные изменения в ДНК, после чего диссоциируют с молекулы ДНК. Очевидно, что использование таких белков в качестве агента может быть неэффективно из-за процесса диссоциации. Кроме того, при использовании таких агентов, на эффективность истощения нецелевых молекул ДНК может негативно влиять происходящие в процессе разделения ковалентные модификации молекул ДНК. Поэтому настоящее изобретение в одном из своих воплощений предусматривает возможность использование в качестве агентов белков, способных узнавать специфические нуклеотидные последовательности и вносить ковалентных модификации в ДНК, которые, однако, несут мутации, не влияющие на их способность связывать специфические нуклеотидные последовательности, но нарушающие их энзиматическую активность в отношении внесения ковалентных модификаций в ДНК. Применение таких мутантных версий останавливает цикл работы фермента «связывание - модификация - диссоциация» на стадии связывания, обеспечивая эффективное взаимодействие агента с ДНК и исключая потенциальное влияние появления ковалентных модификаций ДНК на этот процесс.

Известно, что ДНК-связывающие белки, обладающие способностью взаимодействовать со специфическими нуклеотидными последовательностями, могут изменять свою аффинность при изменении степени сверхспирализации ДНК. Примером такого белка, использованного для последовательность-специфичной очистки молекул ДНК, является Lac-репрессор, аффинность которого к LacO-сайтам ослабляется при нахождении ДНК в релаксированном, а не сверхспирализованном состоянии (Whitson et al., 1987а; Whitson et al., 1987b). В одном из применений настоящего изобретения может возникать необходимость очистки целевых молекул ДНК из смеси, содержащей как релаксированные кольцевые, линейные, так и сверхспирализованные нецелевые молекулы ДНК. Примером такого применения является очистка целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК, которая должна обеспечивать истощение всех возможных продуктов расщепления плазмиды, в том числе и продуктов неполного расщепления, которые, в том числе, могут содержать сверхспирализованные кольцевые молекулы ДНК (см. фиг. 4). Поэтому предпочтительно, чтобы используемый агент, обеспечивающий опосредованной специфической нуклеотидной последовательностью взаимодействие с молекулами ДНК, обладал неизменной аффинностью к ДНК вне зависимости от состояния ее сверхспирализации, что обеспечит одинаково эффективное связывание всех возможных нецелевых молекул ДНК.

Настоящее изобретение предполагает присутствие в составе нецелевых молекул ДНК, от которых осуществляется очистка, специфической нуклеотидной последовательности, обеспечивающей взаимодействие с агентом. В одном из своих воплощений настоящее изобретение предусматривает включение одной копии такой последовательности в одну молекулу ДНК, что будет обеспечивать ее взаимодействие с агентом. При этом каждая конкретная пара «агент - специфическая нуклеотидная последовательность» характеризуется определенной константой связывания, которая определяет, в зависимости от их концентраций, остаточную концентрацию нецелевых молекул ДНК в растворе в равновесном состоянии. Специалисту в данной области очевидно, что включение в состав молекулы ДНК более чем одной копии специфической нуклеотидной последовательности при прочих равных условиях будет сдвигать равновесное состояние в сторону уменьшения концентрации предназначенных для сорбции и истощения молекул ДНК, тем самым обеспечивая более полную и эффективную очистку от нецелевых молекул ДНК. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает включение в нецелевые молекулы ДНК, от которых производится отделение целевых молекул ДНК, более чем одной копии специфической нуклеотидной последовательности, с которой взаимодействует агент.

В одном из своих воплощений в настоящем изобретений в качестве агента для связывания ДНК может использоваться сайт-специфическая рекомбиназа Cre, специфически взаимодействующая с достаточно высокой константой связывания (Ringrose et al., 1998) с последовательностью нуклеотидов, называемой LoxP-сайтом, представляющую собой последовательность из 34 нуклеотидов (нт), состоящую из двух инвертированных повторов длинною 13 нт, разделенных спейсером в 8 нт. Поскольку рекомбиназа Cre относится к ДНК-связывающим белкам, ковалентно модифицирующим ДНК (в результате процесса рекомбинации), то для применения рекомбиназы Cre в настоящем изобретении возникает необходимость использования ее мутантов, сохраняющих способность специфически взаимодействовать с ZoxP-сайтами, но дефектных по рекомбинационной активности.

Процесс рекомбинации, опосредованный Cre-рекомбиназой, включает в себя несколько стадий. Первой является взаимодействие молекул рекомбиназы с ZoxP-сайтами в составе молекулы ДНК. Далее происходит образование синаптических структур, или синапсов, состоящих из двух ZoxP-сайтов, за счет взаимодействия между субъединицами рекомбиназы Cre, что предшествует процессу рекомбинации и последующей диссоциации молекул Cre с ДНК (Ghosh et al., 2007). Известно, что мутанты рекомбиназы Cre, дефектные по рекомбинационной активности, но сохраняющие способность взаимодействовать с ZoxP-сайтами, могут как сохранять способность образовывать синапсы, так и быть лишенной этой способности. Поскольку ключевым требованием к агенту является сохранение способности взаимодействовать со специфической нуклеотидной последовательностью, оба типа мутантов могут быть использованы при практической реализации настоящего изобретения. В одном из своих воплощений, такими мутантами могут быть белки Cre, содержащие замену аминокислотного остатка лизина в позиции 201 полипептидной цепи на аланин (Cre(К201 А)) или замену аминокислотного остатка тирозина в позиции 324 полипептидной цепи на фенилаланин (Cre(Y324F). При этом известно, что мутант Cre(К201А) сохраняет способность образовывать синапсы, в то время как второй мутант, Cre(Y324F), дефектен не только по каталитической активности, но и по способности образовывать синаптические структуры (Ghosh et al., 2007). Специалисту в настоящей области очевидно, что потенциально возможно получение других мутантов белка Cre, сохраняющих способность специфически взаимодействовать с LoxP-сайтами, но дефектных по рекомбинационной активности, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения.

Специалисту в настоящей области очевидно, что при практической реализации настоящего изобретения при применении в качестве ДНК-связывающего агента мутантных версий рекомбиназы Cre в качестве узнаваемой ими последовательностей ДНК могут быть использованы не только ZoxP-сайты, но и их измененные версии, сохраняющие способность взаимодействовать с рекомбиназой Cre, например, описанные в (Kolb, 2001; Langer et al., 2002).

Специалисту в настоящей области также очевидно, что при практической реализации настоящего изобретения могут быть использованы варианты рекомбиназы Cre, специфичность взаимодействия которых с молекулами ДНК изменена в результате мутаций, в совокупности с ZoxP-сайтами с соответствующими нуклеотидными заменами, обеспечивающими взаимодействия с измененным белком Cre, например, описанные в (Hartung М & Kisters-Woike, 1998).

В одном из своих воплощений, для иммобилизации взаимодействующего с молекулами ДНК, содержащих ZoxP-сайты, белка Cre на твердой фазе могут использоваться химерные белки, полипептидные цепи которых включают в себя полипептидную цепь мутантного белка Cre и полипептидную цепь белка глутатион-S-трансферазы, обеспечивающего нековалентную сорбцию на твердом носителе глутатион-сефарозе.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает выбор агента из числа белков, взаимодействие которых со специфической последовательностью ДНК не зависит от наличия сверхспирализации в молекуле ДНК. В варианте осуществления изобретения, предусматривающем использование мутантных вариантов белка Cre в качестве ДНК-связывающего агента, это предпочтение выполняется, поскольку известно, что взаимодействие Cre с ДНК не зависит от наличия сверхспирализации ДНК (Hoess et al., 1984).

Краткое описание фигур

Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные фигуры.

На фиг. 1 проиллюстрированы ситуации, в которых затруднительно или невозможно получение неконтаминированного иными продуктами расщепления целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК с помощью их разделения на основании различия длин молекул ДНК. На панеле А в результате расщепления плазмидной ДНК целевой фрагмент ДНК (полоса белого цвета) по своей длине существенно отличается от нецелевого фрагмента ДНК (полоса серого цвета), что позволяет эффективно разделить их в результате гель-электрофореза (внизу). На панеле Б целевой и нецелевой фрагменты ДНК имеют незначительное различие в длинах, что не позволяет эффективно разделить их в результате гель-электрофореза. На панеле В проиллюстрирована ситуация, когда нецелевой фрагмент ДНК существенно меньше по длине целевого фрагмента, что не позволяет отделить целевой фрагмент от продукта неполного расщепления плазмидной ДНК (полоса со штриховкой на схематическом изображении геля внизу).

На фиг. 2 представлена принципиальная схема очистки целевых фрагментов ДНК (полоса белого цвета) от нецелевых фрагментов ДНК (полоса серого цвета), имеющих в своем составе специфическую нуклеотидную последовательность (круг черного цвета), получаемых в результате расщепления плазмидной ДНК (а)). К раствору фрагментов ДНК, получаемых в результате расщепления плазмиды, добавляется иммобилизованный на твердом носителе агент (полукольцо серого цвета на схеме), способный взаимодействовать со специфической нуклеотидной последовательностью (б)). После опосредованного специфической нуклеотидной последовательностью связывания нецелевых фрагментов ДНК агентом носитель с иммобилизованными на твердой фазе комплексами агента и нецелевых фрагментов ДНК удаляется (в)), оставляя в растворе только целевой фрагмент ДНК (г)).

На фиг. 3 проиллюстрированы возможные принципиальные варианты иммобилизации агента (полукольцо серого цвета) и связанных с ним нецелевых молекул ДНК (полоса серого цвета), содержащих специфическую нуклеотидную последовательность (круг черного цвета) на твердой фазе (обозначена штриховкой). А - агент может быть изначально иммобилизован на твердом носителе, который добавляется к раствору смеси нецелевых и целевых (полоса белого цвета) молекул ДНК, после чего происходит связывание агентом нецелевых молекул ДНК и их иммобилизация на твердой фазе. Связывание нецелевых молекул ДНК может осуществляться агентом, находящимся в растворе, после чего иммобилизация комплекса агента с нецелевым фрагментом ДНК на твердой фазе осуществляется за счет специфического взаимодействия агента с добавляемым твердым носителем (Б) или за счет индуцируемого внешним воздействием (молния на схеме) фазового перехода агента (В).

На фиг. 4 схематически изображены возможные нецелевые молекулы ДНК после расщепления плазмиды, содержащей целевой фрагмент ДНК (полоса белого цвета): продукт полного расщепления - линейный фрагмент ДНК, содержащий векторную последовательность (полоса серого цвета) (а)), и продукты неполного расщепления - расщепление только по одному сайту (б)), кольцевые релаксированная (без штриховки) (в)) и сверхспирализованная (со штриховкой) (г)) молекулы плазмидной ДНК.

На фиг. 5 представлены репрезентативные результаты очистки и иммобилизации на глутатион-сефарозе рекомбинантного белка GST-Cre(Y324F). Суммарные лизаты клеток E.coli, трансформированных плазмидой pGEX-4T-1 с клонированной в нее кДНК мутантного варианта рекомбиназы Cre, Cre(Y324F), для экспрессии химерного белка GST-Cre(Y324F)) до (дорожка 2) и после (дорожка 3) индукции экспрессии рекомбинантного белка, полученные в результате обработки ультразвуком лизаты тех же клеток E.coli после индукции экспрессии рекомбинантного белка до (дорожка 4) и после (дорожка 5) сорбции рекомбинантного белка на глутатион-сефарозе, и белки, элюированные с помощью кипячения в буфере для нанесения белков на гель с 1 мкл глутатион-сефарозы после сорбции рекомбинантного белка (дорожка 6), разделяли в 10% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. После разделения белки в геле окрашивались красителем Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad,). Положение рекомбинантного белка GST-Cre(Y324F) в геле показано стрелкой. В дорожке 1 нанесены маркеры молекулярных масс белков, с указанием молекулярных масс компонентов маркера (в кДа) слева.

На фиг. 6 приведены схематические изображения модельных плазмид pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR и pBl-LoxP-NeoR-LoxP и продуктов их расщепления эндонуклеазами рестрик