Мутантные лентивирусные белки env и их применение в качестве лекарственных средств

Мутантные лентивирусные белки env и их применение в качестве лекарственных средств

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к мутантным лентивирусным белкам ENV и к их применению в качестве лекарственных средств.

Лентивирусы представляют собой род медленных вирусов семейства Retroviridae, характеризующийся длительным инкубационным периодом. Лентивирусы могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина и обладают уникальной среди ретровирусов способностью к репликации в неделящихся клетках, так что они являются одним из наиболее эффективных способов доставки генов с помощью вектора. Примерами лентивирусов являются ВИЧ, SIV и FIV.

Вирус иммунодефицита человека (HIV) согласно ВОЗ является одним из наиболее серьезных кризисов в здравоохранении, с которыми на сегодняшний день мир имеет дело. СПИД вызвал гибель более чем 25 миллионов человек с 1981 года. В наиболее тяжело затронутых странах средняя продолжительность жизни в настоящее время снижается до 49 лет - на 13 лет меньше, чем в отсутствие СПИД. В соответствии с UNAIDS в 2006 году согласно оценкам вирус ВИЧ имели 39,5 миллионов человек и 4,3 миллиона были инфицированы. Во многих регионах новые инфекции в значительной степени сосредотачиваются в более молодых поколениях (15-24 года). Доступность лечения и ухода значительно возросла в последние годы. Определение в реальном времени тенденций к заболеваемости ВИЧ и, в частности, влияния программ предупреждения в идеальном случае требует длительных исследований большого количества людей. Учитывая практические трудности проведения таких исследований, их фокус был направлен на молодых женщин и их грудных детей. Дети, имеющие ВИЧ, как правило, приобретают их инфекцию посредством передачи от матери к ребенку (MTCT), которая происходит в ходе беременности, родов или в процессе кормления грудью. Экстренно необходимыми являются повторные усилия для увеличения доступности всесторонних и комплексных программ для предупреждения инфекции ВИЧ у грудных детей и детей младшего возраста, что укажет путь к свободным от ВИЧ поколениям.

Известны два типа ВИЧ: ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которые инфицируют людей. Они относятся к группе ретровирусов, называемой лентивирусами, и вирус, сходный с ВИЧ, был обнаружен у африканских обезьян. Ретровирусы передают их гены из клетки-продуцента в клетку-мишень в качестве геномного РНК-транскрипта, который обратно транскрибируется после инфицирования и встраивается в ДНК-геном клетки-мишени.

Первый человек с документально подтвержденной ВИЧ-инфекцией умер в 1959 году. В ранних 1980-х врачам в США стало известно, что все больше пациентов страдают от аномальных инфекций и демонстрируют признаки иммунодефицита. Синдром был назван синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) и вскоре после этого было открыто, что ВИЧ является этиологическим фактором для наблюдаемого разрушения иммунной системы. Первоначально пациентам предлагали лечение, основанное только на смягчении боли, и практически все в конечном итоге умирали. В середине 1990-х произошло два важных прорыва в лечении. Во-первых, была открыта новая группа антиретровирусных средств и, во-вторых, стало возможно измерять количество вируса ВИЧ в крови. Эти два достижения сделали возможным лечение пациентов комбинацией различных средств, и врачи были способны проверять, действительно ли работает лечение. Результатом было то, что иммунная система инфицированных пациентов постепенно стала нормальной и пациенты стали жить дольше. На сегодняшний день инфицированные люди в западных странах имеют тот же уровень качества жизни, что и не инфицированные люди, и способны иметь детей, хотя экономические и психологические последствия наличия ВИЧ огромны. Однако ситуация еще более тяжелой является в развивающихся странах, где живет более 95% людей, инфицированных ВИЧ/СПИД. Во всем мире более 25 миллионов человек погибли от СПИД за последние 25 лет.

Приблизительно 95% людей, инфицированных на сегодняшний день, живут в развивающихся странах, где дорогостоящие противовирусные лекарственные средства не доступны. Таким образом, существует острая необходимость в эффективной вакцине - единственном эффективном решении для неконтролируемой пандемии ВИЧ. За последние несколько лет исследования обеспечили новую информацию о фундаментальной биологии вируса ВИЧ, что привело к новым противовирусным лекарственным средствам и стратегиям для создания вакцин. Несмотря на эти значительные достижения, эффективной вакцины все еще не существует. Только аттенуированные (т.е. живые, но ослабленные) штаммы ВИЧ были способны обеспечить иммунитет в исследованиях на приматах, хотя они никогда не достигнут требуемого профиля безопасности, пригодного для массовой вакцинации.

Процесс репликации ВИЧ-1 имеет уровень ошибок, составляющий приблизительно одну на 10000 пар оснований.

Поскольку весь вирусный геном составляет немного менее 10000 пар оснований, согласно оценке, в среднем одна ошибка вносится в геном ВИЧ-1 при каждом цикле репликации вируса.

Высокая частота мутаций обеспечивает широкую вариабельность вирусов внутри любого индивидуума и еще более широкую вариабельность среди популяций.

Эта вариабельность обеспечила три описанных варианта ВИЧ-1 и подвиды вируса, называемые "кладами". Различия основаны на структуре белков оболочки, которые являются особенно вариабельными. Вариант M (основной) вне всяких сомнений является наиболее распространенным по всему миру. В варианте M существуют клады A, B, C, D, E, F, G, H, I, J и K, причем клады A-E ответственны за широкое большинство инфекций по всему миру. Клады A, C и D являются доминирующими в Африке, в то время как клад B является наиболее распространенным в Европе, Северной и Южной Америке и Юго-восточной Азии. Клады E и C преобладают в Азии. Эти клады отличаются на вплоть до 35%. Другим вариантом является клад O, который наблюдают в камерунских изолятах ВИЧ-1. Наибольшее варьирование структуры наблюдают в белках оболочки gp120 и gp41.

Существует два важных результата очень высокой частоты мутаций ВИЧ-1, которые имеют глубокие последствия для эпидемии. В первую очередь, высокая частота мутаций является одним из механизмов, которые позволяют вирусу ускользать от контроля с помощью медикаментозной терапии. Эти новые вирусы представляют собой устойчивые штаммы. Высокая частота мутаций также позволяет вирусу ускользать от иммунной системы пациента посредством изменения структур, которые распознаются иммунными компонентами. Дополнительным следствием этой широкой вариабельности является то, что вирус может ускользать от контроля с помощью вакцин, и, таким образом, это затрудняет поиск вакцин на основе белков оболочки, которые являются эффективными.

Более того, вирус продуцирует белки, обладающие иммунодепрессивными свойствами, что позволяет ускользать от надзора иммунной системой пациента. Таким образом, клетка, экспрессирующая такие белки, становится "невидимой" для иммунной системы.

Следовательно, для вакцины существует необходимость предоставления белков в качестве антигенов, имеющих утраченные или по существу утраченные их иммунодепрессивные функции, для формирования эффективного ответа. Это позволит иммунной системе индивидуумов после инфицирования уничтожить инфицированные клетки и предупредить/излечить инфекцию.

На уровне техники уже предполагалось предоставление таких белков.

Например, в международной заявке WO 2005/095442 (авторы изобретения: Renard, Mangeney и Heidmann) описаны мутации в иммунодепрессивных доменах эндогенных ретровирусов (ERV) или онкоретровирусов, таких как белки HTLV или FeLV, ENV. В этом документе продемонстрировано, что мутации в конкретном положении устраняют иммунодепрессивные свойства белков ENV в ERV или онкоретровирусах. Однако в международной заявке WO 2005/095442 не упоминается или не предполагается, что мутации, внесенные в иммунодепрессивный домен белков ENV в ERV или онкоретровирусах, могут быть перенесены в белки ENV лентивирусов.

В международной заявке WO 2010/022740 описана чрезвычайно широкая консенсусная последовательность области белка ENV ВИЧ, представленная ниже:

X(1-22)-C(23)-X(24-28)-C(29)-(X30-50),

где аминокислотные остатки консенсусной последовательности выбраны из групп остатков, состоящих из:

X(1): L, S, R, P, F, A, V, M и I; и

X(2): Q, R, K, H, L, M и P; и

X(3): A, T, V, H, S, R, Q, G, M и E; и

X(4): R, K, G, E, T, S, C, M и H; и

X(5): V, I, L, D, A, S, F, M и G; и

X(6): L, Q, V, M, P, W, T и I; и

X(7): A, S, T, V, L, G, F, D, M и E; и

X(8): V, L, I, M, A, W, K, G и E; и

X(9): E, K, G, D, A, V, M и F; и

X(10): X; и

X(11): Y, L, F, H, C, I, T, M и N; и

X(12): L, I, V, M, Q, P, T, Y и A; и

X(13): K, R, Q, G, S, E, H, W, T, V, M, N, Z, Y, A, P и C; и

X(14): D, N, G, E, Y, V, S, H, A, M и I; и

X(15): Q, R, H, K, P, L, M и N; и

X(16): Q, K, R, T, H, E, S, P, M и L; и

X(17): L, F, I, R, V, P, S, M и H; и

X(18): L, M, P, I, H и S; и

X(19): X; и

X(20): I, L, M, V, S, F, T, D, A, R, P и J; и

X(21): W, R, G, F, L, M и T; и

X(22): G, D, A, R, M и C; и

X(24): X; и

X(25): G, R, E, N, A, M и D; и

X(26): K, R, N, E, Q, T, S, I, M и G; и

x(27): L, H, I, T, V, F, R, Q, S, P, A, J, M и Y; и

X(28): I, V, T, L, R, F и M; и

X(30): T, P, Y, A, N, S, I, V, R, L, M и H; и

X(31): T, S, P, N, M и I; и

X(32): A, N, T, S, D, R, F, Q, P, I, E, V, M, L, K, H, C и B; и

X(33): V, A, L, M, G, R и C; и

X(34): X; и

X(35): W, R, G, L, M и P; и

X(36): N, S, D, B, K, E, R, Q, M и G; и

X(37): S, T, A, N, D, V, I, E, Y, K, L, R, G, P, M, F, W, H, Q, B и C; и

X(38): S, T, N, I, G, R, L, C, A, W, M и E; и

X(39): W, G, A, R, E, C, Y, V, S, M и H; и

X(40): X; и

X(41): N, G, K, S, D, E, T, R, H, P, A, B, V, Q, Y, M и I; и

X(42): K, R, N, D, S, T, G, E, I, V, Y, Q, P, H, A, W, M и C и

X(43): S, T, N, K, I, R, D, E, P, L, A, W, G, M, H, Y, F, V и C,

X(44): L, Y, Q, F, E, H, S, V, K, M, T, I, W, N, D, R, P, A и G; и

X(45): D, E, N, S, T, K, G, L, A, Q, H, I, Y, B, R, V, P, M, F, W, Z и C; и

X(46): E, D, Q, Y, K, N, T, S, A, W, H, M, R, I, G, L, V, Z, F, B и P; и

X(47): I, D, E, M, G, T, Q, S, W, L, N, Y, K, V, R, F, A, P и H и

X(48): W, I, T, N, D, E, L, G, S, Y, R, V, K, H, A, Q, M и F; и

X(49): D, N, E, G, W, Q, K, H, L, B, S, I, Y, T, A, R, M, Z и V; и

X(50): N, D, T, K, S, H, L, G, E, W, I, Q, M, R, B, Y, P и A.

Эта консенсусная последовательность содержит 50 аминокислот, в которых конкретные аминокислоты в положениях 10, 19, 24, 34 и 40 определены как влияющие на иммуногенные свойства полипептида оболочки ВИЧ-1, и остальные 45 положений определяются произвольно, включая наиболее распространенные аминокислоты белков ENV ВИЧ дикого типа.

В действительности, идеей WO 2010/022740 является перенос от эндогенных ретровирусов (ERV) или онкоретровирусов в лентивирус, исходя из идей WO 2005/095442 (авторы изобретения: Renard, Mangeney и Heidmann), однако указанный перенос недопустим в случае лентивируса, как показано авторами настоящего изобретения.

Коротко говоря, Dr Heidmann является автором изобретения в WO 2005/095442 и настоящего изобретения. Фактически, эффекты мутаций, описанных в WO 2005/095442, также были исследованы у лентивируса автором настоящего изобретения, однако не наблюдали эффекта, когда мутации, идентифицированные в эндогенных ретровирусах или онкоретровирусах, переносили в белок ENV лентивируса.

Более того, поскольку любая аминокислота может быть внесена в положения 10, 19, 24, 34 или 40 в консенсусной последовательности, WO 2010/022740 предполагает, что такие мутации могут быть эффективными с использованием любого аминокислотного остатка. Эта идея противоречит настоящему изобретению, демонстрирующему, что на иммунодепрессивные свойства белка ENV ВИЧ-1 влияют только конкретные мутации, которые определяются не только их положением, но также природой заменяемых аминокислотных остатков.

Более того, в WO 2010/022740 описаны экспериментальные результаты только для одной конкретной мутации в иммунодепрессивном домене белка ENV ВИЧ, определяемом консенсусной последовательностью из 50 аминокислот. Мутация, замена на R, в качестве единственной проиллюстрированной мутации в международной заявке WO 2010/022740, находится в положении аминокислоты 19, что вновь эквивалентно положению, описанному в международной заявке WO 2005/095442, если просто осуществить выравнивание последовательностей ENV (см. фиг. 3 в WO 2010/022740, которая является копией фиг. 3 в Benit et al. 2001, Journal of Virology, Vol. 75, No. 23, p.11709-11719) (Следует отметить, что не только положение аминокислоты, но также и природа замены (на аргинин) являются сходными с теми, что описаны в WO 2005/095442).

Более конкретно, при выравнивании последовательностей ENV, соответственно, эндогенного ретровируса или онкоретровируса и лентивируса, в соответствии с фиг. 3 из Benit et al.:

,

оказалось, что положение 19 в лентивирусе соответствует положению в WO 2005/095442, где конкретная замена на аргинин, E→R, для эндогенного ретровируса или онкоретровируса приводит к утрате иммунодепрессивной активности.

В международной заявке WO 2010/022740 описано, что указанный мутантный белок ENV ВИЧ ингибирует пролиферацию PBMC ex vivo, однако такой результат ex vivo не имеет предсказательной ценности in vivo.

Однако в WO 2010/022740 не описано или не предполагается, что мутанты являются эффективными in vivo, т.е. что клетка, экспрессирующая мутанты, обнаруживается иммунной системой.

Более того, как описано далее в настоящем описании, такие мутации не являются эффективными in vivo. Действительно, результаты, описанные ниже в разделе "Пример" в отношении настоящего изобретения, демонстрируют, что указанная замена G19R не ингибирует иммунодепрессивные свойства белка ENV in vivo.

Вследствие этого, WO 2010/022740 поднимает ту же техническую проблему, что и настоящее изобретение, но не предлагает приемлемого технического решения. Этот документ уровня техники демонстрирует трудность идентификации эффективных мутаций, влияющих на иммунодепрессивные свойства лентивирусных белков ENV.

Таким образом, остается потребность в предоставлении эффективных in vivo неиммунодепрессивных белков ENV лентивирусов.

Одной целью изобретения является предоставление новых мутантных белков ENV, лишенных иммунодепрессивных свойств.

Другой целью изобретения является предоставление новой фармацевтической композиции, эффективной для лечения лентивирусной инфекции.

Другой целью изобретения является предоставление эффективной вакцины.

Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного вещества:

a) выделенный мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны, по существу не обладающий иммунодепрессивной активностью,

причем указанный мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны получен в результате мутации трансмембранной (TM) субъединицы лентивирусного белка ENV человека или обезьяны дикого типа,

указанный мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны обладает по меньшей мере 70% идентичностью, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью, с одной из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 420 и SEQ ID NO: 421,

указанный мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны содержит мутантный иммунодепрессивный домен (ISU), содержащий следующую аминокислотную последовательность:

A-[I/V]-E-[K/R]-X_a-X_b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

где

X обозначает любую аминокислоту,

и либо

X_a представляет собой A, F, G, L, R или удален, и X_b представляет собой C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y, либо

X_a представляет собой C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y, и X_b представляет собой A, F, G, R или удален, либо

X_a представляет собой A, F, G, L, R или удален, и X_b представляет собой A, F, G, R или удален,

или

b) по меньшей мере один фрагмент указанного выделенного мутантного лентивирусного белка ENV человека или обезьяны, по существу не обладающий иммунодепрессивной активностью,

причем указанный фрагмент содержит по меньшей мере 40 аминокислот,

указанный фрагмент содержит мутантный иммунодепрессивный домен (ISU), содержащий следующую аминокислотную последовательность:

A-[I/V]-E-[K/R]-X_a-X_b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

где

X обозначает любую аминокислоту,

и либо

X_a представляет собой A, F, G, L, R или удален, и X_b представляет собой C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y, либо

X_a представляет собой C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y, и X_b представляет собой A, F, G, R или удален, либо

X_a представляет собой A, F, G, L, R или удален и X_b представляет собой A, F, G, R или удален,

вместе с фармацевтически приемлемым носителем,

причем указанное по существу отсутствие иммунодепрессивной активности упомянутого выше мутантного лентивирусного белка ENV человека или обезьяны или определенного выше фрагмента может быть оценено, исходя из того факта, что в анализе in vivo, вовлекающем отторжение трансплантированных опухолевых клеток,

в котором указанные опухолевые клетки трансдуцируют таким образом, чтобы они экспрессировали либо указанный мутантный белок ENV, либо указанный фрагмент ("опухолевые клетки с мутантным ENV"),

или указанные опухолевые клетки трансдуцируют таким образом, чтобы они экспрессировали указанный белок ENV дикого типа или его фрагмент ("опухолевые клетки с ENV дикого типа"),

или указанные опухолевые клетки не трансдуцируют ("нормальные опухолевые клетки"),

следующее соотношение:

индекс иммунодепрессии указанного мутантного белка ENV или указанного фрагмента (i_{мутантный env})/индекс иммунодепрессии белка ENV дикого типа (i_{env дикого типа}), составляет менее 0,5,

где i_{мутантный env} определяется как: (максимальная площадь, достигаемая опухолевыми клетками с мутантным ENV - максимальная площадь, достигаемая нормальными опухолевыми клетками)/(максимальная площадь, достигаемая нормальными опухолевыми клетками), и

i_{env дикого типа} определяется как: (максимальная площадь, достигаемая опухолевыми клетками с ENV дикого типа - максимальная площадь, достигаемая нормальными клетками)/(максимальная площадь, достигаемая нормальными опухолевыми клетками).

Настоящая заявка основана на неожиданном наблюдении, сделанном авторами изобретения, что в некоторые конкретные аминокислоты иммунодепрессивного домена лентивирусного белка ENV могут быть внесены мутации, сообщающие указанному лентивирусному белку ENV по существу отсутствие иммунодепрессивных свойств или отсутствие иммунодепрессивных свойств, при сохранении их антигенности, трехмерной структуры иммунодепрессивного домена и их экспрессии на плазматической мембране. Более того, мутантный лентивирусный белок ENV в соответствии с изобретением не изменяет инфекционной способности вируса, экспрессирующего его.

В рамках изобретения выражение "мутантные лентивирусные белки ENV обезьяны или человека" означает, что белки ENV образованы в результате экспрессии гена env лентивируса человека или обезьяны.

Лентивирусы в соответствии с изобретением, охватываемые изобретением, представляют собой ВИЧ-1 и 2 и вирус иммунодефицита обезьяны (SIV).

Вследствие высокой частоты мутаций вирусов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV, "мутантный белок ENV", как определено в рамках изобретения, охватывает два значения.

В соответствии с первым значением указанный "мутантный белок ENV" является неестественным результатом вмешательства человека.

В соответствии со вторым значением мутантный белок ENV также охватывает встречающиеся в природе варианты, для которых вплоть до настоящего времени неиммунодепрессивные свойства остаются неизвестными.

Это второе значение учитывает природную вариабельность вариантов ВИЧ и SIV внутри одного и того же инфицированного индивидуума, где указанный "мутантный белок ENV" может быть неиммунодепрессивным, однако его свойство не поддается обнаружению, поскольку ВИЧ-инфицированный пациент всегда имеет множество вариантов ВИЧ, большинство из которых являются иммунодепрессивными.

Следующие три белка соответствуют последовательностям дикого типа белка ENV из ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV, соответственно. В рамках изобретения их считают эталонными последовательностями белков ENV дикого типа.

дикого типа

MWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLGNATNTNSSNTNSSSGEMMMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYTLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSANFTDNAKTIIVQLNQSVEINCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNATLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNNNNGSEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKIFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRVIEVVQGACRAIRHIPRRIRQGLERILL

SEQ ID NO: 418, ВИЧ-2 дикого типа

MCGRNQLFVASLLASACLIYCVQYVTVFYGVPVWRNASIPLFCATKNRDTWGTIQCLPDNDDYQEIALNVTEAFDAWNNTVTEQAVEDVWSLFETSIKPCVKLTPLCVAMRCNSTTAKNTTSTPTTTTTANTTIGENSSCIRTDNCTGLGEEEMVDCQFNMTGLERDKKKLYNETWYSKDVVCESNDTKKEKTCYMNHCNTSVITESCDKHYWDTMRFRYCAPPGFALLRCNDTNYSGFEPNCSKVVAATCTRMMETQTSTWFGFNGTRAENRTYIYWHGRDNRTIISLNKFYNLTVHCKRPGNKTVVPITLMSGLVFHSQPINRRPRQAWCWFKGEWKEAMKEVKLTLAKHPRYKGTNDTEKIRFIAPGERSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLNWVENRTNQTQHNYVPCHIKQIINTWHKVGKNVYLPPREGQLTCNSTVTSIIANIDGGENQTNITFSAEVAELYRLELGDYKLIEVTPIGFAPTPVKRYSSAPVRNKRGVFVLGFLGFLTTAGAAMGAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQAQLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDTLTPDWNNMTWQEWEQRIRNLEANISESLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNWFDLTSWIKYIQYGVYIVVGIIVLRIVIYVVQMLSRLRKGYRPVFSSPPAYFQQIHIHKDREQPAREETEEDVGNSVGDNWWPWPIRYIHFLIRQLIRLLNRLYNICRDLLSRSFQTLQLISQSLRRALTAVRDWLRFNTAYLQYGGEWIQEAFRAFARATGETLTNAWRGFWGTLGQIGRGILAV

PRRIRQGAEIALL

SEQ ID NO: 419,SIV дикого типа, mac239

MGCLGNQLLIAILLLSVYGIYCTLYVTVFYGVPAWRNATIPLFCATKNRDTWGTTQCLPDNGDYSEVALNVTESFDAWNNTVTEQAIEDVWQLFETSIKPCVKLSPLCITMRCNKSETDRWGLTKSITTTASTTSTTASAKVDMVNETSSCIAQDNCTGLEQEQMISCKFNMTGLKRDKKKEYNETWYSADLVCEQGNNTGNESRCYMNHCNTSVIQESCDKHYWDAIRFRYCAPPGYALLRCNDTNYSGFMPKCSKVVVSSCTRMMETQTSTWFGFNGTRAENRTYIYWHGRDNRTIISLNKYYNLTMKCRRPGNKTVLPVTIMSGLVFHSQPINDRPKQAWCWFGGKWKDAIKEVKQTIVKHPRYTGTNNTDKINLTAPGGGDPEVTFMWTNCRGEFLYCKMNWFLNWVEDRNTANQKPKEQHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTCNSTVTSLIANIDWIDGNQTNITMSAEVAELYRLELGDYKLVEITPIGLAPTDVKRYTTGGTSRNKRGVFVLGFLGFLATAGSAMGAASLTLTAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVCHTTVPWPNASLTPKWNNETWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNWFDLASWIKYIQYGVYIVVGVILLRIVIYIVQMLAKLRQGYRPVFSSPPSYFQQTHIQQDPALPTREGKERDGGEGGGNSSWPWQIEYIHFLIRQLIRLLTWLFSNCRTLLSRVYQILQPILQRLSATLQRIREVLRTELTYLQYGWSYFHEAVQAVWRSATETLAGAWGDLWETLRRGGRWILAIPRRIRQGLELTLL

Вариант изобретения охватывает белки ENV из SIV, ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Варианты мутантных белков ENV из ВИЧ-1 в соответствии с изобретением обладают по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью дикого типа белка ENV из ВИЧ-1 и включают мутации, как описано выше, и не обладают иммунодепрессивной активностью.

Варианты мутантных белков ENV из ВИЧ-2 в соответствии с изобретением обладают по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью дикого типа белка ENV из ВИЧ-2 и включают мутации, как описано выше, и не обладают иммунодепрессивной активностью.

Варианты мутантных белков ENV из SIV в соответствии с изобретением обладают по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью дикого типа белка ENV из SIV и включают мутации, как описано выше, и не обладают иммунодепрессивной активностью.

Следующие три белка (SEQ ID NO: 216, 420 и 421) соответствуют трем мутантным последовательностям белка ENV из ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV, соответственно. В рамках изобретения их считают эталонными последовательностями мутантных белков ENV.

Более конкретно, SEQ ID NO: 216 соответствует SEQ ID NO: 417, в которой аминокислотный остаток Y в положении 5 (X_a) последовательности A-[I/V]-E-[K/R]-X_a-X_b-X-D-Q заменен на R.

SEQ ID NO: 420 соответствует SEQ ID NO: 418, в которой аминокислотный остаток Y в положении 5 (X_a) последовательности A-[I/V]-E-[K/R]-X_a-X_b-X-D-Q заменен на R.

SEQ ID NO: 421 соответствует SEQ ID NO: 419, в которой аминокислотный остаток Y в положении 5 (X_a) последовательности A-[I/V]-E-[K/R]-X_a-X_b-X-D-Q заменен на R.

	TDNAKTIIVQLNQSVEINCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNATLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNNNNGSEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKIFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRVIEVVQGACRAIRHIPRRIRQGLERILL
SEQ ID NO: 420, мутантный ВИЧ-2	MCGRNQLFVASLLASACLIYCVQYVTVFYGVPVWRNASIPLFCATKNRDTWGTIQCLPDNDDYQEIALNVTEAFDAWNNTVTEQAVEDVWSLFETSIKPCVKLTPLCVAMRCNSTTAKNTTSTPTTTTTANTTIGENSSCIRTDNCTGLGEEEMVDCQFNMTGLERDKKKLYNETWYSKDVVCESNDTKKEKTCYMNHCNTSVITESCDKHYWDTMRFRYCAPPGFALLRCNDTNYSGFEPNCSKVVAATCTRMMETQTSTWFGFNGTRAENRTYIYWHGRDNRTIISLNKFYNLTVHCKRPGNKTVVPITLMSGLVFHSQPINRRPRQAWCWFKGEWKEAMKEVKLTLAKHPRYKGTNDTEKIRFIAPGERSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLNWVENRTNQTQHNYVPCHIKQIINTWHKVGKNVYLPPREGQLTCNSTVTSIIANIDGGENQTNITFSAEVAELYRLELGDYKLIEVTPIGFAPTPVKRYSSAPVRNKRGVFVLGFLGFLTTAGAAMGAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKRLKDQAQLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDTLTPDWNNMTWQEWEQRIRNLEANISESLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNWFDLTSWIKYIQYGVYIVVGIIVLRIVIYVVQMLSRLRKGYRPVFSSPPAYFQQIHIHKDREQPAREETEEDVGNSVGDNWWPWPIRYIHFLIRQLIRLLNRLYNICRDLLSRSFQTLQLISQSLRRALTAVRDWLRFNTAYLQYGGEWIQEAFRAFARATGETLTNAWRGFWGTLGQIGRGILAVPRRIRQGAEIALL
SEQ ID NO: 421,мутантный	MGCLGNQLLIAILLLSVYGIYCTLYVTVFYGVPAWRNATIPLFCATKNRDTWGTTQCLPDNGDYSEVALNVTESFDAWNNTVTEQAIEDVWQLFETSIKPCVKLSPLCITMRCNKSETDRWGLTKSITTTASTTSTTASAK

SIV,mac239

VDMVNETSSCIAQDNCTGLEQEQMISCKFNMTGLKRDKKKEYNETWYSADLVCEQGNNTGNESRCYMNHCNTSVIQESCDKHYWDAIRFRYCAPPGYALLRCNDTNYSGFMPKCSKVVVSSCTRMMETQTSTWFGFNGTRAENRTYIYWHGRDNRTIISLNKYYNLTMKCRRPGNKTVLPVTIMSGLVFHSQPINDRPKQAWCWFGGKWKDAIKEVKQTIVKHPRYTGTNNTDKINLTAPGGGDPEVTFMWTNCRGEFLYCKMNWFLNWVEDRNTANQKPKEQHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTCNSTVTSLIANIDWIDGNQTNITMSAEVAELYRLELGDYKLVEITPIGLAPTDVKRYTTGGTSRNKRGVFVLGFLGFLATAGSAMGAASLTLTAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKRLKDQAQLNAWGCAFRQVCHTTVPWPNASLTPKWNNETWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNWFDLASWIKYIQYGVYIVVGVILLRIVIYIVQMLAKLRQGYRPVFSSPPSYFQQTHIQQDPALPTREGKERDGGEGGGNSSWPWQIEYIHFLIRQLIRLLTWLFSNCRTLLSRVYQILQPILQRLSATLQRIREVLRTELTYLQYGWSYFHEAVQAVWRSATETLAGAWGDLWETLRRGGRWILAIPRRIRQGLELTLL

Изобретение также охватывает варианты "мутантного лентивирусного белка ENV обезьяны или человека", имеющие упомянутые выше мутации, которые сообщают отсутствие иммунодепрессивных свойств указанному варианту.

Варианты мутантных белков ENV из ВИЧ-1 в соответствии с изобретением обладают по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью с эталонной мутантной последовательностью белка ENV из ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 216) и включают мутации, как описано выше, и не обладают иммунодепрессивной активностью.

Варианты мутантных белков ENV из ВИЧ-2 в соответствии с изобретением обладают по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью с эталонной мутантной последовательностью белка ENV из ВИЧ-2 (SEQ ID NO: 420) и включают мутации, как описано выше, и не обладают иммунодепрессивной активностью.

Варианты мутантных белков ENV из SIV в соответствии с изобретением обладают по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью с эталонной мутантной последовательностью белка ENV из SIV (SEQ ID NO: 421) и включают мутации, как описано выше, и не обладают иммунодепрессивной активностью.

Иммунодепрессивный домен (ISU) лентивируса в соответствии с изобретением может быть ограничен последовательностью SEQ ID NO: 6,

xGIVQQQxxLLxxxxxxQxxLxLxxWGxKxLQxRxxA[I/V]E[K/R]YLxDQxxLx (SEQ ID NO: 6),

в которой X обозначает любую аминокислоту.

SEQ ID NO: 6 соответствует немутантному домену ISU.

В этой SEQ ID NO: 6, "x" (строчными буквами) рассматривается независимо от "X" (прописными буквами), использованными впервые в SEQ ID NO: 416 по настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 6 включает SEQ ID NO: 1.

Наиболее преимущественные иммунодепрессивные домены белков ENV дикого типа по изобретению включают следующие последовательности:

белок ENV ВИЧ-1 включает аминокислотную последовательность AVERYLKDQ (SEQ ID NO: 7),

белок ENV ВИЧ-2 включает аминокислотную последовательность AIEKYLKDQ (SEQ ID NO: 8), и

белок ENV SIV включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или 8.

При использовании мутаций, упомянутых выше, домен ISU утрачивает его иммунодепрессивные свойства.

В указанной SEQ ID NO: 6 подчеркнутые аминокислоты представляют собой необходимые аминокислоты.

В рамках изобретения домен ISU, определяемый SEQ ID NO: 6, является минимальным необходимым доменом белка ENV согласно изобретению, который обладает иммунодепрессивной активностью.

Примеры доменов ISU дикого типа:

ВИЧ-1

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLG (SEQ ID NO: 366),

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLKLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLG (SEQ ID NO: 367),

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLG (SEQ ID NO: 368),

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLG (SEQ ID NO: 369),

SGIVQQQNNLLRAIEAQQQMLQLTVWGIKQLRARVLAVERYLRDQQLLG (SEQ ID NO: 370),

SGIVQQQSNLLRAIQARQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLG (SEQ ID NO: 371).

SIV

SGIVQQQNNLLKAIEAQQHLLQLSIWGVKQLQARLLAVERYLQDQQILG (SEQ ID NO: 372),

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLSVWGIKQLQARVLAIERYLRDQQILG (SEQ ID NO: 373),

AGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVSAIEKYLKDQAQLN (SEQ ID NO: 374),

AGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLN (SEQ ID NO: 375).

ВИЧ-2

AGIVQQQQQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQAQLN (SEQ ID NO: 376),

AGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQALLN (SEQ ID NO: 377).

Локализацию домена ISU можно определить во всех белках ENV вирусов, как описано в Benit et al. 2001, Journal of Virology, Vol. 75, No. 23, p.11709-11719. В широком значении, домен ISU определяется его структурой и его локализацией, независимо от того факта, что он обладает или не обладает иммунодепрессивной активностью.

В рамках изобретения домен ISU относится к конкретному домену, в котором мутация может влиять на иммунодепрессивное свойство белка ENV.

Иммунодепрессивное свойство белка ENV предпочтительно измеряют с использованием методик in vivo, которые отражают физиологические условия.

Иммунодепрессивные свойства мутантных белков ENV в соответствии с изобретением измеряют в соответствии с методикой in vivo для анализа иммунодепрессивной активности белка ENV, описанного ранее [Mangeney and Heidmann Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:14920-14925; Mangeney et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(51):20534-9].

В качестве физиологического исследования эту методику in vivo выполняют с использованием белков ENV или их фрагментов, которые не ассоциированы с другими белками-компонентами или белками-носителями, такими как BSA.

В кратком изложении, нуклеиновую кислоту дикого типа (лентивирусный белок ENV дикого типа) или модифицированную нуклеиновую кислоту, экспрессирующую исследуемый белок (мутантный лентивирусный белок ENV), трансфицируют в опухолевые клеточные линии, такие как клеточные линии MCA 205 или Cl8.1, известными способами трансфекции. Затем опухолевые клетки, экспрессирующие исследуемый белок, инъецируют, главным образом, посредством подкожной (п/к) инъекции хозяину, обычно мыши. После указанной инъекции определяют развитие опухоли или, напротив, ее отторжение и измеряют площадь опухоли. Развитие опухоли определяли пальпацией, и площадь опухоли (мм²) определяли путем измерения перпендикулярных диаметров опухоли. Индекс иммунодепрессии определяют как i=(S_env-S_{отсутствует})/S_{отсутствует}, где S_env представляет собой максимальную площадь, достигаемую опухолью, экспрессирующей белок оболочки, и S_{отсутствует} представляет собой максимальную площадь, достигаемую опухолью, не экспрессирующей белок ENV (отрицательный контроль).

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, определенное выше соотношение для индекса иммунодепрессии может составлять менее 0,2 и может даже иметь отрицательное значение (см. фиг. 2 и 3).

Можно проводить анализы in vitro с использованием высоких доз синтетических пептидов, однако они являются непрямыми и менее убедительными, поскольку выражение "иммунодепрессия" является уместным при применении в отношении животных, обладающих полной иммунной системой, но не к клеточным линиям.

Дополнительное затруднение для функциональной охарактеризации домена ISU основано на том факте, что ISU, содержащийся в ретровирусных белка ENV, является высокоструктурированным белковым доменом с образованием тримера в полных белках ENV (Caffrey M., Biochimica et Biophysica Acta, 1536:116-122, 2001; Caffrey et al., The EMBO Journal, Vol. 17, No. 16, p.4572-4584, 1998). Такие структуры не образуются естественным образом в случае пептидов ISU ограниченной длины, и это является наиболее вероятной причиной того, что большинство исследований, проведенных с помощью пептидов, дают неприменимые результаты и/или зависят от конкретного связывания пептидов с белками-носителями (такими как BSA, например, Denner et al., Current Science, AIDS 1994, 8:1063-1072).

Как упоминалось выше, белки ENV по изобретению являются мутантными. Эту мутацию вносят in vitro. Таким образом, мутантные белки ENV по изобретению являются выделенными и не соответствуют встречающемуся в природе аналогу.

Как упоминалось выше, лентивирусные мутантные белки ENV по существу лишены иммунодепрессивных свойств. Это означает, что мутантные белки ENV по изобретению не обладают или обладают сниженными иммунодепрессивными свойствами относительно природного немутантного белка ENV из вируса того же вида. Например, мутантный белок ENV ВИЧ в соответствии с изобретением обладает сниженными иммунодепрессивными свойствами относительно белка ENV ВИЧ дикого типа.

В рамках изобретения термины "по существу лишен иммунодепрессивных свойств" означает, что мутантные белки ENV по изобретению обладают индексом иммунодепрессии, меньшим чем приблизительно 0,2 [Mangeney and Heidmann Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:14920-14925; Mangeney et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(51):20534-9].

В рамках изобретения структуры, ответственные за антигенность мутантного лентивирусного белка ENV, по существу сохранены.

Как подразумевается в настоящем описании, выражение "структуры, ответственные за антигенность" относится к структурам белка, которые ответственны за взаимодействие с компонентами иммунной системы, такими как антитела или мембранные рецепторы иммунных клеток, в частности, T-клеток.

Мутация(и) в иммунодепрессивном домене лентивирусных белков ENV является (являются) достаточной для снижения иммунодепрессивной активности мутантного лентивирусного белка ENV относительно соответствующего ENV дикого типа. Однако может быть преимущественным, чтобы другая аминокислота также была мутантной, поскольку это обеспечивает то, что структура мутантного белка ENV является по существу консервативной относительно соответствующего белка ENV дикого типа.

Мутантный лентивирусный белок ENV обладает по существу сохраненной структурой, особенно антигенной структурой, например, иммуногенными детерминантами, исходного определенного лентивирусного белка ENV, т.е. немутантного лентивирусного белка ENV дикого типа.

Эти свойства можно оценивать путем определения свойства слияния и/или инфекционных свойств указанного мутантного лентивирусного ENV относительно тех же свойств немутантного лентивирусного белка ENV дикого типа (см. пример).

В общем, мутантный белок ENV по настоящему изобретению обладает средней длиной от приблизительно 700 до приблизительно 950 аминокислот.

Изобретение охватывает фрагменты мутантного белка ENV, как определено выше, при условии, что указанный фрагмент:

- содержит по меньшей мере последовательность SEQ ID NO: 2, как определено выше,

- содержит по меньшей мере 40 аминокислот, предпочтительно содержит по меньшей мере 50 аминокислот,

- по существу лишен иммунодепрессивных свойств, как определено выше,

- предпочтительно, содержит внеклеточные части белка ENV,

- сохраняет структуру белка ENV, из которого он происходит,

- обладает теми же эпитопами, что и соответствующий фрагмент в белке ENV дикого типа.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления фрагмент мутантного белка ENV по изобретению может содержать приблизительно 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 аминокислот. Эти величины приведены только для иллюстрации, поскольку квалифицированному специалисту понятно, что фрагмент может содержать любое количество аминокислот от 40 до 700.

Преимущественно, фрагменты по изобретению являются такими, что, при сохранении антигенной структуры полноразмерного мутантного белка ENV и, таким образом, белка ENV дикого типа, в них утрачены основные антигенные области, которые ответственны за антигенность в области, отличной от области, соответствующей иммунодепрессивному домену.

Также изобретение относится к фармацевтической композиции, где активное вещество представляет собой выделенный не встречающийся в природе мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны, по существу не обладающий иммунодепрессивной активностью, как определено выше, или его фрагменты.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, как определено выше, содержащей в качестве активного вещества:

a) выделенный мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны, по существу не обладающий иммунодепрессивной активностью,

причем указанный мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны получен в результате мутации трансмембранной (TM) субъединицы лентивирусного белка ENV человека или обезьяны дикого типа,

указанный мутантный лентивирусный белок ENV человека или обезьяны содержит мутантный иммунодепрессивный домен (ISU), содержащий следующую аминокислотную последовательность:

A-[I/V]-E-[K/R]-X_a-X_b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

где

X обозначает любую аминокислоту,

и либо

X_a представляет собой A, F, G, L или R, и X_b представляет собой C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y, либо

X_a представляет собой C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y, и X_b представляет собой A, F, G или R, либо

X_a представляет собой A, F, G, L или R, и X_b представляет собой A, F, G или R,

или

b) по меньшей мере один фрагмент ук