Углеродный сорбент с биоспецифическими свойствами и способ его получения

Углеродный сорбент с биоспецифическими свойствами и способ его получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к технологии получения углеродных сорбентов с антибактериальными и антимикотическими свойствами на основе пористых углеродных адсорбентов и предназначено для применения в медицине и ветеринарии.

Интенсивное и нерациональное применение антибиотиков при профилактике и лечении различных инфекционных заболеваний является ключевым фактором развития резистентности (устойчивости) патогенных микроорганизмов [Antimicrobial resistance: global report on surveillance. 2014. Электронный ресурс: http://www.who.int/entity/drugresistance/publications/infographic-antimicrobial-resistance-20140430]. Поэтому разработка новых углеродных сорбентов с выраженными антибактериальными и антимикотическими свойствами является актуальной задачей.

Углеродные сорбенты являются эффективными сорбционными материалами, так как обладают развитой пористой структурой и применяются в медицине для детоксикации организма при гемо-, энтеро-, вульнеросорбции (аппликационной сорбции) [Суровикин В.Ф., Пьянова Л.Г., Лузянина Л.С. Новые гемо- и энтеросорбенты на основе нанодисперсных углерод-углеродных материалов // Российский химический журнал. - 2007. - T. LI. - №5. - С. 159-165; Рачковская Л.Н. Углеродминеральные сорбенты для медицины. - Новосибирск, 1996. - 234 с.; Баринов С.В. Разработка углеродных сорбентов и перспективы их применения в акушерской практике: монография / С.В. Баринов, Л.К. Герунова, Ю.И. Тирская, Л.Г. Пьянова, О.Н. Бакланова, В.А Лихолобов. - Омск: Изд-во ИП Макшеевой Е.А., 2015, - 132 с.].

Химическое модифицирование поверхности углеродного сорбента позволяет повысить его биоспецифические свойства: антибактериальные, антимикотические и др.

В качестве модификаторов углеродного сорбента были выбраны наиболее используемые и распространенные гидроксикислоты: гликолевая кислота (ГК) и молочная кислота (МК).

Данные гидроксикислоты способны вступать в реакцию поликонденсации с образованием биосовместимых, биодеградируемых алифатических полиэфиров полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты или сополимера молочной и гликолевой кислот. Преимущества этих соединений - регулируемые физико-химические и механические свойства, биосовместимость, нетоксичность, способность к биоразложению, проявление антибактериальных свойств, снижение pH среды [Полимеры в биологии и медицине / Коллектив авторов / Под ред. Майка Дженкинса // Пер. с англ. О.И. Киселева; науч. ред. Н.Л. Клячко. - М.: Научный мир, 2011; Ozdil D., Aydin Н.М. Polymers for medical and tissue engineering applications (Review) // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2014. V. 89. P. 1793-1810; Chenjie Wang, Tong Chang, Hong Yang, Min Cui Antibacterial mechanism of lactic acid on physiological and morphological properties of Salmonella Enteritidis, Escherichia coli and Listeria monocytogenes // Food Control. 2015. 47. P. 231-236; патент RU 2459620.2012].

Они используются в качестве носителей лекарственных средств, в составе имплантов, шовных хирургических нитей, раневых покрытий [Кузнецова И.Г., Северин С.Е. Использование сополимера молочной и гликолевой кислот для получения наноразмерных лекарственных форм // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2013. №4 (5). С. 30-36; Lasprilla Astrid J.R., Martinez Guillermo A.R., Lunelli Betania H. et al. Poly-lactic acid synthesis for application in biomedical devices // Biotechnology Advances. 2012. №30. P. 321-328].

Наиболее близким к предлагаемому сорбенту и способу его получения является углеродный сорбент с антибактериальными и антимикотическими свойствами в виде гранул округлой формы, который содержит полигликолид в количестве не менее 5%, характеризуется удельной адсорбционной поверхностью не более 250 м²/г и общим объемом пор не более 0,50 см³/г. Способ получения углеродного сорбента с антибактериальными и антимикотическими свойствами включает пропитку гранул углеродного гемосорбента 10-50% раствором гликолевой кислоты в течение 7-9 часов при комнатной температуре, соотношение гемосорбент: раствор ГК составляет 1:1. Затем проводится сушка в течение часа при 100-110°C. Поликонденсация гликолевой кислоты на углеродном сорбенте протекает в две стадии: при температуре 185-205°C в течение 1 часа, а затем при температуре 215-235°C - не менее 5 часов (патент RU 2541103, 2015, прототип).

Целью изобретения является разработка углеродного сорбента с антибактериальной и антимикотической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам.

Предлагаемый способ получения углеродного сорбента включает пропитку гранул углеродного гемосорбента раствором модификатора, при соотношении гемосорбент: раствор модификатора 1:1, с последующей термообработкой, причем в качестве модификатора используют смесь гликолевой и молочной кислот при соотношении гликолевая кислота: молочная кислота 70:30 или 20-50% водный раствор молочной кислоты, пропитку проводят в течение 20-24 ч, а термообработку проводят в три стадии: при температуре 105-135°C в течение 1-2 ч, при температуре 145-175°C в течение 4-13 ч и при температуре 165-185°C в течение 6-20 ч.

Предлагаемый углеродный сорбент с антибактериальной и антимикотической активностью представляет собой гранулы округлой формы, содержит сополимер гликолевой и молочной кислот или олигомер молочной кислоты в количестве не менее 20%, характеризуется удельной адсорбционной поверхностью не более 120 м²/г и общим объемом пор не более 0,35 см³/г.

В качестве исходного материала использован углеродный гемосорбент ВНИИТУ-1 с развитой удельной адсорбционной поверхностью 300-400 м³/г; суммарным объемом пор не менее 0,4 см³/г, с содержанием минеральных примесей не более 0,15%.

Процесс модифицирования проводится в несколько стадий:

- пропитка гранул углеродного сорбента раствором гидроксикислот (смесью молочной и гликолевой кислот; молочной кислотой) различной концентрации при соотношении сорбент: раствор гидроксикислот 1:1 (по объему) в статических условиях при комнатной температуре в течение 20-24 ч;

- термообработка сорбента при нормальном давлении на воздухе при температуре 105-135°C в течение 1-2 ч и при температуре 145-175°C в течение 4-13 ч, а затем при температуре 165-185°C в токе аргона в течение 6-20 ч в трубчатой печи.

Модифицирование углеродного сорбента по предлагаемому способу выбранными модификаторами (смесью молочной и гликолевой кислот или только молочной кислотой) с их последующей поликонденсацией приводит к значительному снижению удельной площади поверхности и суммарного объема пор, увеличению содержания кислорода в элементном составе, изменению качественного состава функциональных групп сорбента. Стадии пропитки и продолжительной термообработки главным образом влияют на изменение физико-химических свойств исходного сорбента.

Результаты, иллюстрирующие изменения параметров пористой структуры и химического состава образцов углеродного сорбента, полученных по прототипу и после модифицирования смесью ГК и МК или МК, в соответствии с примерами настоящего изобретения, приведены в таблице 1.

Свойства модифицированных сорбентов изучены комплексом физико-химических методов: методом низкотемпературной адсорбции азота определены основные текстурные характеристики (удельная адсорбционная поверхность, суммарный объем пор и распределение пор по размерам); изотермы адсорбции-десорбции азота (Т=77,4 К) получены на анализаторе Gemini-2380 (Micromeritics, США); расчет величины удельной площади поверхности проведен по уравнению БЭТ.

Изучена возможность десорбции (миграции) сополимеров гидроксикислот с поверхности модифицированного сорбента при контакте модифицированного сорбента с физиологическим 0,9% раствором NaCl (рНисх=6,3-6,5) в течение 30 суток методом ЯМР ¹Н спектроскопии на ЯМР спектрометре «Avance-400» (Bruker, США) по соответствующим методикам (фиг. 1). Исследование показало, что для образца углеродного сорбента, модифицированного смесью гликолевой и молочной кислот, в раствор переходит около 0,9% ГК и 0,1% МК (сигналы невысокой интенсивности при 1-2 и 4 м.д. соответствуют гидроксикислотам; широкие пики в области 4-6 м.д. относятся к сигналу воды). Также зарегистрированы сигналы димеров в количестве менее 0,5%, являющиеся продуктами гидролиза сополимера ГК и МК. Уровень pH снижается до 3,5-3,6.

Изучение десорбции олигомеров молочной кислоты с модифицированных образцов проводили при температуре 37±1°C (модельные условия) [Gorrasi G., Pantani R. // Polymer degradation and Stability. 2013. V. 98. P. 1006-1014]. Для образцов углеродного сорбента, модифицированных олигомером молочной кислоты, после контакта с 0,9% раствором NaCl в течение 30 суток в раствор переходит до 10% МК с примесью димера, тримера (фиг. 2). Уровень pH снижается до 1,7-1,9.

Методами pH-метрии установлено, что при контакте модифицированных сорбентов с физиологическим раствором происходит постепенное снижение pH раствора от 6,4 до 1,8: полимерные цепи расщепляются путем гидролиза сложноэфирных связей до мономерных звеньев. Таким образом, при контакте модифицированных сорбентов с физиологическим раствором происходит постепенная десорбция (миграция) модификатора в виде моно-, ди- и тримеров с поверхности сорбента (пролонгированное действие материала).

Метод термического анализа позволяет непосредственно контролировать процесс модифицирования углеродного сорбента, а также зарегистрировать продукты поликонденсации гидроксикислот на его поверхности, количественно оценить их массу. Термический анализ (ТГ-ДТГ-ДТА) исследуемых сорбентов проводили на приборе DTG-60Н (SHIMADZU, Япония). Разложение нанесенного сополимера гликолевой и молочной кислот происходит в области температур 340-370°C (потеря массы 45%). Разложение нанесенного олигомера молочной кислоты происходит при температуре 350-400°C. С ростом концентрации раствора МК от 20 до 50% происходит потеря массы образца от 20 до 50 мас. %. Полученные результаты согласуются с литературными данными о свойствах сополимера ГК и МК, олигомера МК [Wang N., Wu X. S. et al. Syntheses, characterization, biodegradation and drug delivery application of biodegradable lactic/glycolic acid polymers // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2000. V. 11. №3. P. 301-318; Poly(lactic acid): Synthesis, Structures, Properties, Processing, and Applications / Edited by R.A. Auras, L.-T. Lim, S.E.M. Selke, H. Tsuji. - New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. 2010. - 528 р.]. Метод термического анализа подтверждает полноту протекания процесса модифицирования углеродного сорбента гидроксикислотами.

Таким образом, комплексом физико-химических методов установлено, что в выбранных условиях процесс модифицирования углеродного сорбента гидроксикислотами с их последующей поликонденсацией приводит к образованию сополимера гликолевой и молочной кислот или олигомера молочной кислоты на углеродной поверхности. Разработанный способ модифицирования углеродных сорбентов позволяет получить материалы с регулируемыми характеристиками (количество нанесенного модификатора, удельная площадь поверхности, объем пор, состав функциональных групп углеродного сорбента и др.). Отличительной особенностью предложенного способа синтеза является проведение процесса поликонденсации гидроксикислот без применения катализаторов или растворителей, проявляющих токсичность.

Высокие антибактериальные и антимикотические свойства модифицированных образцов углеродного сорбента объясняются кислотно-основными свойствами нанесенных гидроксикислот: при контакте олигомера с биологической средой снижается pH, происходит локальное «закисление» среды за счет процесса гидролиза образованного на сорбенте сополимера ГК и МК или олигомера МК (результаты исследования pH-метрии и ЯМР спектроскопии), что является губительным фактором для жизнедеятельности патогенных микроорганизмов.

Проведены стендовые микробиологические испытания исследуемых сорбентов в Центральной научно-исследовательской лаборатории и на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Антибактериальные свойства исследуемых сорбентов изучали по отношению к микроорганизмам грамположительных, грамотрицательных патогенных бактерий и к смеси этих культур, предварительно исследованных на устойчивость к антибиотикам. Антимикотические свойства сорбентов оценивали по отношению к патогенным дрожжеподобным грибам. Согласно полученным результатам используемые микроорганизмы были антибиотикорезистентны.

В микробиологических исследованиях использовали:

- грамположительные микроорганизмы: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis;

- грамотрицательные микроорганизмы: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus;

- дрожжеподобные грибковые культуры рода Candida: Candida albicans и Candida krusei;

- смеси бактериальных культур: St.aureus + Ps.aeruginosas St. aureus + Kl.pneumoniae; St. aureus + Es.coli; St. aureus + Kl.pneumoniae+Ps. aeruginosae + Es. coli; St. aureus + Kl.pneumonia+Es. coli; St. aureus+Ps. aeruginosae + Kl.pneumoniae; Es. coli + Ps.aeruginosae; Es. coli + Kl pneumonia; Ps. aeruginosae + Kl. pneumonia.

- бактериально-грибковая ассоциация культур: S. aureus + С.albicans.

Идентификацию микроорганизмов проводили на тест-системах производства PLIVA - Lachema Diagnostica (Чехия) в компьютерной программе «МИКРОБ Автомат». Все исследуемые смеси испытуемых культур готовили смешением равных объемов приготовленных рабочих концентраций микробных клеток с перемешиванием. Перемешивание смеси культур осуществляли на вортекс-встряхивателе (ELMI, Латвия).

Для оценки антибактериальных и антимикотических свойств углеродных сорбентов использовали метод прямого посева на питательные среды, а также диско-диффузионный метод (агар-диффузионный метод) [www.eucast.org] по разработанным методикам. Чтобы оценить эффективность немодифицированных и модифицированных углеродных сорбентов, в каждом случае измеряли диаметр зоны задержки (подавления) роста микроорганизмов. В случаях, если диаметр зоны задержки роста микробов составлял от 10 до 15 мм, считают, что сорбент проявляет слабое антибактериальное, антимикотическое действие. Если диаметр зоны подавления роста составлял от 15 до 20 мм, то сорбент обладает умеренно выраженным действием. При диаметре зоны подавления роста более 20 мм считают, что сорбент проявляет сильно выраженные биоспецифические свойства. Отсутствие зоны задержки роста микробов вокруг дисков свидетельствовало об отсутствии у сорбентов антибактериальных или антимикотических свойств.

Рабочее разведение для опыта методом прямого посева: бактериальные клетки ~10³ КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл, культуры рода Candida - 280-360 КОЕ в 1 мл. Контролем служили посевы рабочих разведений испытуемых культур. Рабочее разведение для опыта агар-диффузионным методом: бактериальные клетки - 0,5 по McFarland 1,5*10⁸ КОЕ в 1 мл; культуры рода Candida - 500×10⁶ КОЕ/мл.

Концентрацию микробных клеток устанавливали на приборе для определения мутности суспензий Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema, Италия).

Стерилизацию сорбентов перед проведением стендовых медико-биологических испытаний проводили насыщенным паром при избыточном давлении 0,11±0,02 МПа и температуре (121±1)°C в автоклаве.

Результаты стендовых микробиологических испытаний исследуемых образцов углеродного сорбента приведены в таблице 2.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (прототип).

Навеску гемосорбента массой 3 г пропитывают 10% раствором ГК при соотношении гемосорбент: раствор ГК 1:1 (по объему) в течение 8 часов при комнатной температуре, затем сушат пропитанный сорбент в течение 1 часа при температуре 103-105°C. После сушки проводят поликонденсацию ГК на углеродном сорбенте в две стадии: при температуре 195±5°C в течение 1 часа и при температуре 225±5°C последующие 5 часов, на песчаной бане. Основные характеристики данного образца приведены в таблице 1.

Для сорбента, модифицированного данным способом, проводят микробиологические испытания по отношению к патогенным микроорганизмам.

К модифицированному сорбенту (в объеме 0,5 мл) добавляют 1 мл микробной взвеси микроорганизмов, встряхивают на вортекс-встряхивателе и выдерживают в течение суток. По истечении 24 ч контакта сорбента с патогенной культурой отбирают насадочную жидкость в количестве 50 мкл и высевают на стерильные пластины чашек Петри с питательной средой ГМФ агар (мясо-пептонный агар) для бактерий, для грибов - «Сабуро». Засеянные чашки Петри с посевами помещают в CO₂-инкубатор 15АС вверх дном и инкубируют: бактерии при температуре 37±1°C в течение 24±2 часов, дрожжеподобные грибы - 48-72 часа.

Подсчет выросших колоний проводят по трафарету визуально в 5-ти полях по 1 см² с перерасчетом на площадь чашки (диаметр 90 мм). Результат оценивают по количеству КОЕ на поверхности, сопоставляя с контролем (концентрацию устанавливают на приборе для определения мутности). Результат выражают числом КОЕ в 1 мл исследуемой пробы.

Проводят по три параллельных испытания и за результат испытаний принимают среднее значение.

Сорбент, модифицированный данным способом, обладает антибактериальным действием по отношению к грамположительным и грамотрицательным монокультурам St. aureus, Ps. aeruginosa, Kl. pneumonia, E.coli и их смесям (бактерии чувствительны при времени контакта не менее 3 часов, к смеси St. aureus, Ps. aeruginosa - не менее 1 часа). Установлено, что модифицированный сорбент проявляет также антимикотические свойства по отношению к патогенным дрожжеподобным грибам С.albicans и С.krusei при времени контакта не менее 3 и 1 часа соответственно (таблица 2).

Результаты исследований диско-диффузионным методом свидетельствуют о том, что образец, полученный по примеру 1, проявляет преимущественно умеренную биоспецифическую активность по отношению к патогенным микроорганизмам (диаметр зоны задержки роста культуры 15-20 мм).

Пример 2.

Навеску гемосорбента массой 3 г пропитывают смесью ГК и МК с соотношением ГК:МК 70:30 мас. % в течение 24 ч при комнатной температуре при соотношении гемосорбент: смесь ГК и МК 1:1 (по объему), затем проводят термообработку в три стадии: на воздухе на масляной бане в течение 1 ч при температуре 110±5°C и при температуре 170±5°C в течение 13 ч, затем в токе аргона в трубчатой печи при температуре 180±5°C в течение 6 ч. Основные характеристики данного образца приведены в табл. 1.

Для сорбента, модифицированного данным способом, проводят микробиологические испытания по отношению к патогенным микроорганизмам по примеру 1.

Образец, модифицированный по примеру №2, проявляет антибактериальную активность по отношению к патогенным монокультурам St. aureus, Ps. aeruginosa, E.coli, Kl. pneumoniae и их смесям, а также активен по отношению к антибиотикорезистентной грамотрицательной бактерии Ac. calcoaceticus (возбудитель тяжелых инфекционных заболеваний, включая менингит, бактериальный эндокардит, пневмонию, сепсис и т.д.) и в отношении антибиотикорезистентных дрожжеподобных грибов рода С.krusei (возбудитель внутрибольничных инфекций, кандидоза, кандидозного перитонита и др.). Антибактериальное и антимикотическое действие данного образца отмечается уже после первого часа контакта с микроорганизмами.

Результаты исследований диско-диффузионным методом свидетельствуют о том, что образец, полученный по примеру 2, проявляет сильно выраженную биоспецифическую активность по отношению к патогенным микроорганизмам (диаметр зоны задержки роста культуры в большинстве случаев более 20 мм).

Пример 3.

Навеску гемосорбента массой 3 г пропитывают 50% раствором молочной кислоты в течение 24 ч при соотношении сорбент: раствор МК 1:1 (по объему) при комнатной температуре. Затем проводят термообработку сорбента в три стадии: на песчаной бане при температуре 130±5°C в течение 2 ч, при температуре 150±5°C в течение 4 ч и при температуре 170±5°C в течение 20 ч в токе аргона в трубчатой печи. Основные характеристики данного образца приведены в таблице 1.

Для сорбента, модифицированного данным способом, проводят микробиологические испытания по отношению к патогенным микроорганизмам по примеру 1.

Образцы углеродного сорбента, модифицированного данным способом, проявляют слабую антибактериальную активность по отношению к микроорганизмам Ас.Calcoaceticus. Умеренно выраженную антибактериальную активность сорбент проявляет по отношению к бактерии Е. faecalis и к смесям патогенных микроорганизмов (таблица 2).

Отличительной особенностью образца, полученного по примеру 3, является сильно выраженное антимикотическое действие по отношению к культурам дрожжеподобных грибов рода Candida и к бактериально-грибковой ассоциации культур St.aureus + C.albicans. Это подтверждают результаты исследований, полученные диско-диффузионным методом: диаметр зоны задержки роста культуры более 20 мм.

Пример 4.

Аналогичен примеру 2, но пропитку проводят в течение 5 часов.

Пример 5.

Аналогичен примеру 2, но термообработку сорбента проводят в одну стадию.

Пример 6.

Аналогичен примеру 3, но для пропитки используют 20% водный раствор молочной кислоты.

Пример 7.

Аналогичен примеру 3, но термообработку сорбента проводят в две стадии.

Как следует из примеров и таблиц, углеродный сорбент, модифицированный смесью гликолевой и молочной кислот или только молочной кислотой, проявляет высокую антибактериальную и антимикотическую активность по отношению к патогенным микроорганизмам: грамположительным и грамотрицательным бактериям St.aureus, St.epidermidis, St.pyogenes, Str.agalactiae, E. faecalis, Ps. aeruginosa, E.coli, Kl.pneumoniae, и их смесям; грамотрицательной бактерии Ac.calcoaceticus; дрожжеподобным грибам С.krusei и С.albicans. Согласно анализу таблицы 2, образцы, модифицированные по примеру 2 и 3, отличаются от прототипа более выраженными антибактериальными и антимикотическими свойствами в отношении патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida (возбудитель инфекционных заболеваний в акушерстве, гинекологии, внутрибольничных инфекций), грамотрицательной бактерии Ac. calcoaceticus (возбудитель инфекционных процессов, включая менингиты, бактериальный эндокардит, сепсис и т.д.), а также по отношению к ассоциациям патогенных микроорганизмов, которые чаще всего встречаются в клинической практике.

Таким образом, разработанный способ модифицирования углеродного сорбента позволяет получить материал с более высокими антибактериальными и антимикотическими свойствами. Предлагаемый углеродный сорбент представляет большой интерес для медицины, в том числе ветеринарной, так как расширяет возможности сорбционной терапии в клинической практике. Модифицированные сорбенты найдут широкое применение в лечении желудочно-кишечных заболеваний, акушерско-гинекологической и хирургической патологии как антимикробные, детоксицирующие изделия медицинского назначения и лекарственные средства.

1. Способ получения углеродного сорбента с антибактериальной и антимикотической активностью, включающий пропитку гранул углеродного гемосорбента раствором модификатора, при соотношении гемосорбент:раствор модификатора 1:1, с последующей термообработкой, отличающийся тем, что в качестве модификатора используют смесь гликолевой и молочной кислот при соотношении гликолевая кислота : молочная кислота 70:30 или 20-50% водный раствор молочной кислоты, в качестве углеродного гемосорбента используют сорбент с развитой удельной адсорбционной поверхностью 300-400 м³/г, суммарным объемом пор не менее 0,4 см³/г, пропитку проводят в течение 20-24 ч, а термообработку проводят в три стадии: при температуре 105-135°C в течение 1-2 ч, при температуре 145-175°C в течение 4-13 ч и при температуре 165-185°C в течение 6-20 ч.

2. Углеродный сорбент с антибактериальной и антимикотической активностью, в виде гранул округлой формы, отличающийся тем, что получен способом по п. 1, содержит сополимер гликолевой и молочной кислот или олигомер молочной кислоты в количестве не менее 20%, характеризуется удельной адсорбционной поверхностью не более 120 м²/г и общим объемом пор не более 0,35 см³/г.