Получение вирусоподобной частицы вируса бешенства в растениях

Получение вирусоподобной частицы вируса бешенства в растениях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к получению нативных вирусных белков в растениях. В частности, настоящее изобретение также относится к получению вирусоподобных частиц, содержащих нативный структурный белок вируса бешенства, в растениях. Техническим результатом заявленного изобретения является получение вирусоподобных частиц вируса бешенства (VLP) в растении, и применение указанных VLP для индукции защитного иммунного ответа против инфекции, вызванной вирусом бешенства.

Уровень техники

Вакцинация обеспечивает защиту от заболеваний, вызванных инфекционным агентом, путем индукции субъекта для установления защиты перед инфекцией. Обычно это выполняется посредством применения живых ослабленных или цельных инактивированных форм инфекционных агентов в качестве иммуногенов. Для того, чтобы избежать опасности использования цельного вируса (например, убитых или ослабленных вирусов) в качестве вакцины, рекомбинантные вирусные белки, например субъединицы, используют в качестве вакцин. Как пептидные, так и субъединичные вакцины подвержены ряду потенциальных ограничений. Субъединичные вакцины могут проявлять слабую иммуногенность вследствие неправильного сворачивания, слабой презентации антигена или различий в углеводном и липидном составе. Главной проблемой является трудность гарантии того, что конформация сконструированных белков имитирует конформацию антигенов в их природном окружении. Пригодные адъюванты и, в случае пептидов, белки-носители должны использоваться для стимулирования иммунного ответа. Кроме того, эти вакцины индуцируют прежде всего гуморальные ответы и, следовательно, могут не вызывать эффективного иммунитета. Субъединичные вакцины часто являются неэффективными в отношении заболеваний, в которых инактивированный цельный вирус может продемонстрировать обеспечение защиты.

Вирусоподобные частицы (VLP) являются потенциальными кандидатами для включения в иммуногенные композиции. Вирусоподобные частицы (VLP) имеют сходство со зрелыми вирионами, но не содержат генетический материал вируса. Таким образом, VLP являются нереплицируемыми по природе, что делает их безопасными для введения в качестве вакцины. Кроме того, VLP могут быть сконструированы для экспрессии вирусных гликопротеинов на поверхности VLP, что является их самой нативной физиологической конфигурацией. Более того, так как VLP имеют сходство с интактными вирионами и представляют собой поливалентные дисперсные структуры, VLP могут быть более эффективными в отношении индукции нейтрализующих антител к гликопротеину, чем растворимые оболочечные белковые антигены.

В настоящее время VLP получены для более 30 различных вирусов, которые инфицируют человека и других животных. Одной из самых поразительных особенностей этой группы является то, что группа сильно различается по структуре отдельных вирусов. Группа включает вирусы, которые содержат один капсидный белок, множество каспидных белков, а также вирусы с липидными оболочками и без них.

Технические трудности формирования VLP для вирусов с липидной оболочкой отличаются от трудностей формирования VLP для вирусов со множеством капсидов. Для этих вирусов выбор системы экспрессии может быть важным для эффективности формирования VLP. Например, вирус Хантаан легко формирует VLP, когда экспрессируется в клетках млекопитающего из вектора на основе вируса осповакцины, но формирование VLP является относительно неэффективным в клетках насекомых (Betenbaugh М с соавт. 1995, Virus Res. 38, 111-124).

Вирус бешенства (RV) является членом семейства рабдовирусов (Rhabdoviridae). Как и большинство членов данного семейства, вирус бешенства (RV) представляет собой вирус, содержащий нефрагментированную негативную однонитевую РНК, чей геном кодирует пять вирусных белков: РНК-зависимую РНК-полимеразу (L); нуклеопротеин (N); фосфорилированный белок (Р); матриксный белок (М), локализованный на внутренней стороне оболочки вирусного белка; и гликопротеин (G), локализованный на внешней поверхности вируса. (Dietzschold B с соавт., 1991, Crit. Rev. Immunol. 10:427-439.)

Вакцины против бешенства, полученные на культуре клеток, ограничены выращиванием инактивированных штаммов вируса в культурах клеток. Эти вакцины содержат вирус, выращенный в культурах клеток. Существующие в настоящее время биотехнологические подходы направлены на экспрессию гена поверхностного белка вируса бешенства для разработки безопасного рекомбинантного белка, который может быть использован в качестве активной вакцины. Стабильная экспрессия гликопротеина вируса бешенства была показана в клетках яичника китайского хомячка (Burger с соавт., 1991, J Gen Virol., Feb; 72 (Pt 2):359-67). Был получен гликозилированный белок полной длины 67К, который комигрировал с G-белком, выделенным из инфицированных вирусом клеток.

Экспрессия гена гликопротеина вируса бешенства бакуловирусными векторами в клетках насекомых дает выходы белка до 18% от общего клеточного белка через 48 часов после заражения. Prehaud D Н с соавт., (1989, Virology, Dec; 173(2):390-9) описывает помещение последовательности, кодирующей G-белок штамма CVS, под контроль промотора полигедрина AcNPV и экспрессию конструкции с использованием линии клеток Spodoptera fugiperda. Белок, полученный от насекомых, проявил измененную электрофоретическую подвижность по сравнению с диким типом вследствие различий в гликановых компонентах.

Rupprecht с соавт. (1993, Vaccine, 11(9):925-8) демонстрирует, что гликопротеин (штамм ERA), полученный из рекомбинантных инфицированных бакуловирусом клеток насекомых, является эффективным в качестве пероральной вакцины у енотов. В WO/1993/001833 описано получение вирусоподобных частиц (VLP) в бакуловирусной системе экспрессии, содержащей РНК-геном, включающий 3' домен и филлер-домен, окруженный оболочкой N-белка вируса бешенства и М-белка вируса бешенства. Вирусоподобная частица (VLP) также включает липидную оболочку G-белка вируса бешенства. Ввиду относительно высокой стоимости систем на основе клеток насекомых и млекопитающих, указанные системы не являются предпочтительными для экспрессии G-белка как стратегии для разработки вакцины против вируса бешенства.

McGarvey с соавт. (1995, Bio/Technology Vol. 13, No. 13, pp. 1484-1487) описывает трансформацию котиледонов томатов с использованием кДНК полной длины, кодирующей гликопротеин G вируса бешенства (штамм ERA) под управлением промотора 35S' вируса мозаики цветной капусты. Белок был экспрессирован в томатах и характеризовался молекулярной массой 62 и 60 kDa по данным вестерн-блоттинга после иммунопреципитации по сравнению с 66 kDa, наблюдаемой для G-белка из вируса, выращенного в клетках ВНК. Предполагается, что различие в молекулярной массе по сравнению с природным гликопротеином обусловлено посттрансляционной модификацией белка (протеолитическое расщепление и/или модифицированное гликозилирование). Было обнаружено, что количество иммунопреципитированного G-белка составило приблизительно 1-10 нг/мг растворимого белка, т.е. от 0.0001% до 0.001% растворимого белка. Низкий уровень экспрессии может быть обусловлен использованием слабо разработанного гена. Например, ген, кодирующий нативный G-белок, использовали вместе с его нативным сигнальным пептидом.

Иммунный ответ растений на заболевания, такие как энтерит норок и бешенство, отражался экспрессией вирусных эпитопов на поверхности вирусов растений после заражения восприимчивого хозяина рекомбинантным модифицированным вирусом (Modelska с соавт., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2481-2485; Yusibov с соавт., 2002, Vaccine 20:3155-3164). Размер антигенного полипептида, экспрессирующегося на поверхности вирусного вектора, был ограничен 37 аминокислотами, и требовалось эпитопное картирование антигена. Такое глубокое знание антигена обычно недоступно, особенно в отношении вновь открытых заболеваний, в которых экспрессия белков полной длины может являться единственным выбором. В отдельных случаях могут потребоваться множественные эпитопы для обеспечения приемлемой защиты от заражения патогенным вирусом. Кроме того, заражение может рассматриваться как значительная проблема на сельскохозяйственном уровне, особенно в случае применения стабильных в окружающей среде вирусов растений, например, вируса мозаики табака (Tobacco Mosaic Virus).

В WO 97/43428 описан способ получения в растениях гликопротеина G вируса бешенства или вируса, родственного вирусу бешенства. Конструкция включала последовательность, кодирующую химерный G-белок, содержащий зрелый вирусный G-белок с N-концевым сигнальным пептидом, отличным от пептида, естественным образом связанного с вирусным G-белком. Гликопротеин имел молекулярную массу приблизительно 66 kDa и являлся практически нерастворимым. Детергенты, такие как додецилсульфат натрия (SDS) или Тритон Х-100, были необходимы для экстракции и растворения гликопротеина. Авторы сделали вывод о том, что «нерастворимый» гликопротеин относился к присутствию С-концевого трансмембранного домена (участка из примерно от 40 до 60 аминокислот, расположенного на карбоксильном конце гликопротеина), который является важным для защитной реакции при использовании гликопротеина в качестве вакцины.

Оболочечные вирусы могут приобрести свою липидную оболочку при «отпочковывании» из инфицированной клетки, а мембрану из плазматической мембраны или из мембраны внутренних органелл. Например, во время процесса сборки в рабдовирусах комплекс N-P-L заключает в оболочку однонитевую геномную минус-РНК с образованием сердцевины рибонуклеопротеина (RNP). М-белок формирует капсулу или матрикс вокруг RNP, и комплекс RNP-M мигрирует в область плазматической мембраны, содержащей гликопротеиновые вставки. М-белок инициирует скручивание, и комплекс M-RNP связывается с гликопротеином, после чего готовый вирус выходит путем почкования из плазматической мембраны.

В центральной нервной системе (CNS) существует избирательный выход вирусных частиц путем почкования из плазматических мембран. Напротив, в слюнных железах вирус выходит путем почкования в основном из клеточной мембраны в ацинарный просвет. Вирусное почкование в слюнную железу и индуцированное вирусом агрессивное поведение хозяина-животного увеличивает шансы вирусной инфекции у нового хозяина. В системах на основе клеток млекопитающих или бакуловирусов, например, вирус бешенства почкуется из плазматической мембраны. Известно лишь несколько оболочечных вирусов, способных инфицировать растения (например, члены семейства топовирусов и рабдовирусов). Среди известных оболочечных вирусов растений они характеризуются почкованием из внутренних мембран клеток-хозяев, а не из плазматической мембраны. Однако рекомбинантные VLP были получены в растениях-хозяевах из плазматической мембраны (WO 2011/035422; которая включена в настоящий документ путем отсылки).

Сборка/почкование в рабдовирусах управляется главным образом матриксным (М) белком. Белок М содержит поздний домен почкования, который опосредует рекрутинг белков хозяина, связанный с путем вакуолярной сортировки белков клетки, для облегчения разделения вирус-клетка. Без привязки к какой-либо теории полагают, что почкование оболочечных вирусов из клеточных мембран зависит от присутствия трансмембранных шиповидных белков, взаимодействующих с цитоплазматическими компонентами вируса. Например, клетки, инфицированные мутантами вируса бешенства, которые были лишены гликопротеина G или цитоплазматического концевого сегмента G-белка, высвобождали лишенные шиповидных отростков частицы рабдовируса, показывая, что вирусный поверхностный белок не требуются для управления процессом почкования. (Mebatsion Т. С соавт., 1996, Cell, Маr 22:84(6):941-51). Напротив, инфекционные частицы, продуцированные мутантами вируса бешенства, лишенными М-белка, были преимущественно связанными с клетками, и выход бесклеточного инфекционного вируса был уменьшен не меньше чем в 500000 раз. Это демонстрирует значительную роль М-белка в почковании вируса. Супернатанты, полученные из клеток, инфицированных вирусом бешенства, лишенным М-белка, содержат скорее длинные палочкообразные вирионы, а не обычные пулеобразные частицы рабдовируса, дополнительно подтверждая нарушение процесса формирования вируса. Комплементация с М-белком, экспрессирующимся с плазмид, восстанавливала формирование рабдовируса. Таким образом, белок М играет важную роль в сжатии и нацеливании RNP на плазматическую мембрану, а также во встраивании G-белка в почкующиеся вирионы. (Mebatsion Т. С соавт., 1999, J Virol Jan; 73(1):242-50).

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к получению нативных вирусных белков в растениях. В частности, настоящее изобретение также относится к получению вирусоподобных частиц, содержащих нативный структурный белок вируса бешенства, в растениях.

В соответствии с настоящим изобретением предложен способ (А) получения вирусоподобной частицы (VLP) вируса бешенства в растениях, включающий:

a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первый регуляторный участок, активный в растении, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нативный структурный белок вируса бешенства, в растение или часть растения,

b) инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, VLP вируса бешенства.

Нативный структурный белок вируса бешенства может представлять собой гликопротеин. В случае, если нативный структурный белок вируса бешенства представляет собой не М-белок, то способ (А), описанный выше, может дополнительно включать стадию:

c) введение второй нуклеиновой кислоты, содержащей второй регуляторный участок, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей матриксный белок.

Первая или вторая нуклеотидная последовательность, или обе могут дополнительно кодировать, содержать, или кодировать и содержать один или несколько элементов амплификации. Один или несколько элементов амплификации могут быть выбраны из одного или нескольких элементов амплификации на основе геминивируса. Один или несколько элементов амплификации на основе геминивируса могут быть выбраны из длинной межгенной области вируса желтой карликовости бобовых (Bean Yellow Dwarf Virus, BeYDV LIR) и короткой межгенной области BeYDV (BeYDV SIR).

Первый регуляторный участок, активный в растении, и второй регуляторный участок, активный в растении, могут быть одинаковыми или различными.

Описанный выше способ может дополнительно содержать стадию:

d) сбора растения и экстракцию VLP.

Настоящее изобретение также включает способ (А), описанный выше, в котором первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторный участок, функционально связанный с одним или несколькими энхансерами на основе комовируса, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор сайленсинга, репликазу геминивируса или и то и другое, вводят в растение или часть растения. Альтернативно, первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторный участок, функционально связанный с одним или несколькими энхансерами на основе комовируса, вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй регуляторный участок, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей матриксный белок, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор сайленсинга, репликазу геминивируса или и то и другое, вводят в растение или часть растения. В случае если третья нуклеиновая кислота содержит только супрессор сайленсинга, то в растение или часть растения может быть введена четвертая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу геминивируса. Один или несколько энхансеров на основе комовируса могут представлять собой нетранслируемую область (UTR) комовируса, например, UTR гипертранслируемого вируса мозаики коровьего гороха (Cowpea Mosaic Virus hyperanslatable, CPMV-HT), такую как 5' и/или 3'UTR CPMV-HT.

Настоящее изобретение также включает способ (А), описанный выше, в котором на стадии введения (стадия а) первая нуклеиновая кислота транзиентно экспрессируется в растении. Альтернативно, на стадии введения (стадия а) первая нуклеиновая кислота стабильно экспрессируется в растении.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ (В) получения вирусоподобных частиц вируса бешенства (VLP), включающий:

а) обеспечение растения или части растения, содержащего первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый регуляторный участок, активный в растении, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или более нативных структурных белков вируса бешенства,

b) инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, нативных VLP вируса бешенства.

Первый регуляторный участок, активный в растении, и второй регуляторный участок, активный в растении, могут быть одинаковыми или различными.

Нативный структурный белок вируса бешенства в способе (В) может представлять собой гликопротеин. В случае если нативный структурный белок вируса бешенства представляет собой не М (матриксный) белок, то в способе (В), описанном выше, растение может дополнительно содержать вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй регуляторный участок, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей матриксный белок. В альтернативном варианте первая нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую матриксный белок.

В способе, описанном выше (Способ В), первая нуклеиновая кислота или вторая нуклеиновая кислота, или обе могут дополнительно кодировать, содержать, или кодировать и содержать один или несколько элементов амплификации. Один или несколько элементов амплификации могут быть выбраны из одного или нескольких элементов амплификации на основе геминивируса. Один или несколько элементов амплификации на основе геминивируса могут быть выбраны из длинной межгенной области вируса желтой карликовости бобовых (Bean Yellow Dwarf Virus, BeYDV LIR) и короткой межгенной области BeYDV (BeYDV SIR).

В описанных выше способах (Способы A или B) растение или часть растения может дополнительно содержать еще одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую супрессор сайленсинга, например, HcPro или р19, репликазу геминивируса, или и то, и другое. В альтернативном варианте растение или часть растения может содержать еще одну нуклеиновую кислоту, кодирующую репликазу геминивируса.

Настоящее изобретение также включает способ (B), описанный выше, в котором растение или часть растения транзиентно экспрессирует первую нуклеиновую кислоту. В альтернативном варианте первая нуклеиновая кислота стабильно экспрессируется в растении или части растения.

Способ (B), описанный выше, может дополнительно содержать стадию:

d) сбора растения и экстракцию VLP.

Настоящее изобретение обеспечивает VLP, полученную способами (А) и/или (В), описанными выше. Вирусоподобная частица (VLP) может дополнительно содержать один или несколько липидов, полученных из растения. Один или более нативных структурных белков вируса бешенства, состоящих из VLP, могут содержать растение-специфические N-гликаны или модифицированные N-гликаны. Настоящее изобретение также обеспечивает поликлональное антитело, приготовленное с использованием VLP.

Настоящее изобретение включает композицию, содержащую эффективную дозу VLP, полученных описанными выше способами (А) или (В), для индукции иммунного ответа, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также включает способ индукции иммунитета к инфекции, вызванной вирусом бешенства, у субъекта, включающий введение VLP, как описано выше, субъекту. Вирусоподобную частицу (VLP) можно вводить субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

Настоящее изобретение также обеспечивает растительный материал, содержащий VLP, полученную описанными выше способами (A) и/или (B). Растительный материал может быть использован для индукции иммунитета к инфекции, вызванной вирусом бешенства у субъекта. Растительный материал может быть также примешан в пищу в качестве пищевой добавки.

Данное краткое описание изобретения не обязательно описывает все признаки изобретения.

Краткое описание чертежей

Приведенные выше и прочие признаки изобретения будут более понятными из последующего подробного описания, в котором содержатся ссылки на прилагаемые чертежи, на которых:

Фигура 1 показывает анализ методом Вестерн-блоттинга транзиентной экспрессии G-белка вируса бешенства в Nicotiana benthamiana. Экспрессия G-белка вируса бешенства проходила под контролем CPMV-HT с системой амплификации ДНК на основе содержащего (1091) или не содержащего (1071) BeYDV (смотри таблицу 2 в Примерах для конструкций). Числа в скобках относятся к количеству культуры Agrobacterium в миллилитрах, используемой в приготовлении инокулюма бактерий. Растения, инфильтрованные AGL1/1091, собирали через 3 или 4 дня после инфильтрации (DPI). Листья инфильтрованных растений собирали и механически экстрагировали. Белковые экстракты разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995).

Фигура 2 показывает сравнение содержания G-белка вируса бешенства в белковых экстрактах, полученных биохимическим и механическим методами экстракции G-белка вируса бешенства. Белковые экстракты разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995). Числа в скобках относятся к количеству культуры Agrobacterium в миллилитрах, используемой в приготовлении инокулюма бактерий (смотри таблицу 2 для конструкций).

Фигура 3А показывает анализ методом Вестерн-блоттинга содержания G-белка вируса бешенства после разделения методом эксклюзионной хроматографии (SEC) концентрированных белковых экстрактов, полученных из растений, инфильтрованных AGL1/1091. Элюированные фракции после SEC разделяли методом SDS-PAGE и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995). Фигура 3В показывает анализ с помощью Вестерн-блоттинга содержания G-белка вируса бешенства после разделения методом эксклюзионной хроматографии (SEC) концентрированных белковых экстрактов, полученных из растений, инфильтрованных AGL1/1091 +AGL1/1086. Элюированные фракции после SEC разделяли методом SDS-PAGE и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995).

Фигура 4А показывает праймер IF-RabM-S3.c (SEQ ID NO: 1). Фигура 4В показывает праймер IF-RabM-S1-4.r (SEQ ID NO: 2). Фигура 4C показывает последовательность, кодирующую синтезированный М-белок (соответствующую nt 2496-3104 из Genbank accession number FJ 913470) (SEQ ID NO. 3). Фигура 4D показывает схематическое изображение конструкции номер 1191. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 4Е показывает конструкцию номер 1191 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/NOS с экспрессионной кассетой Пластоцианин-Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 4). Фигура 4F показывает кассету экспрессии номер 1066 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Открытая рамка считывания М-белка из штаммов ERA вируса бешенства подчеркнута (SEQ ID NO: 5). Фигура 4G показывает аминокислотную последовательность М-белка из штамма ERA вируса бешенства (SEQ ID NO: 6). Фигура 4Н показывает схематическое изображение конструкции номер 1066.

Фигура 5А показывает схематическое изображение конструкции номер 1193. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 5В показывает конструкцию номер 1193 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV + Репликаза с экспрессионной кассетой Пластоцианин-TBSV Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 7). Фигура 5С показывает экспрессионную кассету номер 1086 от левого LIR BeYDV до правого LIR BeYDV. Открытая рамка считывания PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства подчеркнута. (SEQ ID NO: 8). Фигура 5D показывает схематическое изображение конструкции номер 1086.

Фигура 6А показывает праймер IF-RabG-S2+4.c (SEQ ID NO: 9). Фигура 6B показывает праймер IF-RabG-S1-4.r (SEQ ID NO: 10). Фигура 6С показывает последовательность, кодирующую синтезированный G-белок вируса бешенства (соответствующую nt 3317-4891 из Genbank accession number EF 206707), (SEQ ID NO: 11). Фигура 6D показывает схематическое изображение конструкции номер 1192. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 6Е показывает конструкцию номер 1192 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой Пластоцианин-Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 12). Фигура 6F показывает экспрессионную кассету номер 1071 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Открытая рамка считывания PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства подчеркнута. (SEQ ID NO: 13). Фигура 6G показывает аминокислотную последовательность PDISP-белок G из штамма ERA вируса бешенства (SEQ ID NO: 14). Фигура 6Н показывает схематическое изображение конструкции номер 1071.

Фигура 7А показывает схематическое изображение конструкции номер 1194. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 7В показывает конструкцию номер 1194 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HTVPDISP/NOS в систему амплификации BeYDV + Репликаза с экспрессионной кассетой Пластоцианин-Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 15). Фигура 7С показывает экспрессионную кассету номер 1091 от левого LIR BeYDV до правого LIR BeYDV. Открытая рамка считывания PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства подчеркнута. (SEQ ID NO: 16). Фигура 7D показывает схематическое изображение конструкции номер 1091.

Фигура 8А показывает SDS-PAGE при окрашивании Кумаси (Precast 4-12% от BioRad) G-белка препарата VLP. 1) препарат Rab-VLP, 2) маркер молекулярной массы. Фигура 8В показывает ответы нейтрализующих антител (МЕ/мл) в группе мышей (5 особей на группу), иммунизированных внутримышечно (i.m.) тремя дозами (D0, D7 и D28) 0.1 мл NG-VLP (Нативный G-белок VLP) вакцины с адьювантом и без него (Alhydrogel (Alhy)). Образцы крови брали на День 44, через 16 дней после 3-х доз. В методе тестирования использовали: тест RFFIT (быстрый тест на ингибирование флуоресцентного свечения): рассчитывали среднее геометрическое титра (GMT) с использованием индивидуальных значений, полученных для каждого животного, и указывали респондеров с положительным ответом. Столбцы представляют GMT с 95% CI. Статистический анализ Anova выполняли между всеми лечебными группами и статистически значимых различий не наблюдалось.

Подробное описание изобретения

Приведенное далее описание относится к предпочтительному варианту осуществления изобретения.

Настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP), содержащим один или более нативных структурных белков вируса бешенства, и способам получения VLP вируса бешенства в растениях. Вирусоподобные частицы (VLP) вируса бешенства могут содержать один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например, один или более гликопротеинов, один или более матриксных белков, или оба. Вирусоподобная частица (VLP) не содержит белки вируса из вируса растения.

Настоящее изобретение к тому же обеспечивает способ получения вирусоподобных частиц (VLP) вируса бешенства в растениях. Способ может включать введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторный участок, активный в растениях, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нативный структурный белок вируса бешенства, и одного или нескольких элементов амплификации в растение или часть растения. Далее следует инкубация растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, VLP.

Нативный структурный вирусный белок вируса бешенства (также называемый как нативный структурный вирусный белок вируса бешенства) может относиться ко всей или части последовательности нативного структурного белка вируса бешенства, выделенного из вируса бешенства, присутствующего в любом природном или вариантном штамме вируса бешенства, или изоляте. Таким образом, термин нативный структурный белок вируса бешенства и тому подобное включает природные варианты последовательности нативного структурного белка вируса бешенства, полученные путем мутации в течение жизненного цикла вируса или в ответ на селективное давление (например, лекарственную терапию, расширение тропизма клетки хозяина или инфекционность, и т.д.). Специалисту в данной области будет понятно, что такие последовательности нативного структурного белка вируса бешенства и его варианты могут быть также получены с использованием рекомбинантных технологий. Нативный структурный вирусный белок вируса бешенства не включает химерные белки, в которых, например, трансмембранный домен и/или цитоплазматический концевой сегмент заменены на гетерологичный трансмембранный домен и/или цитоплазматический концевой сегмент по отношению к нативному структурному белку вируса бешенства.

Неограничивающим примером нативного структурного белка вируса бешенства является белок гликопротеин (G) вируса бешенства, фрагмент G-белка, матриксный (М) белок, фрагмент М-белка или их комбинация. Неограничивающие примеры G-белка или фрагментов G-белка, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, включают G-белки из штамма ERA вируса бешенства. Пример G-белка, который не должен рассматриваться как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14. Кроме того, нативный структурный белок вируса бешенства может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 90-100% сходство с таковой, включая любой процент сходства в указанном диапазоне, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с таковой.

Подобие аминокислотных последовательностей или идентичность может быть вычислена с использованием программ BLASTP и TBLASTN, которые используют BLAST (основное средство поиска, основанное на локальных выравнивания) алгоритм 2.0. Методики для вычисления сходства аминокислотных последовательностей или идентичности хорошо известны специалистам в данной области, и использование алгоритма BLAST описано в ALTSCHUL с соавт. (1990, J Mol. Biol. 215:403-410) и ALTSCHUL с соавт. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).

Нативный структурный вирусный белок может существовать в виде мономера, димера, тримера или их комбинации. Тример представляет собой макромолекулярный комплекс, образованный тремя белками, обычно соединенными нековалентной связью. Без привязки к какой-либо теории полагают, что домен тримеризации белка может быть важным для образования таких тримеров. Таким образом, вирусный белок или его фрагмент может содержать домен тримеризации.

Под «матриксным белком» (также называемым как вирусный коровый белок) понимается белок, который участвует в сборке и стабилизирует структуру вириона. Вирусные матриксные белки обычно напрямую взаимодействуют с клеточными мембранами и могут быть вовлечены в процесс почкования. Вирусные коровые белки представляют собой белки, которые составляют часть нуклеокапсида и обычно напрямую связаны с вирусной нуклеиновой кислотой. Примерами вирусного матриксного или корового белка являются М-белок вируса бешенства, белок M1 вируса гриппа, белок М респираторно-синтициального вируса (RSV) и gag-белок ретровирусов. Примеры матриксных белков, которые можно использовать, как описано в настоящем документе, включают, но без ограничения, М-белок вируса бешенства. Неограничивающий пример последовательностей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включает М-белок из штамма ERA вируса бешенства. Иллюстративный М-белок состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6. Кроме того, нативный структурный вирусный белок вируса бешенства может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 90-100% сходство последовательности с таковой, включая любой процент сходства внутри этих диапазонов, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходство последовательности с таковой.

Вирус везикулярного стоматита (семейство рабдовирусов, к которому относится вирус бешенства) и вирус простого герпеса (вирус герпеса, к которому относится вирус ветряной оспы) почкуются VSР4-зависимым образом (Taylor с соавт. J. Virol 81:13631-13639, 2007; Crump с соавт., J. Virol 81:7380-7387, 2007). Так как VSP4 взаимодействует с поздним доменом матриксного белка, можно сделать вывод о том, что матриксный белок необходим для почкования и, как следствие, для продукции VLP. Однако, как описано в настоящем документе, VLP нативного вируса бешенства могут быть получены в растениях с коэкспрессией матриксного белка или без нее. Таким образом, VLP нативного вируса бешенства, продуцированные в растениях из нативных структурных белков, полученных из вируса, в соответствии с настоящим изобретением могут содержать или могут не содержать вирусный матриксный (или вирусный коровый) белок.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения вирусоподобных частиц VLP вируса бешенства в растении, при этом нуклеиновая кислота (первая нуклеиновая кислота), кодирующая нативный структурный белок вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, коэкспрессируется со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей вирусный матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства. Нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной стадии или могут быть введены в растение последовательно.

Как описано более подробно ниже, VLP могут быть получены в растении путем экспрессии нуклеиновой кислоты (первой нуклеиновой кислоты), кодирующей один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства. Вторая нуклеиновая кислота, кодирующая матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства, может коэкспрессироваться в растении. Нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной стадии, или могут быть введены в растение последовательно. Нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота могут быть введены в растение транзиентным или стабильным образом.

К тому же, растение, которое экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, может быть трансформировано матриксным белком, например, но без ограничения, матриксным белком вируса бешенства (второй нуклеиновой кислотой) таким образом, что обе, первая и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессируются в растении. В альтернативном варианте растение, которое экспрессирует матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства (вторую нуклеиновую кислоту), может быть трансформировано первой нуклеиновой кислотой, кодирующей один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, таким образом, что обе, первая и вторая нуклеиновые кислоты могут коэкспрессироваться в растении.

К тому же, первое растение, экспрессирующее первую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, может быть скрещено со вторым растением, экспрессирующим вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства, для получения потомственного растения, которое коэкспрессирует первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие нативный структурный белок вируса бешенства и матриксный белок, соответственно.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения VLP вируса бешенства в растении, который включает введение в растение или часть растения одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих один или более нативных структурны