Гетеромультимеры с уменьшенной или подавленной эффекторной функцией

Гетеромультимеры с уменьшенной или подавленной эффекторной функцией

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА

[001] Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/829973, поданной 31 мая 2013 г, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством отсылки во всех отношениях.

ВВЕДЕНИЕ

2.1. Область техники

[002] Настоящее изобретение относится к области разработки терапевтического антитела и, более конкретно, к полипептидам, содержащим гетеродимерную Fc-область, которая была модифицирована для подавления эффекторных функций, опосредованных Fc-областью.

2.2 Уровень техники

[003] Терапевтические антитела были разработаны для лечения множества заболеваний. В некоторых из таких случаев эффективность терапевтического антитела является следствием, по меньшей мере отчасти, способности Fc-области антитела опосредовать одну или более эффекторных функций. Данные эффекторные функции являются следствием взаимодействия антител и комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы для стимуляции множества ответов, в том числе антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (complement dependent cytotoxicity, CDC) (обзор приведен в публикациях Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997); Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol. 2:77-94 (1995); и Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)). Некоторые эффекторные функции антитела опосредованы Fc-рецепторами (FcR), которые связываются с Fc-областью антитела. FcR классифицируют по их специфичности к изотипам иммуноглобулинов; Fc-рецепторы для антител IgG называют FcγR, для антител IgE-FcεR, для антител IgA-FcαR и т.д. Fc-область антител также опосредует функции, такие как связывание с FcRn, которые осуществляются независимо от связывания с антигеном и которые придают антителам устойчивость в кровотоке и способность проникать через клеточные барьеры в результате трансцитоза (Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995)).

[004] Однако в случае определенных заболеваний эффекторные функции, опосредованные Fc-областью антитела, могут вызывать нежелательные побочные эффекты. Вследствие этого были предприняты попытки сконструировать антитела с уменьшенными или подавленными эффекторными функциями.

[005] В недавних публикациях были описаны стратегии, которые использовали для конструирования антител с уменьшенной или подавленной эффекторной активностью (см. Strohl, WR (2009), Curr Opin Biotech 20:685-691 и Strohl, WR and Strohl LM, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249). Данные стратегии включают уменьшение эффекторной функции посредством модификации гликозилирования, применения каркасов IgG2/IgG4 или введения мутаций в шарнирную область или СН2-область Fc-области антитела.

[006] Кроме того, в публикации патента США №2011/0212087 (Strohl) описаны антитела и другие молекулы, содержащие Fc, с вариациями в Fc-области, которые уменьшают связывание с FcγR (рецепторами Fc-гамма) и наблюдаемую в результате активность и которые можно применять для лечения различных заболеваний и нарушений.

[007] В международной публикации патента № WO 2006/105338 (Xencor) описаны варианты Fc с оптимизированными свойствами, способы получения данных вариантов, Fc-полипептиды, содержащие варианты Fc с оптимизированными свойствами, и способы применения вариантов Fc с оптимизированными свойствами.

[008] В публикации патента США №2012/0225058 (Xencor) описан вариант Fc родительской конструкции Fc IgG, причем указанный вариант Fc демонстрирует измененное связывание с одним или более FcγR, причем указанный вариант Fc содержит по меньшей мере одну аминокислотную вставку в Fc-области указанной родительской конструкции Fc IgG.

[009] В публикации патента США №2012/0251531 (Genentech) описаны сконструированные полипептиды, содержащие варианты Fc, а также варианты применения указанных полипептидов, и, более конкретно, варианты Fc, демонстрирующие уменьшенную эффекторную функцию. Данные варианты также описаны как приносящие пользу пациенту, страдающему от заболевания, которое можно лечить антителом и при котором желательно уменьшить эффекторную функцию, вызванную антителами.

[0010] Strop с соавт. ((2012) J. Mol. Biol. 420: 204-219) описывают введение заряженных мутаций в коровую шарнирную область и СН3-область IgG1 и IgG2 человека для улучшения образования биспецифичного антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] В настоящем изобретении предложены гетеромультимеры, содержащие конструкцию Fc IgG, которая содержит первый и второй полипептид Fc, причем каждый полипептид Fc содержит модифицированную нижнюю шарнирную область, причем: модифицированная нижняя шарнирная область указанного первого полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, модифицированная нижняя шарнирная область указанного второго полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, которая отличается от по меньшей мере одной модификации аминокислоты указанного первого полипептида Fc, и конструкция Fc IgG демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ и с белком C1q по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG.

[0012] Определенные варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором по меньшей мере одна модификация аминокислоты в модифицированной нижней шарнирной области первого полипептида Fc увеличивает суммарный положительный заряд модифицированной нижней шарнирной области, и по меньшей мере одна модификация аминокислоты во втором полипептиде Fc увеличивает общее количество отрицательных зарядов или заряжена нейтрально относительно шарнирной области дикого типа; или по меньшей мере одна модификация аминокислоты в модифицированной нижней шарнирной области первого полипептида Fc увеличивает суммарный отрицательный заряд модифицированной нижней шарнирной области, и по меньшей мере одна модификация аминокислоты во втором полипептиде Fc увеличивает общее количество положительных зарядов.

[0013] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная нижняя шарнирная область по меньшей мере одного из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит две или более модификаций аминокислот.

[0014] В настоящем изобретении предложен гетеромультимер, содержащий конструкцию Fc IgG, которая содержит первый и второй полипептид Fc, причем каждый полипептид Fc содержит модифицированную шарнирную область, причем: модифицированная шарнирная область указанного первого полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, которая увеличивает суммарный заряд модифицированной шарнирной области первого полипептида Fc при условиях pH, близких к физиологическим, модифицированная шарнирная область указанного второго полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, которая отличается от по меньшей мере одной модификации аминокислоты указанного первого полипептида Fc, и конструкция Fc IgG демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ и с белком C1q по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG.

[0015] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором увеличение суммарного заряда представляет собой увеличение суммарного положительного заряда первого полипептида Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанное увеличение суммарного положительного заряда представляет собой увеличение общего числа положительно заряженных аминокислот в первом полипептиде Fc или уменьшение общего числа отрицательно заряженных аминокислот в первом полипептиде Fc. Определенные варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором по меньшей мере одна модификация аминокислоты в модифицированной шарнирной области указанного первого полипептида Fc увеличивает общее число положительно заряженных аминокислот в указанном первом полипептиде Fc, и по меньшей мере одна модификация аминокислоты в модифицированной шарнирной области указанного второго полипептида Fc увеличивает общее количество отрицательных зарядов в указанном втором полипептиде Fc или заряжена нейтрально.

[0016] Согласно варианту реализации настоящего изобретения увеличение суммарного заряда представляет собой увеличение суммарного отрицательного заряда первого полипептида Fc. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения увеличение суммарного отрицательного заряда представляет собой увеличение общего числа отрицательно заряженных аминокислот или уменьшение общего числа положительно заряженных аминокислот в первом полипептиде Fc. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения, когда суммарный отрицательный заряд представляет собой увеличение общего числа отрицательно заряженных аминокислот, по меньшей мере одна модификация аминокислоты во втором полипептиде Fc увеличивает общее количество положительных зарядов.

[0017] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором по меньшей мере одна модификация аминокислоты в модифицированной шарнирной области первого полипептида Fc в сочетании с по меньшей мере одной модификацией аминокислоты во втором полипептиде Fc увеличивает общий положительный заряд конструкции Fc IgG по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG, не содержащей модификаций шарнирной области.

[0018] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область по меньшей мере одного из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит две или более модификаций аминокислот.

[0019] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область указанного первого и второго полипептидов Fc содержит две или более модификаций аминокислот.

[0020] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором по меньшей мере одна модификация аминокислоты в модифицированной шарнирной области первого и второго полипептидов Fc находится в нижней шарнирной области.

[0021] В настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG обладает K_D в отношении FcγRIIaH, составляющей более 10 мкМ, K_D в отношении FcγRIIaR, составляющей более 10 мкМ, K_D в отношении FcγRIIb, составляющей более 10 мкМ, K_D в отношении FcγRIIIaF, составляющей более 6 мкМ, K_D в отношении FcγRIIIaV, составляющей более 6 мкМ, и K_D в отношении FcγRIa, составляющей более 6,5 нМ.

[0022] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG опосредует уменьшенную эффекторную функцию по сравнению с соответствующей конструкцией Fc IgG, не содержащей модификаций аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция Fc IgG опосредует менее 70%, менее 50%, менее 30% или менее 10% эффекторной функции, что измеряют посредством определения ЕС₅₀. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция Fc IgG опосредует менее 10%, менее 5%, менее 2% или менее 1% эффекторной функции, что измеряют посредством определения максимального лизиса клеток. Согласно варианту реализации настоящего изобретения эффекторная функция выбрана из ADCC, ADCP (antibody-depended cell phagocytosis, антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз), CDC или любой комбинации указанных функций.

[0023] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область по меньшей мере одного из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит модификации аминокислот в положениях L234 и/или L235. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированная шарнирная область по меньшей мере одного из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит модификации аминокислот, которые выбраны из L234K, L234R, L234A, L235K, L235R и L235A. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения один из указанных первого или второго полипептидов Fc также содержит модификацию аминокислоты в положении Е233. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная модификация в положении Е233 выбрана из Е233А, E233K и E233R.

[0024] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область обоих указанных первого и второго полипептидов Fc содержит модификации аминокислот в положении L234 и/или L235. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модификации в положениях L234 и/или L235 выбраны из L234A, L234K, L234R, L234D, L234E, L235K, L235R, L235E, L235A и L235D. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения модифицированная шарнирная область первого и/или второго полипептида Fc также содержит модификацию аминокислоты в положении Е233. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или обе модификации аминокислот представляют собой независимо Е233А или E233D.

[0025] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область по меньшей мере одного из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит модификации аминокислот L234K/L235K, E233A/L234R/L235R, E233K/L234R/L235R или E233K/L234A/L235K.

[0026] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область первого или второго полипептида Fc содержит модификации аминокислот L234A/L235A, L234D/L235E, E233A/L234D/L235E или E233A/L234K/L235A.

[0027] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором: модифицированная шарнирная область первого полипептида Fc содержит модификации аминокислот L234K/L235K, и модифицированная шарнирная область второго полипептида Fc содержит модификации аминокислот L234A/L235A; модифицированная шарнирная область первого полипептида Fc содержит модификации аминокислот L234K/L235K, и модифицированная шарнирная область второго полипептида Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E; модифицированная шарнирная область первого полипептида Fc содержит модификации аминокислот E233A/L234R/L235R, и модифицированная шарнирная область второго полипептида Fc содержит модификации аминокислот E233A/L234D/L235E; модифицированная шарнирная область первого полипептида Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234R/L235R, и модифицированная шарнирная область второго полипептида Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E; или модифицированная шарнирная область первого полипептида Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234A/L235K, и модифицированная шарнирная область второго полипептида Fc содержит модификации аминокислот E233A/L234K/L235A.

[0028] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором: первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234R/L235R/E233K; первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E/D265S, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234R/L235R/D265S; первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E/E269K, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234R/L235R/E269K; первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E/K322A, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234R/L235R/K322A; первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E/P329W, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234R/L235R/P329W; первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E/E269K/D265S/K322A, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322A; или первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L234D/L235E/E269K/D265S/K322E/E333K, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322E/E333K.

[0029] В настоящем изобретении предложен гетеромультимер, содержащий конструкцию Fc IgG, которая содержит первый и второй полипептид Fc, причем: указанный первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот E269Q/D270N, и второй полипептид Fc содержит модификации аминокислот E269K/D270R; или указанный первый полипептид Fc содержит модификации аминокислот L235K/A327K, и второй полипептид Fc не содержит модификации в шарнирной или нижней шарнирной области; и причем конструкция Fc IgG демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ и с белком C1q по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG.

[0030] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG является агликозилированной. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG является дегликозилированной.

[0031] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором начало плавления конструкции Fc IgG на термограмме больше или равно 68°С.

[0032] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG содержит СН2-область с температурой плавления, большей или равной температуре плавления соответствующей родительской СН2-области, не содержащей модификаций шарнирной области.

[0033] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG содержит СН2-область с температурой плавления, которая приблизительно на 1-2°С выше температуры плавления родительской СН2-области.

[0034] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG содержит СН2-область с температурой плавления, которая приблизительно на 2-3°С выше температуры плавления родительской СН2-области.

[0035] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG содержит вариант СН3-области, содержащий модификации аминокислот, которые способствуют образованию гетеродимерной Fc-области вместо гомодимерной Fc-области, когда экспрессируется указанный гетеромультимер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит модификации аминокислот СН3 T366L/N390R/K392M/T394W, и другой полипептид Fc содержит модификации аминокислот СН3 L351Y/S400E/F405A/Y407V. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый и/или второй полипептиды Fc содержат модификацию аминокислоты T350V. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения гетеромультимеры, содержащие гетеродимерную Fc-область, отделяют от продуктов экспрессии, содержащих гомодимерную Fc-область, с применением способов очистки на основе заряда.

[0036] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, причем указанный гетеромультимер также содержит по меньшей мере одну антиген-связывающую конструкцию, слитую с конструкцией Fc IgG.

[0037] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором по меньшей мере одна антиген-связывающая конструкция выбрана из Fab-фрагмента, scFv, sdAb, антиген-связывающего пептида, белка, слитого с Fc, или белка или его фрагмента, способного к связыванию с антигеном. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, содержащий одну антиген-связывающую конструкцию. Вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, содержащий две антиген-связывающие конструкции.

[0038] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG присоединена к одной или нескольким молекулам токсичного лекарственного препарата.

[0039] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG присоединена к одному или нескольким гетерологичным полипептидам. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один или более гетерологичных полипептидов выбраны из ферментов и токсинов.

[0040] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором IgG представляет собой IgG1.

[0041] В настоящем изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая первый или второй полипептид Fc гетеромультимера, описанного в настоящей заявке. В настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, описанную в настоящей заявке. В настоящем изобретении предложен способ получения гетеромультимера, описанного в настоящей заявке, причем указанный способ включает следующие этапы: (a) культивирование клетки-хозяина, описанной в настоящей заявке; и (b) выделение гетеромультимера из культуры клетки-хозяина. Определенный вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ получения гетеромультимера, также включающий этап выделения гетеромультимера с применением способов очистки на основе заряда. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой способ получения гетеромультимера, описанного в настоящей заявке, причем указанный способ очистки на основе заряда представляет собой ионообменную хроматографию.

[0042] В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. В настоящем изобретении предложен способ лечения заболевания, включающий предоставление пациенту, который нуждается в таком лечении, эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой применение гетеромультимера, описанного в настоящей заявке, для приготовления лекарственного препарата для лечения заболевания.

[0043] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой применение гетеромультимера, описанного в настоящей заявке, для лечения заболевания у пациента, который нуждается в таком лечении.

[0044] В настоящем изобретении предложен способ уменьшения эффекторной функции конструкции антитела, включающий: модификацию нижней шарнирной области первого и второго полипептида Fc, причем: модифицированная нижняя шарнирная область указанного первого полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, модифицированная нижняя шарнирная область указанного второго полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, которая отличается от по меньшей мере одной модификации аминокислоты указанного первого полипептида Fc, и конструкция Fc IgG демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ или с белком C1q по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модификации приводят к незначительному связыванию с Fc-рецепторами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0045] Данные и другие свойства настоящего изобретения станут более очевидным после следующего подробного описания, в котором содержатся ссылки на прилагаемые чертежи.

[0046] На фигуре 1 представлены участки Fc-области, вовлеченные в связывание с FcγR. (А) Кристаллическая структура 3b/Fc (PDB.1E4K), демонстрирующая петли и нижний шарнирный СН2-домен Fc (показан серым цветом), которые вовлечены в связывание с FcγR (показан черным цветом). (В) Топология домена СН2. Слои обозначены как S1, S2, S3, S4, S5, S6 и S7; петли обозначены как L1, L2 и L3.

[0047] На фигуре 2 представлены термограммы иллюстративных асимметричных конструкций антитела по сравнению с антителом дикого типа (ДТ). На фигуре 2А представлены термограммы для ДТ и ААС2-ААС6. На фигуре 2В представлена идентичность двух переходов ДТ. Первый переход соответствует развертыванию СН2-домена, второй переход соответствует развертыванию СН3+Fab. На фигуре 2С представлено наложение результатов анализа множества образцов, демонстрирующее, как переход вариантов СН2 смещается к большему значению Tm, что свидетельствует о большей стабильности.

[0048] На фигуре 3А представлены иллюстративные результаты, демонстрирующие разделение методом ионообменной хроматографии компонентов, полученных в процессе очистки иллюстративных асимметричных конструкций антитела. На фигуре 3В представлено разделение компонентов с применением градиента pH (верхняя часть) или градиента соли (нижняя часть) с использованием иллюстративного асимметричного варианта ААС4.

[0049] На фигуре 4 представлена способность контрольного варианта (v1051) и иллюстративного гетеромультимера согласно настоящему изобретению (ААС6) опосредовать ADCC.

[0050] На фигуре 5 представлены аминокислотная последовательность Fc-области IgG1 человека (SEQ ID NO: 1); аминокислотная последовательность тяжелой цепи трастузумаба (SEQ ID NO: 2), аминокислотная последовательность легкой цепи трастузумаба (SEQ ID NO: 3), аминокислотная последовательность тяжелой цепи ритуксимаба (SEQ ID NO: 4), аминокислотная последовательность легкой цепи ритуксимаба (SEQ ID NO: 5).

[0051] На фигуре 6 представлена способность вариантов ААС9-ААС12, ААС14 и ААС15 опосредовать ADCC на клетках Дауди. На фигуре 6А представлены результаты, полученные для ААС10 и ААС11, по сравнению с контролями, включающими коммерчески доступный ритуксимаб; на фигуре 6В представлены результаты, полученные для ААС12 и ААС14, по сравнению с контролями, включающими коммерчески доступный ритуксимаб; на фигуре 6С представлены результаты, полученные для ААС9 и ААС15, по сравнению с контролями, включающими коммерчески доступный ритуксимаб.

[0052] На фигуре 7 представлена способность вариантов ААС9-ААС12, ААС14 и ААС15 опосредовать CDC на клетках Дауди.

[0053] На фигуре 8 представлены последовательности SEQ ID NO: 6-69, поданные в настоящем изобретении.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0054] В настоящем изобретении предложен гетеромультимер, содержащий конструкцию Fc IgG. Конструкция Fc IgG содержит два полипептида Fc, каждый из которых содержит модифицированную шарнирную область, причем указанная модифицированная шарнирная область содержит асимметричные модификации аминокислот, которые уменьшают или устраняют связывание конструкции Fc IgG с рецепторами FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb FcγRIIIaF, FcγRIIIaV и FcγRIa и с белком фактора комплемента C1q. Такое уменьшение или устранение данного связывания приводит к уменьшению или подавлению эффекторных функций, как правило, опосредованных Fc-областью IgG дикого типа. Как отмечается, модифицированная шарнирная область содержит асимметричные модификации аминокислот, и вследствие этого модификации аминокислот в шарнирной области одной полипептидной конструкции Fc IgG отличаются от модификаций в шарнирной области другого полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенные конструкции антитела являются стабильными и способными к связыванию с FcRn.

[0055] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения модифицированная шарнирная область каждой полипептидной конструкции Fc IgG содержит одну или более модификаций аминокислот, выбранных для увеличения положительного заряда одной полипептидной конструкции Fc IgG по сравнению с другой полипептидной конструкцией Fc IgG. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения модифицированная шарнирная область каждой полипептидной конструкции Fc IgG содержит одну или более модификаций аминокислот, выбранных для увеличения отрицательного заряда одной полипептидной конструкции Fc IgG по сравнению с другой полипептидной конструкцией Fc IgG.

[0056] Гетеромультимер согласно настоящему изобретению может быть пригодным для разработки терапевтических антител, если эффекторные функции являются нежелательными вследствие возникающих в результате побочных эффектов, например, цитотоксичности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гетеромультимеры также демонстрируют свойства, облегчающие очистку указанных гетеромультимеров с применением способов на основе заряда.

[0057] В настоящем изобретении предложены конструкции гетеромультимера с уменьшенной или подавленной эффекторной функцией. Согласно варианту реализации в настоящем изобретении предложена конструкция гетеромультимера, содержащая конструкцию Fc IgG, которая содержит первый и второй полипептид Fc, причем каждый полипептид Fc содержит модифицированную нижнюю шарнирную область, причем: модифицированная нижняя шарнирная область указанного первого полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, модифицированная нижняя шарнирная область указанного второго полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, которая отличается от по меньшей мере одной модификации аминокислоты указанного первого полипептида Fc, и конструкция Fc IgG демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ и с белком C1q по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения конструкция гетеромультимера демонстрирует незначительное связывание с рецепторами Fcγ по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG, которая не содержит модификации, описанные в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция гетеромультимера демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ и незначительное связывание с по меньшей мере одним рецептором Fcγ. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения конструкция гетеромультимера, описанная в настоящей заявке, демонстрирует уменьшенное связывание с рецепторами Fcγ и незначительное связывание с белком C1q. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит дополнительную модификацию по меньшей мере одной аминокислоты, которая находится в области, отличной от нижней шарнирной области. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из указанных первого или второго полипептидов Fc дополнительно содержит модификацию по меньшей мере одной аминокислоты, которая находится в шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из указанных первого или второго полипептидов Fc также содержит модификации по меньшей мере одной аминокислоты, которая находится в СН2- или СН3-области.

[0058] В настоящем изобретении предложен гетеромультимер, содержащий конструкцию Fc IgG, которая содержит первый и второй полипептид Fc, причем каждый полипептид Fc содержит модифицированную шарнирную область, причем: модифицированная шарнирная область указанного первого полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, которая увеличивает суммарный заряд модифицированной шарнирной области первого полипептида Fc при условиях pH, близких к физиологическим, модифицированная шарнирная область указанного второго полипептида Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, которая отличается от по меньшей мере одной модификации аминокислоты указанного первого полипептида Fc, и конструкция Fc IgG демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ и с белком C1q по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения увеличение суммарного заряда представляет собой увеличение суммарного положительного заряда первого полипептида Fc. Согласно варианту реализации настоящего изобретения увеличение суммарного положительного заряда представляет собой увеличение общего числа положительно заряженных аминокислот в первом полипептиде Fc. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанное увеличение суммарного заряда представляет собой увеличение суммарного отрицательного заряда первого полипептида Fc. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения увеличение суммарного отрицательного заряда представляет собой увеличение общего числа отрицательно заряженных аминокислот в первом полипептиде Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция гетеромультимера демонстрирует незначительное связывание с рецепторами Fcγ по сравнению с соответствующей родительской конструкцией Fc IgG, которая не содержит модификации, описанные в настоящей заявке. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения конструкция гетеромультимера демонстрирует уменьшенное связывание со всеми рецепторами Fcγ и незначительное связывание с по меньшей мере одним рецептором Fcγ. Согласно варианту реализации настоящего изобретения конструкция гетеромультимера, описанная в настоящей заявке, демонстрирует уменьшенное связывание с рецепторами Fcγ и незначительное связывание с белком C1q. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из указанных первого или второго полипептидов Fc также содержит модификации по меньшей мере одной аминокислоты, которая находится в нижней шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из указанных первого или второго полипептидов Fc также содержит модификации по меньшей мере одной аминокислоты, которая находится в СН2- или СН3-области.

[0059] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой гетеромультимер, предложенный в настоящей заявке, причем одна или более модификаций аминокислот в модифицированной шарнирной области второго полипептида Fc модифицирует число отрицательных или положительных зарядов в шарнирной области или заряжена нейтрально относительно шарнирной области дикого типа. Определенный вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область по меньшей мере одного из указанных первого или второго полипептидов Fc содержит две или более модификаций аминокислот. Согласно варианту реализации в настоящем изобретении предложен гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором модифицированная шарнирная область указанного второго полипептида Fc содержит две или более модификаций аминокислот. Определенные варианты реализации настоящего изобретения представляют собой конструкцию гетеромультимера, описанную в настоящей заявке, в которой одна или более модификаций аминокислот в модифицированной шарнирной области первого и второго полипептидов Fc находятся в нижней шарнирной области (аминокислоты 16-23 SEQ ID NO: 1, см. фигуру 5).

[0060] Один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гетеромультимер, описанный в настоящей заявке, в котором конструкция Fc IgG обладает K_D в отношении FcγRIIaH, составляющей по меньшей мере приблизительно 10 мкМ, K_D в отношении FcγRIIaR, составляющей по меньшей мере приблизительно 10 мкМ, K_D в отношении FcγRIIb, составляющей по меньшей мере приблизительно 10 мкМ, K_D в отношении FcγRIIIaF, составляющей по меньшей мере приблизительно 6 мкМ, K_D в отношении FcγRIIIaV, составляющей по меньшей мере приблизительно 6 мкМ, и K_D в отношении FcγRIa, составляющей по меньшей мере приблизител