Применение лекарственного препарата традиционной китайской медицины для получения лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения болезни крона

Применение лекарственного препарата традиционной китайской медицины для получения лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения болезни крона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области традиционной китайской медицины (ТСМ). Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению лекарственного препарата традиционной китайской медицины в составе лекарственного препарата для предупреждения или лечения болезни Крона.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Болезнь Крона представляет собой тип воспалительного заболевания кишечника. Как правило, в толстой кишке, тонком кишечнике или желудке пациента наблюдается ряд симптомов, например, воспаление, гиперемия или лимфатический отек. Главное отличие от другого воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита (UC), заключается в локализации воспаления и в воспалении как таковом. С точки зрения гистопатологии, может быть поражен любой участок пищеварительной системы, например, тонкий кишечник, толстая кишка, желудок и пищевод, и при этом типичная локализация включает терминальный отдел подвздошной кишки, и прилегающий сегмент толстой кишки, и правую половину толстой кишки. Однако UC возникает только в толстой и прямой кишке, часто в прямой и сигмовидной кишке. С точки зрения микроскопии, болезнь Крона может поражать всю внутреннюю стенку кишечника, в то время как UC ограничивается слизистой оболочкой.

Болезнь Крона является хроническим и рецидивирующим заболеванием. Поскольку причина неизвестна, эффективные терапевтические лекарственные средства все еще не разработаны. В настоящее время, лекарственные средства, применяемые для лечения болезни Крона, главным образом, включают глюкокортикоиды, салициловую кислоту, иммунодепрессанты, антибиотики, метотрексат и биологические средства (например, инфликсимаб). Несмотря на то, что эти лекарственные средства характеризуются доказанным эффектом, связанным с изменением естественного развития заболевания, они не могут полностью облегчить состояние заболевания и снизить частоту возникновения осложнений. Кроме того, химические препараты глюкокортикоидов и иммунодепрессантов часто приводят к выраженной нежелательной реакции, и при этом длительное применение, вероятно, будет вредным для организма.

В этом случае, специалисты в данной области техники возлагают надежды на разработку эффективных лекарственных препаратов традиционной китайской медицины, применяемых для лечения болезни Крона, с помощью методики TCM. К примеру, в патенте Китая (CN 102716383A) раскрыта композиция TCM, полученная с использованием 15 сырьевых лекарственных препаратов в соответствии с составом. Поскольку в композиции присутствовало большое количество сырьевых лекарственных препаратов, их рецептура была слишком сложной для того, чтобы сделать ее подходящей для промышленного получения. В патенте Китая (CN 102048728A) раскрыто применение производных артемизинина для получения лекарственного препарата для лечения болезни Крона. Тем не менее, как раскрыто в описании, производные артемизинина применялись для поддерживающего лечения. Иными словами, производные артемизинина не могли полностью вылечить болезнь Крона.

В патенте Китая (CN 1192787C) раскрыт препарат TCM, применяемый для лечения UC. С помощью дальнейших исследований впервые было обнаружено, что препарат ТСМ оказывает очень хороший эффект в отношении болезни Крона без существенной нежелательной реакции. В данном документе вышеупомянутая литература включена в текст во всей полноте посредством ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение применения препарата ТСМ при получении лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения болезни Крона. Препарат содержит сырьевые материалы, такие как 1-10% по массе драконовой крови (Xuejie), 15-40% по массе корня пиона красного (Chi Shao), 1-20% по массе натурального индиго (Qing Dai), 1-10% по массе красного галлуазита (Chi Shi Zhi), 15-40% по массе кашу (Er Cha), 1-10% по массе жженых квасцов (Ku Fan), 5-30% по массе корневища блетиллы (Bai Ji) и 1-10% по массе каламина (Lu Gan Shi).

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение применения препарата TCM при получении лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения внекишечных проявлений и осложнений болезни Крона, таким образом, с обеспечением существенного ослабления внекишечных проявлений и осложнений болезни Крона. Препарат содержит сырьевые материалы, такие как 1-10% по массе драконовой крови (Xuejie), 15-40% по массе корня пиона красного (Chi Shao), 1-20% по массе натурального индиго (Qing Dai), 1-10% по массе красного галлуазита (Chi Shi Zhi), 15-40% по массе кашу (Er Cha), 1-10% по массе жженых квасцов (Ku Fan), 5-30% по массе корневища блетиллы (Bai Ji) и 1-10% по массе каламина (Lu Gan Shi).

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа предупреждения и/или лечения болезни Крона. Способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в этом, профилактического и/или терапевтического количества препарата TCM или лекарственной композиции, содержащей препарат TCM.

В соответствии с настоящим изобретением препарат TCM является пригодным для лечения болезни Крона при условии, что его доза достигает уровня эффективной дозы один или несколько раз в день, предпочтительно один раз в день. Если препарат TCM применяется для предупреждения болезни Крона, его доза может быть снижена при определенных условиях.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показана кривая зависимости концентрация-летальность для препарата TCM.

На фиг. 2 показан кишечник данио-рерио в группе обработки, группе модели болезни Крона и контрольной группе без заболевания.

На фиг. 3 показан эффект улучшения в отношении расширения кишечника в группе с болезнью Крона при введении каждого из исследуемых лекарственных средств.

На фиг. 4 показана терапевтическая эффективность каждого из исследуемых лекарственных средств исходя из площади поверхности кишечника в группе с болезнью Крона.

На фиг. 5 показано распределение нейтрофилов в ткани кишечника в группах исследуемого лекарственного средства, группе модели болезни Крона и контрольной группе. (Участок, обозначенный серой линией, представляет собой кишечник данио-рерио, а обозначение в виде белой яркой точки представляет собой нейтрофил).

На фиг. 6 показан эффект в отношении количества нейтрофилов в ткани кишечника в группе модели болезни Крона при введении каждого из исследуемых лекарственных средств.

На фиг. 7 показан эффект в отношении регрессии воспаления в группе с болезнью Крона при введении каждого из исследуемых лекарственных средств.

На фиг. 8 показан срез ткани кишечника для группы исследуемого лекарственного средства, группы модели болезни Крона и контрольной группы. (Стрелки указывают на кишечник данио-рерио, при этом увеличение левого и правого изображений составляет 20× и 40×, соответственно).

На фиг. 9 показан эффект, связанный с баллами индекса активности заболевания (DAI), в модели TNBS на крысах, которым препарат j TCM вводили в толстую кишку (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 10 показан эффект, связанный с баллами индекса активности заболевания (DAI), в модели TNBS на крысах, которым препарат j TCM вводили внутрижелудочно (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 11 показан эффект в отношении содержания в сыворотке IFN-γ, IL-1, IL-4, IL-10 и Gln (глутамина) слизистой оболочки кишечника в модели TNBS на крысах, которым препарат j TCM вводили в толстую кишку (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 12 показан эффект в отношении содержания в сыворотке IFN-γ, IL-1, IL-4, IL-10 и Gln в модели TNBS на крысах, которым препарат j TCM вводили внутрижелудочно (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 13 показаны фотографии патологических изменений у крыс контрольной группы без заболевания, модельной группы, группы положительного контроля и групп исследуемого лекарственного средства, которым препарат j TCM вводили в толстую кишку (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 14 показаны фотографии патологических изменений у крыс контрольной группы без заболевания, модельной группы, группы положительного контроля и групп исследуемого лекарственного средства, которым препарат j TCM вводили внутрижелудочно (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 15 показан эффект в отношении баллов DAI в модели OXZ на крысах, которым препарат k TCM вводили внутрижелудочно (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 16 показан эффект в отношении баллов DAI в модели OXZ на крысах, которым препарат k TCM вводили в толстую кишку (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 17 показан эффект в отношении содержания в сыворотке IFN-γ, IL-4 и Gln слизистой оболочки кишечника в модели OXZ на крысах, которым препарат k TCM вводили в толстую кишку (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 18 показан эффект в отношении содержания в сыворотке IFN-γ, IL-4 и Gln слизистой оболочки кишечника в модели OXZ на крысах, которым препарат k TCM вводили внутрижелудочно (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 19 показаны фотографии патологических изменений у крыс контрольной группы без заболевания, модельной группы, группы положительного контроля и групп исследуемого лекарственного средства, которым препарат k TCM вводили в толстую кишку (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

На фиг. 20 показаны фотографии патологических изменений у крыс контрольной группы без заболевания, модельной группы, группы положительного контроля и групп исследуемого лекарственного средства, которым препарат k TCM вводили ректально (то есть группа с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению препарата ТСМ при получении лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения болезни Крона. Препарат содержит сырьевые материалы, такие как 1-10% по массе драконовой крови (Xuejie), 15-40% по массе корня пиона красного (Chi Shao), 1-20% по массе натурального индиго (Qing Dai), 1-10% по массе красного галлуазита (Chi Shi Zhi), 15-40% по массе кашу (Er Cha), 1-10% по массе жженых квасцов (Ku Fan), 5-30% по массе корневища блетиллы (Bai Ji) и 1-10% по массе каламина (Lu Gan Shi).

Предпочтительно препарат содержит сырьевые материалы, такие как 3-7% по массе драконовой крови, 25-35% по массе корня пиона красного, 5-15% по массе натурального индиго, 1-5% по массе красного галлуазита, 25-35% по массе кашу, 1-5% по массе жженых квасцов, 10-20% по массе корневища блетиллы и 1-5% по массе каламина.

Наиболее предпочтительно препарат содержит сырьевые материалы, такие как 5,1% по массе драконовой крови, 30,3% по массе корня пиона красного, 10,1% по массе натурального индиго, 3% по массе красного галлуазита, 30,3% по массе кашу, 3% по массе жженых квасцов, 15,2% по массе корневища блетиллы и 3% по массе каламина.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению препарата ТСМ при получении лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения внекишечных проявлений и осложнений болезни Крона.

В предпочтительном варианте осуществления осложнения болезни Крона включают один или несколько видов непроходимости кишечника, кишечный свищ, массивное кровотечение из нижних отделов желудочно-кишечного тракта, прободение кишечника, сепсис, абдоминальный абсцесс и заболевания заднего прохода.

В другом предпочтительном варианте осуществления внекишечные проявления болезни Крона включают мукозит слизистой оболочки полости рта, например, афтозную язву; патологические изменения кожи, например, узловатую эритему (EN), гангренозную пиодермию (PG) и неспецифическое кожное высыпание; патологические изменения глаза, например, иридоциклит и конъюнктивит; поражение суставов, например, боль в суставах и артрит; поражение печени и желчевыводящих путей, например, нарушение функции печени и желчный камень.

В соответствии с настоящим изобретением препарат TCM может быть получен в виде любой из фармацевтически приемлемых лекарственных форм, в том числе, но без ограничений: раствора для клизмы; таблетки, например, таблетки, покрытой сахарной оболочкой, таблетки, покрытой пленочной оболочкой и таблетки, покрытой кишечнорастворимой оболочкой; капсулы, например, твердой капсулы и мягкой капсулы; жидкости для перорального применения; буккальной таблетки; гранулы; растворимого порошка; пилюли; микропилюли; мелкого порошка, пастообразной массы, например, мазь и пластификатор; Dan; суспензии; порошка; раствора, например, для инъекций; суппозитория; крема; спрея; сухого порошка для ингаляции; аэрозоля; капель; пастилки и пластыря.

В соответствии с настоящим изобретением раствор для клизмы может быть получен с помощью способа, раскрытого в патенте Китая (CN1192787C). Лекарственные формы в виде таблетки, капсулы, жидкости для перорального применения, буккальной таблетки, гранулы, растворимого порошка, пилюли, микропилюли, мелкого порошка, пастообразной массы, Dan, суспензии, порошка, раствора, суппозитория, крема, спрея, сухого порошка для ингаляции, аэрозоля, капель, пастилки и пластыря могут быть получены с помощью общепринятых способов, известных из уровня техники.

В соответствии с настоящим изобретением раствор для клизмы включает общепринятые носители, например, разбавитель, смазывающее вещество и смачивающее вещество и т.д.

В соответствии с настоящим изобретением вводимые пероральным путем лекарственные формы препарата TCM включают общепринятые носители, например, один или несколько типов связывающего вещества, наполнитель, разбавитель, вещество для таблетирования, смазывающее вещество, вещество для улучшения распадаемости таблеток, краситель, вкусовое вещество, смачивающее вещество. При необходимости таблетка может быть покрыта оболочкой.

В соответствии с настоящим изобретением наполнители включают целлюлозу, маннит, лактозу и другие аналогичные наполнители. Надлежащие вещества для улучшения распадаемости таблеток включают крахмал, поливинилпирролидон (PVP) и производное крахмала (например, гидроксиэтилкрахмал натрия). Надлежащие смазывающие вещества включают стеарат магния. Надлежащие фармацевтически приемлемые смачивающие вещества включают додецилсульфат натрия.

В соответствии с настоящим изобретением препараты в виде твердого вещества для перорального применения на основе препаратов TCM могут быть получены с помощью обычного способа перемешивания, наполнения, таблетирования или гранулирования и т.д. Перемешивание повторяют, для того чтобы активные фармацевтические ингредиенты (API) были равномерно распределены в конечной лекарственной форме.

В соответствии с настоящим изобретением жидкие препараты для перорального применения представляют собой лекарственные формы в виде водорастворимой или растворимой в масле суспензии, раствора, эмульсии, сиропа, или настойки, или сухого порошка, который обычно разводят водой или другим пригодным растворителем перед клиническим применением. Жидкий препарат для перорального применения может содержать общепринятые вспомогательные вещества, например, суспендирующее вещество, такое как сорбит, сироп, метилцеллюлозу, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия или гидрогенизированный пищевой жир; эмульгирующее вещество, например, лецитин, сорбитанмоноолеат или гуммиарабик; вспомогательное вещество, отличное от водного (включая пищевое масло), например, миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, сложноэфирное масло, пропиленгликоль или этанол, а также консервант, например, метилпарабен, нипазол, сорбиновую кислоту. При необходимости может быть включено вкусовое вещество или краситель.

В соответствии с настоящим изобретением единица препарата для инъекций содержит препарат TCM в качестве API и асептические вспомогательные вещества. Является ли API растворенным или суспендированным в жидкости, зависит от типа и концентрации вспомогательных веществ. Как правило, раствор получают посредством растворения препарата TCM в качестве API во вспомогательных веществах, стерилизации, заполнения соответствующего флакона или ампулы и герметизации. При необходимости могут быть добавлены некоторые фармацевтически приемлемые вспомогательные средства, например, местный анестетик, консервант и буферное вещество. Для того чтобы улучшить стабильность перед заполнением во флакон, этот препарат TCM согласно настоящему изобретению может быть заморожен и обработан в вакууме с целью удаления воды.

В соответствии с настоящим изобретением препарат TCM может быть получен путем необязательного добавления фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Вспомогательные вещества выбраны из следующих: сахароспирт, например, маннит, сорбит, ксилит; аминокислота, например, гидрохлорид цистеина, метионин, глицин; витамин С; двунатриевая соль ЭДТА, ЭДТА кальция-натрия; неорганическая соль, например, карбонат, ацетат, фосфат одновалентного щелочного металла или его водный раствор, хлорид натрия, хлорид калия, пиросульфит натрия, бисульфит натрия, тиосульфат натрия; карбонат кальция, бикарбонат кальция; стеарат, например, стеарат кальция, стеарат магния; неорганическая кислота, например, соляная, серная, фосфорная кислота; органическая кислота, например, уксусная кислота; соль органической кислоты, например, лактат натрия; полисахарид, целлюлоза и ее производные, например, мальтоза, глюкоза, фруктоза, декстран, сахароза, лактоза, циклодекстрин (β-циклодекстрин), крахмал, меркаптоуксусная кислота; производное кремния; альгинат; желатин; PVP (поливинилпирролидон), глицерин; Tween-80, агаровый гель; поверхностно-активное вещество; фосфолипиды; каолин; порошок талька и т.д.

В соответствии с настоящим изобретением применение и доза препарата ТСМ зависит от клинического состояния пациента. В предпочтительном примере препарат TCM для лечения болезни Крона применяют в виде лекарственной формы раствора для клизмы, который вводят пациентам один или несколько раз в день, предпочтительно один раз в день, в количестве 60-80 мл за один раз, предпочтительно 80 мл за один раз. Доза препарата TCM может быть снижена при определенных условиях при его применении для предупреждения болезни Крона, например, но без ограничения, 1/2, 1/3 и 1/4 от терапевтически эффективной дозы.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Техническая схема согласно настоящему изобретению далее будет представлена более подробно с помощью следующих примеров получения и экспериментальных примеров. Однако следует понимать, что объем правовой охраны согласно настоящему изобретению не ограничивается этими примерами. В данном документе препарат TCM получен посредством способа, раскрытого в патенте Китая (CN 1192787 C).

Пример получения 1

Для получения препарата a TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

14 г драконовой крови, 84 г корня пиона красного, 28 г натурального индиго, 8,4 г красного галлуазита, 84 г кашу, 8,4 г жженых квасцов, 42 г корневища блетиллы и 8,4 г каламина.

Пример получения 2

Для получения препарата b TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

22,1 г драконовой крови, 69 г корня пиона красного, 25 г натурального индиго, 25 г красного галлуазита, 69 г кашу, 17 г жженых квасцов, 28 г корневища блетиллы и 22,1 г каламина.

Пример получения 3

Для получения препарата c TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

19 г драконовой крови, 67 г корня пиона красного, 27,1 г натурального индиго, 19 г красного галлуазита, 67 г кашу, 14,1 г жженых квасцов, 47 г корневища блетиллы и 17 г каламина.

Пример получения 4

Для получения препарата d TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

11 г драконовой крови, 91 г корня пиона красного, 19 г натурального индиго, 14 г красного галлуазита, 91 г кашу, 12,2 г жженых квасцов, 28 г корневища блетиллы и 11 г каламина.

Пример получения 5

Для получения препарата e TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

8 г драконовой крови, 97 г корня пиона красного, 14 г натурального индиго, 6 г красного галлуазита, 97 г кашу, 2,2 г жженых квасцов, 47 г корневища блетиллы и 6 г каламина.

Пример получения 6

Для получения препарата f TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

3 г драконовой крови, 42 г корня пиона красного, 16 г натурального индиго, 4 г красного галлуазита, 45 г кашу, 4 г жженых квасцов, 13 г корневища блетиллы и 5° г каламина.

Пример получения 7

Для получения препарата g TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

13 г драконовой крови, 56 г корня пиона красного, 23 г натурального индиго, 9 г красного галлуазита, 58 г кашу, 12 г жженых квасцов, 29 г корневища блетиллы и 9° г каламина.

Пример получения 8

Для получения препарата h TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

20 г драконовой крови, 71 г корня пиона красного, 35 г натурального индиго, 13 г красного галлуазита, 66 г кашу, 19 г жженых квасцов, 47 г корневища блетиллы и 13 г каламина.

Пример получения 9

Для получения препарата i TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

23 г драконовой крови, 95 г корня пиона красного, 44 г натурального индиго, 20 г красного галлуазита, 83 г кашу, 23 г жженых квасцов, 68 г корневища блетиллы и 19 г каламина.

Пример получения 10

Для получения препарата j TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

27 г драконовой крови, 110 г корня пиона красного, 56 г натурального индиго, 26 г красного галлуазита, 105 г кашу, 27 г жженых квасцов, 81 г корневища блетиллы и 25 г каламина.

Пример получения 11

Для получения препарата k TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

1 г драконовой крови, 16 г корня пиона красного, 1 г натурального индиго, 1 г красного галлуазита, 16 г кашу, 1 г жженых квасцов, 3 г корневища блетиллы и 1 г каламина.

Пример получения 12

Для получения препарата l TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

17 г драконовой крови, 40 г корня пиона красного, 20 г натурального индиго, 10 г красного галлуазита, 40 г кашу, 10 г жженых квасцов, 30 г корневища блетиллы и 10 г каламина.

Пример получения 13

Для получения препарата m TCM использовали сырьевые материалы при следующих значениях массы:

6 г драконовой крови, 94 г корня пиона красного, 20 г натурального индиго, 10 г красного галлуазита, 40 г кашу, 10 г жженых квасцов, 70 г корневища блетиллы и 10 г каламина.

Экспериментальный пример 1: предварительное исследование концентрации для оценки эффективности у данио-рерио в модели болезни Крона

К аквариумной воде, используемой для создания модели болезни Крона на данио-рерио линии AB дикого типа (1 л обратноосмотической воды с добавлением 200 мг быстрорастворимой морской соли с электропроводностью 480-510 мкСм/см, значением pH 6,9-7,2 и жесткостью, обусловленной наличием 53,7-71,6 мг/л CaCO₃) добавляли препарат (a) ТСМ, полученный посредством способа из Примера 1, при концентрации 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% и 1% по объему. Вместе с этим была создана контрольная группа. 30 данио-рерио обрабатывали с применением каждой концентрации препарата (a), на протяжении этого периода ежедневно подсчитывали количество погибших данио-рерио и в то же время убирали погибшую рыбу. Связь между концентрацией препарата TCM и летальностью представлена в таблице 1, и при этом кривая зависимости концентрация-летальность представлена на фиг. 1.

Таблица 1: статистическая связь между концентрацией препарата a и летальностью

Концентрация препарата a (%)	Количество погибших рыб	Летальность (%)
0,10	0	0
0,25	0	0
0,50	2	7
0,75	16	53
1,00	30	100

MNLC (максимальная нелетальная концентрация) препаратов TCM была рассчитана как 0,3% по объему с применением программного обеспечения OriginPro 8.0.

Экспериментальный пример 2: эффективность в модели болезни Крона на данио-рерио

Согласно результатам для концентраций, предварительно исследованных в экспериментальном примере 1, для оценки эффективности в модели болезни Крона на данио-рерио была представлена совокупность данных с 3 уровнями для группы обработки, соответственно, при объемных соотношениях 1/10 MNLC (0,03%), 1/3 MNLC (0,1%) и MNLC (0,3%). (Далее в данном документе сокращено как “группа 1 обработки препаратом a”, “группа 2 обработки препаратом a” и “группа 3 обработки препаратом a”). В то же время для исследования были созданы группа положительного контроля, контрольная группа без заболевания, группа модели болезни Крона и группа контроля вспомогательным веществом. В группе положительного контроля в аквариумной воде присутствовал преднизолон при конечной концентрации 10 мкМ. Для группы контроля вспомогательным веществом применяли вспомогательное вещество раствора для клизмы, раскрытое в патенте Китая (CN 1192787 C), включая добавление в аквариумную воду растворов PEG-400, содержащих трагакант и сорбат калия при объемной доле 0,3%. При этом раствор PEG-400 получали следующим способом: добавляли 1,5 г трагаканта и 2 г сорбата калия (с размером частиц 150 мкм) к 28 мл PEG.

Модель болезни Крона на данио-рерио получали с помощью TNBS (2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты), главным образом, вызывающей воспаление. Для каждой группы случайным образом выбирали 30 данио-рерио. Спустя 48 часов после соответствующей обработки вышеуказанным препаратом (a) TCM (при трех концентрациях, упомянутых выше) в группе обработки, вышеуказанным преднизолоном в группе положительного контроля и вышеуказанным вспомогательным веществом в группе контроля вспомогательным веществом для наблюдения и получения фотографий из каждой группы случайным образом отбирали 10 рыб. Для анализа фотографий применяли программное обеспечение для анализа изображений. Кроме того, под микроскопом тщательно исследовали толщину слизистой оболочки кишечника, диаметр кишечника и площадь поверхности кишечника, причем осуществляли количественный анализ диаметра кишечника и площади поверхности кишечника. Для каждой группы терапевтический показатель исследуемого лекарственного средства для данио-рерио с болезнью Крона рассчитывали в соответствии с площадью поверхности кишечника. Формула расчета представлена следующим образом.

Терапевтический показатель (%) = [1 - (группа обработки - контрольная группа без заболевания)/(модельная группа - контрольная группа без заболевания)] × 100%.

Результаты статистического анализа были представлены как среднее значение ± SE. Для сравнения множества групп применяли дисперсионный анализ, а для сравнения двух групп применяли t-критерий Даннетта. Наблюдали статистически значимую разницу при p<0,05.

Как показано на фиг. 2 - фиг. 4, в контрольной группе без заболевания слизистая оболочка кишечника была целостной и с выраженными складками. В модельной группе (болезнь Крона) кишечник данио-рерио был расширен (выражено при помощи соотношения площади поверхности кишечника в модельной группе и в контрольной группе без заболевания, аналогично дальше), площадь поверхности кишечника увеличена, слизистая оболочка кишечника истончена, и при этом складки не наблюдались. В группе положительного контроля расширение кишечника данио-рерио было снижено, уменьшена площадь поверхности кишечника, и при этом складки кишечника в значительной степени восстанавливались. В группе 2 обработки и группе 3 обработки с применением препарата (a) TCM (препарат (a) вводили при концентрации 0,1% и 0,3%, соответственно), расширение кишечника данио-рерио было значительно снижено, площадь поверхности кишечника восстанавливалась до нормального значения, и при этом складки кишечника по существу восстанавливались. В группе контроля вспомогательным веществом у данио-рерио с болезнью Крона не наблюдалось никакого терапевтического эффекта.

Терапевтический показатель для преднизолона в группе положительного контроля в модели болезни Крона составлял 74 ± 3,40%, причем наблюдали статистически значимую разницу (p<0,01) по сравнению с модельной группой. В группе 1 обработки препаратом (a) при концентрации 0,3% наблюдали показатель частичного терапевтического ответа 39 ± 9,30%. В группах 2 и 3 обработки препаратом (a) терапевтический показатель составлял 70 ± 7,49% и 73 ± 4,81%, соответственно, причем наблюдали значительную статистически значимую разницу (p<0,001) по сравнению с модельной группой.

В таблице 2 представлен терапевтический показатель исследуемых лекарственных средств для данио-рерио в модели болезни Крона.

Таблица 2: терапевтический показатель исследуемых лекарственных средств для данио-рерио в модели болезни Крона

Группы	Площадь поверхности кишечника	Диаметр кишечника	Терапевтический показатель (%) (среднее значение ± SE)
Площадь поверхности кишечника (среднее значение ± SD)	Показатель для контрольной группы без заболевания (среднее значение ± SE)	Диаметр кишечника (среднее значение ± SD)	Показатель для контрольной группы без заболевания (среднее значение ± SE)
Контрольная группа без заболевания	37230 ± 5249	1,00 ± 0,03	134 ± 11	1,00 ± 0,03	-
Модельная группа	80867 ± 16370	2,17 ± 0,14	206 ± 15	1,53 ± 0,04	-
Группа положительного контроля	48646 ± 4685*	1,31 ± 0,04*	137 ± 11*	1,02 ± 0,03*	74 ± 3,40*
Группа контроля вспомогательным веществом	74635 ± 10653	2,14 ± 0,09	194 ± 10	1,45 ± 0,02	3 ± 7,73
Группа 1 обработки препаратом a	64036 ± 12872**	1,72 ± 0,11**	185 ± 21**	1,38 ± 0,05**	39 ± 9,33**
Группа 2 обработки препаратом a	50532 ± 10328**	1,36 ± 0,09**	143 ± 16**	1,06 ± 0,04**	70 ± 7,49**
Группа 3 обработки препаратом a	48955 ± 6628**	1,31 ± 0,06**	131 ± 27**	0,97 ± 0,06**	73 ± 4,81**

Примечание: по сравнению с модельной группой, * p<0,01，** p<0,001.

Как показано в таблице выше, препарат TCM характеризовался очень хорошим терапевтическим эффектом в отношении болезни Крона, и при этом такой терапевтический эффект в отношении болезни Крона был продемонстрирован даже при низкой концентрации.

Экспериментальный пример 3: эффект в отношении регрессии воспаления у данио-рерио в модели болезни Крона

Применяли способ, аналогичный способу для экспериментального примера 2, за исключением того, что использовали трансгенных данио-рерио с нейтрофилами с флуоресцентной меткой. В модели болезни Крона на трансгенных данио-рерио с нейтрофилами с флуоресцентной меткой к аквариумной воде добавляли препарат (a) TCM, полученный с помощью способа из примера 1, при объемной доле 0,03%, 0,1% и 0,3% для оценки эффекта препарата на регрессию воспаления в модели болезни Крона на данио-рерио.

Для количественного анализа распределения нейтрофилов в воспаленной ткани применяли программное обеспечение для анализа изображений. Показатель регрессии воспаления для исследуемых лекарственных средств в модели болезни Крона на данио-рерио рассчитывали исходя из количества нейтрофилов в кишечнике. Формула для расчета регрессии воспаления представлена следующим образом.

Показатель регрессии воспаления (%) = [1 - (группа обработки - контрольная группа без заболевания)/(модельная группа - контрольная группа без заболевания)] × 100%.

Результаты статистического анализа были представлены как среднее значение ± SE. Применяли дисперсионный анализ и t-критерий Даннетта. Наблюдали статистически значимую разницу при p<0,05.

Как показано на фиг. 5 - фиг. 7, некоторое количество нейтрофилов было обнаружено в ткани кишечника данио-рерио в контрольной группе без заболевания. В модели болезни Крона кишечник характеризовался выраженным расширением, также в ткани кишечника наблюдалась инфильтрация большого количества нейтрофилов, что указывало на сильное воспаление. В группе положительного контроля (преднизолон) количество нейтрофилов в ткани кишечника было существенно снижено. В группах 1, 2 и 3 обработки препаратом (a) TCM количество нейтрофилов было снижено. В группе контроля вспомогательным веществом все еще наблюдалось большое количество нейтрофилов, скопившихся в ткани кишечника.

Для преднизолона в группе положительного контроля показатель регрессии воспаления составлял 81 ± 2,48%, причем наблюдали статистически значимую разницу (p<0,01) по сравнению с модельной группой. Терапевтический показатель для групп 1, 2 и 3 обработки препаратом (a) составлял 49 ± 3,50%, 63 ± 6,48% и 77 ± 3,50%, соответственно, причем в каждой группе наблюдали значительную статистически значимую разницу (p<0,001) по сравнению с модельной группой.

Показатель регрессии воспаления для исследуемого лекарственного средства в модели болезни Крона на данио-рерио представлен в таблице 3.

Таблица 3: показатель регрессии воспаления для исследуемого лекарственного средства в модели болезни Крона на данио-рерио

Группы	Количество нейтрофилов (среднее значение ± SD)	Показатель для контрольной группы без заболевания (среднее значение ± SE)	Показатель регрессии воспаления (%)(среднее значение ± SE)
Контрольная группа без заболевания	18 ± 2	1,00 ± 0,05	-
Модельная группа	40 ± 3	2,20 ± 0,06	-
Группа положительного контроля	20 ± 1*	1,22 ± 0,03*	81 ± 2,48*
Группа контроля вспомогательным веществом	37 ± 2	2,11 ± 0,05	7 ± 3,79
Группа 1 обработки препаратом a	29 ± 2*	1,61 ± 0,04*	49 ± 3,50*
Группа 2 обработки препаратом a	26 ± 4*	1,44 ± 0,08*	63 ± 6,48*
Группа 3 обработки препаратом a	23 ± 2*	1,28 ± 0,04*	77 ± 3.50 *

Приме