Терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза

Терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза

Реферат

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза, содержащему агонист рецепторов стимулятора секреции гормона роста в качестве активного ингредиента.

Предшествующий уровень техники

[0002] Боковой амиотрофический склероз (далее в настоящем описании обозначаемый как ALS), наиболее распространенная болезнь мотонейронов взрослых, представляет собой нейродегенеративное заболевание, включающее избирательную и общую гибель верхних и нижних мотонейронов. В результате гибели мотонейронов возникает мышечная атрофия и мышечная слабость верхних и нижних конечностей, при этом в большинстве случаев прогрессирование заболевания также включает симптомы бульбарного паралича, такие как трудности речи или проглатывания, и паралич дыхательных мышц. ALS преимущественно развивается в среднем возрасте или позже. Это заболевание является настолько тяжелым, что многие пациенты погибают от дыхательной недостаточности через 2-3 года после начала заболевания, если не проводят контроль за дыханием с использованием респираторов. Высшие функции, такие как интеллект и чувствительность, сохраняются, несмотря на системную атрофию и слабость мышц, включая дыхательные мышцы (непатентная литература 1).

[0003] Ген Cu/Zn-супероксиддисмутазы (SOD1) считают одним из каузативных генов ALS. На трансгенных мышах или крысах, несущих мутантные гены SOD1, выделяемые у пациентов с ALS, в качестве патологии ALS человека было выявлено, что мотонейроны избирательно гибнут после созревания, и развивается атрофия скелетных мышц или мышечная слабость, что является причиной смерти. Эти трансгенные мыши или крысы, несущие мутантные гены SOD1, были признаны в качестве моделей ALS на животных, и их общепринято использовали в патологическом анализе ALS или исследовании терапевтических средств для этого заболевания. В частности, наиболее развивалось исследование с использование трансгенных мышей, у которых экспрессируются мутантные белки, получаемые из SOD1 человека заменой Gly (G) в положении 93 на Ala (A), т.е. трансгенных мышей, несущих мутантный ген SOD1 (G93A) (далее в настоящем описании обозначаемых как мыши SOD1^G93A), и испытание с использованием этих животных рекомендовано Европейской группой по ALS/MND (непатентная литература 2).

[0004] Единственным терапевтическим средством для ALS ободренным в настоящее время во всем мире является рилузол. Это лекарственное средство антагонизирует токсичность глутамата, которая, как опубликовано, является одним из факторов, вызывающих начало ALS. Однако лекарственное средство оказывает продлевающий жизнь эффект только на несколько месяцев и, таким образом, является эффективным только в ограниченной степени (непатентная литература 1).

[0005] Грелин представляет собой пептидный гормон, открытый как эндогенный лиганд рецептора стимулятора секреции гормона роста (далее в настоящем описании обозначаемого как GHS-R) (непатентная литература 3). Грелин способствует секреции гормона роста (далее в настоящем описании обозначаемого как GH) у людей и животных (непатентная литература 4 и т.д.).

Известно, что GH способствует продукции инсулиноподобного фактора роста-1 (далее в настоящем описании обозначаемого как IGF-1) в печени и скелетных мышцах, кроме того IGF-1 известен как трофический фактор мотонейронов. Инъекция рекомбинантного вирусного вектора AAV4, содержащего ген IGF-1, в боковые желудочки мышей SOD1^G93A значительно увеличивает периоды их выживания и значительно подавляет снижение двигательной функции и мышечной силы (патентная литература 1). Хотя этот доклад, демонстрировал, что такие эффекты являлись обусловленными усиленной экспрессией IGF-1 в головном мозге, сверхэкспрессия IGF-1 человека в скелетных мышцах мышей SOD1^G93A не оказывала влияния на гибель мотонейронов или периоды выживаемости (непатентная литература 5). Когда GH или IGF-1 вводили пациентам с ALS в клинических испытаниях, терапия GH являлась неэффективной (непатентная литература 6), и для IGF-1 не выявляли эффективности в отношении любого из параметров, таких как мышечная сила, функциональные исходы и периоды выживаемости пациентов с ALS (непатентная литература 7). Таким образом, активация периферической системы GH или IGF-1 не является эффективной для ALS. Грелин также способствует секреции GH из гипофиза и повышает концентрации GH в крови (например, непатентная литература 3 и 4), но не известно, оказывает ли он эффект повышения IGF-1 в головном мозге или спинном мозге. Таким образом, точно неизвестно, является ли грелин эффективным для патологии ALS.

Также грелин является единственным известным периферическим орексигенным пептидом, который по имеющимся данным увеличивает потребление пищи у людей и животных (например, непатентная литература 4). ALS представляют собой заболевание, включающее атрофию скелетных мышц и потерю мышечной силы, вызываемую гибелью мотонейронов, приводящую к смерти. Введение грелина может увеличивать потребление пищи и, таким образом, поддерживать массу тела или массу скелетных мышц. Однако взаимосвязь таких эффектов грелина и подавления гибели мотонейронов остается неизвестной. Таким образом, точно неизвестно, является ли грелин эффективным в отношении патологии ALS.

[0006] Опубликовано, что среди пациентов с ALS для пациенты, у которых отмечают высокое отношение LDL/HDL в крови и у которых выявляют гиперлипидемию, обнаруживают больший период выживания, по меньшей мере на 12 месяцев, по сравнению с другими пациентами с ALS, что свидетельствует о том, что гиперлипидемия является прогностическим фактором выживания пациентов с ALS (непатентная литература 8). Аналогично, было опубликовано, что для пациентов с ALS с высокой концентрацией холестерина или триглицерида в крови существует хороший прогноз (непатентная литература 9).

Согласно одному из докладов введение грелина мышам не оказывало влияния на их концентрации триглицерида в крови, но повышало концентрации общего холестерина в крови (непатентная литература 10). Согласно другому докладу грелин является пригодным для лечения гиперлипидемии (патентная литература 2).

Также повторное введение грелина в течение 3 недель пациентам с хроническим воспалением органов дыхания приводило к увеличению их массы тела или состоянию питания, но не оказывало влияние на концентрации холестерина в крови (непатентная литература 11).

Как указано выше, еще не были получены определенные данные касательно влияния грелина на уровни холестерина или триглицерида в крови.

[0007] По имеющимся данным в случае, когда гибель клеток индуцировали повышением внутриклеточных уровней кальция (Ca) посредством обработки иономицином эмбриональных нейронов гиппокампа крыс, для соединений агонистов GHS-R грелина крысы, пралморелина (релизинг-пептид гормона роста-2 (далее в настоящем описании обозначаемый как GHRP-2)), гексарелина и MK-0677 демонстрировали подавляющее действие в отношении гибели клеток. В этом докладе ALS обозначают как неишемическое нейродегенеративное заболевание, для которого группа соединений является эффективной (патентная литература 3). ALS представляет собой заболевание зрелого возраста, включающее избирательную гибель мотонейронов, при которой клетки гиппокампа не повреждаются. Таким образом, даже если GHRP-2 или грелин подавляли in vitro гибель эмбриональных нейронов гиппокампа крыс, индуцированную повышением концентраций Ca, точно неизвестно, являются ли эти соединения эффективными для ALS.

[0008] Опубликовано, что грелин подавляет гибель мотонейронов, индуцируемую глутаматом в системе органотипической культуры спинного мозга in vitro крыс (непатентная литература 12 и 13). К сожалению, система органотипической культуры спинного мозга in vitro не может в достаточной степени отражать патологию сложного заболевания, такого как ALS.

[0009] Опубликовано, что пралморецин (GHRP-2) увеличивает отношение получаемых из феохромоцитома надпочечников крыс клеток PC-12, содержащих дендриты и аксоны в 1,5 раза больше, чем размер клеток, приблизительно в 1,2 раза по сравнению с контрольной группой (патентная литература 4). Вследствие того, что клетки не являются мотонейронами, невозможно оценить, является ли пригодным GHRP-2 для ALS или не является.

[0010] Согласно докладу по модели проксимальной аксонопатии на мышах, индуцируемой введением 1,2-диацетилбензола, одномоментное введение релизинг-пептида-6 гормона роста агониста GHS-R (далее в настоящем описании обозначаемого как GHRP-6) и фактор роста клеток EGF улучшало с точки зрения поведения способность мышей передвигаться, а также значительно улучшало потенциалы действия скелетных мышц, тогда как введение каждого соединения отдельно только ускоряло восстановление измененного паттерна походки (непатентная литература 14). Вследствие того, что используемые в этом эксперименте модели на животных имели отличную клиническую патологию по сравнению с ALS, невозможно оценить, является ли GHRP-6 пригодным или является непригодным для ALS.

[0011] В дополнительных докладах описано, что антагонисты рецептора GHS-R на основе грелина являются пригодными для лечения ALS (патентная литература 5 и 6). Таким образом, невозможно сделать вывод, что агонисты GHS-R, включая грелин, являются пригодными для лечения ALS.

Список цитирования

Патентная литература

[0012] Патентная литература 1: WO2007/146046

Патентная литература 2: выложенный патент Японии № 2008-127377

Патентная литература 3: WO01/047558

Патентная литература 4: выложенный патент Японии № 2005-239712

Патентная литература 5: US7829589

Патентная литература 6: US2012/0080747

Непатентная литература

[0013] Непатентная литература 1: Expert Opinion on Emerging Drugs (2011), vol. 16 (No. 2), p. 537-558

Непатентная литература 2: Amyotrophic Lateral Sclerosis (2010), vol. 11, p. 38-45

Непатентная литература 3: Nature (1999), vol. 402, p. 656-660

Непатентная литература 4: Physiological Reviews (2005), vol. 85, p. 495-522

Непатентная литература 5: Experimental Neurology (2007), vol. 207, p. 52-63

Непатентная литература 6: Muscle & Nerve (1993), vol. 16 (№6), p. 624-633

Непатентная литература 7: Neurology (2008), vol. 71, p. 1770-1775

Непатентная литература 8: Neurology (2008), vol. 70, p. 1004-1009

Непатентная литература 9: Journal of Neurology (2011), vol. 258 (№4), p. 613-617

Непатентная литература 10: Nature Neuroscience (2010), vol. 13 (№7), p. 877-883

Непатентная литература 11: Pulmonary Pharmacology & Therapeutics (2008), vol. 21 (№5), p. 774-779

Непатентная литература 12: Experimental Neurology (2011), vol. 230, p. 114-122

Непатентная литература 13: Korean Journal of Physiology and Pharmacology (2012), vol. 16 (№1), p. 43-48

Непатентная литература 14: Neurotoxicity Research (2011), vol. 19, p. 195-209

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0014] Рилузол, существующее терапевтическое средство для ALS, является клинически эффективным в ограниченной степени. Несмотря на то, что уже прошло 15 или более лет с момента выпуска этого лекарственного средства, тем временем были клинически разработаны различные соединения, все еще необходимо разрабатывать терапевтическое средство для ALS. Таким образом, существует значительная нереализованная потребность медицины в разработке эффективных против ALS терапевтических средств. Целью настоящего изобретения является предоставление терапевтического средства для ALS, для которого не существует эффективного лекарственного средства, где терапевтическое средство способно подавлять патологическое прогрессирование ALS и эффективно лечить это заболевание.

Решение проблемы

[0015] Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования с терапевтическими средствами, пригодными против ALS, для которого не существует полностью (или достаточно) эффективного лекарственного средства, в частности лекарственными средствами, способными более эффективно лечить ALS по сравнению с только одним существующим лекарственным средством рилузол. В результате авторы настоящего изобретения выполнили настоящее изобретение путем открытия того, что агонисты GHS-R оказывают более эффективное защитное для мотонейронов действие, чем защитное действие существующего лекарственного средства. В частности, настоящее изобретение относится к следующим ниже аспектам:

[0016] (1) Терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза, содержащее агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, для введения индивидууму, страдающему боковым амиотрофическим склерозом без тяжелой дисфагии.

[0017] (2) Терапевтическое средство по п. (1), где индивидуум также является невосприимчивым или недостаточно восприимчивым к существующему терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза.

(3) Терапевтическое средство по п. (1) или (2), где терапевтическое средство используют в комбинации с существующим терапевтическим средством для бокового амиотрофического склероза.

(4) Терапевтическое средство по п. (2) или (3), где существующее терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза представляет собой рилузол

[0018] (5) Терапевтическое средство по любому из пп. (1)-(4), где терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза, содержащее агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, вводят посредством подкожной инъекцией.

[0019] (6) Терапевтическое средство по любому из пп. (1)-(5), где агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста представляет собой грелин, пралморелин, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин, ибутаморена мезилат, улиморелин, анаморелин, мациморелин, капроморелин или SM-130686.

[0020] (7) Терапевтическое средство по п. (6), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, или пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с делецией, заменой и/или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в положении 5-28 от N-конца SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, введенной в боковую цепь аминокислотного остатка, и обладающее активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с рецептором стимулятора секреции гормона роста.

[0021] (8) Терапевтическое средство по п. (7), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой при гидроксигруппе в боковую цепь аминокислотного остатка.

[0022] (9) Терапевтическое средство по п. (8), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка от N-конца является ацетилированной н-октаноиловой группой.

(10) Способ лечения бокового амиотрофического склероза, включающий введение терапевтического средства для бокового амиотрофического склероза, содержащего агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, индивидууму, страдающему боковым амиотрофическим склерозом без тяжелой дисфагии.

(11) Способ лечения по п. (10), где индивидуум также является невосприимчивым или недостаточно восприимчивым к существующему терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза.

(12) Способ лечения по п. (10) или (11), где терапевтическое средство вводят в комбинации с существующим терапевтическим средством для бокового амиотрофического склероза.

(13) Способ лечения по п. (11) или (12), где существующее терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза представляет собой рилузол.

(14) Способ лечения по любому из пп. (10)-(13), где терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза, содержащее агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, вводят посредством подкожной инъекции.

(15) Способ лечения по любому из пп. (10)-(14), где агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста представляет собой грелин, пралморелин, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин, ибутаморена мезилат, улиморелин, анаморелин, мациморелин, капроморелин или SM-130686.

(16) Способ лечения по п. (15), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, или пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с делецией, заменой и/или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в положении 5-28 от N-конца SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, и обладающее активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с рецептором стимулятора секреции гормона роста.

(17) Способ лечения по п. (16), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой при гидроксигруппе в боковую цепь аминокислотного остатка.

(18) Способ лечения по п. (17), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка от N-конца является ацетилированной н-октаноиловой группой.

(19) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль для лечения бокового амиотрофического склероза путем введения индивидууму, страдающему боковым амиотрофическим склерозом без тяжелой дисфагии.

(20) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (19), где индивидуум также является невосприимчивым или недостаточно восприимчивым к существующему терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза.

(21) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (19) или (20), где при лечении агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль используют в комбинации с существующим терапевтическим средством для бокового амиотрофического склероза.

(22) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (20) или (21), где существующее терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза представляет собой рилузол.

(23) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. (19)-(22), где введение агониста рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемой соль индивидууму представляет собой введение в форме подкожной инъекции.

(24) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. (19)-(23), где агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста представляет собой грелин, пралморелин, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин, ибутаморена мезилат, улиморелин, анаморелин, мациморелин, капроморелин или SM-130686.

(25) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (24), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, или пептид соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с делецией, заменой и/или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в положении 5-28 от N-конца SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, и обладающее активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с рецептором стимулятора секреции гормона роста.

(26) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (25), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой при гидроксигруппе в боковую цепь аминокислотного остатка.

(27) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (26), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка от N-конца является ацетилированной н-октаноиловой группой.

Полезные эффекты изобретения

[0023] Агонист GHS-R по настоящему изобретению обладает эффектом увеличения периодов выживаемости в результате подавления патологического прогрессирования ALS и по существу является очень пригодным для лечения ALS, для которого не существует эффективного лекарственного средства. Кроме того, агонист GHS-R по настоящему изобретению является дополнительно пригодным, т.к. он обладает эффектом подавления мышечной слабости путем ингибирования снижения числа мотонейронов, характерного для патологического начала и прогрессирования ALS, и, таким образом, заметно подавляет гибель клеток. Агонист GHS-R по настоящему изобретению превосходит по этим эффектам рилузол, существующее терапевтическое средство для ALS, и удовлетворяет давнюю нереализованную потребность медицины, т.к. агонист GHS-R может увеличивать периоды выживания, даже при введении с момента времени, когда рилузол не является больше эффективным. Кроме того, агонист GHS-R по настоящему изобретению обладает защитным для мотонейронов эффектом и подавляет мышечную слабость, что приводит не только к увеличенным периодам выживания, но и к улучшенному качеству жизни во время периодов выживания. Кроме того, вследствие этого защитного для мотонейронов эффекта агонист GHS-R является пригодным против болезней или нарушений мотонейронов, отличных от ALS, например, спинальной мышечной атрофии.

Описание вариантов осуществления

[0024] В качестве агониста GHS-R по настоящему изобретению можно использовать известное в данной области пептидное или непептидное соединение. Примеры пептидного соединения включают эндогенный лиганд грелин, а также пралморелин (GHRP-2), GHRP-6, гексарелин и ипаморелин. Примеры непептидного соединения включают ибутаморена мезилат (MK-0677), улиморелин (TZP-101), анаморелин (RC-1291), мациморелин (AEZS-130), капроморелин (CP-424391),и SM-130686. Среди этих пептидных соединений грелин является особенно желательным. Среди этих непептидных соединений, анаморелин является особенно желательным.

[0025] Примеры грелина могут включать получаемый от человека грелин и грелин, получаемый от любого другого животного, такого как крысы, мыши, свиньи и крупный рогатый скот, и их производные (см. например, международную публикацию № WO01/07475). В случае, когда индивидуум-реципиент представляет собой человека, желательно использовать получаемый от человека грелин. Получаемый от человека грелин представляет собой пептидное соединение, состоящее из 28 аминокислот (SEQ ID NO: 1), в которых гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка (серин) при подсчете от N-конца является ацетилированной жирной кислотой (н-октаноиловой группой).

Эндогенный лиганд грелин представляет собой гормон, существующий in vivo, и может служить, в частности, в качестве в высшей степени безопасного терапевтического средства для ALS, т.к. его безопасность при введении людям уже была подтверждена.

[0026] В качестве производного грелина можно использовать пептид, содержащий аминокислотную последовательность, получаемую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, путем делеции, замены и/или добавления одной или нескольких аминокислот, выбранных из с 5 по 28 аминокислотных остатков при подсчете от N-конца, в которой 3-ий аминокислотный остаток (серин) при подсчете от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь (гидроксигруппу) аминокислотного остатка, и обладающий активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с GHS-R (см. международную публикацию № WO01/07475).

В этом контексте используемый в настоящем описании термин "несколько" означает от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или 1, или 2.

Желательно аминокислотная последовательность производного грелина обладает 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, особенно предпочтительно 95%, наиболее предпочтительно 97% гомологией с природной аминокислотной последовательностью. Это справедливо для варианта сплайсинга (SEQ ID NO: 2) получаемого от человека грелина, состоящего из 27 аминокислот.

[0027] Касательно активности производного герлина в качестве показателя можно использовать агонистическую активность в отношении GHS-R или биологическую активность, описанную в указанной выше публикации. На основании этого показателя можно выбирать представляющее интерес производное грелина. Например, можно анализировать агонистическую активность по отношению к GHS-R с использованием внутриклеточной концентрацию ионов кальция в качестве показателя. Этот показатель можно измерять известным в данной области способом и, например, можно использовать FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices, LLC), основанного на изменении интенсивности флуоресценции Fluo-4AM (Molecular Probes) в результате изменения концентрации ионов кальция. Кроме того, орексигенную активность in vivo пептидного или непептидного соединения, обладающего повышающим концентрацию кальций действием, можно подтверждать известным в данной области способом. Например, для подтверждения его орексигенного эффекта на здоровых мышах пептидное или непептидное соединение, обладающее повышающим концентрацию кальция действием, вводят подкожно или интраперитонеально животным и через 1 час после введения можно сравнивать их потребление пищи с группой, которой вводят носитель.

[0028] В качестве пралморелина (GHRP-2) можно использовать D-аланил-D-(2-нафтил)аланил-L-аланил-L-триптофил-D-фенилаланил-L-лизинамид (патент США № 5663146).

[0029] В качестве GHRP-6 можно использовать L-гистидил-D-триптофил-L-аланил-L-триптофил-D-фенилаланил-L-лизинамид (Endocrinology (1984), vol. 114 (No. 5), p. 1537-1545).

[0030] В качестве гексарелина можно использовать L-гистидил-2-метил-D-триптофил-L-аланил-L-триптофил-D-фенилаланил-L-лизинамид (патент США № 5646301).

[0031] В качестве ипаморелина можно использовать α-метилаланил-L-гистидил-D-b-(2-нафтил)-L-аланил-D-фенилаланил-L-лизинамид (Journal of Medicinal Chemistry (1998), vol. 41, p. 3699-704).

[0032] В качестве ибутаморена мезилата (MK-0677) можно использовать мезилат 2-амино-2-метил-N-[(1R)-2-(1-метансульфонилспиро[индолин-3,4'-пиперидин]-1'-ил)-2-оксо-1-(фенилметоксиметил)этил]пропанамида (патент США № 5536716).

[0033] В качестве улиморелина (TZP-101) можно использовать 5(S)-циклопропил-11(R)-(4-фторбензил)-2(R),7,8(R)-триметил-2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,13,14,15,16-тетрадекагидро-1,4,7,10,13-бензоксатетраазациклооктадецин-6,9,12-трион (патент США № 7476653).

[0034] В качестве анаморелина можно использовать 2-амино-N-{(1R)-2-[3-бензил-3-(N,N',N'-триметилгидразинокарбонил)пиперидин-1-ил]-1-((1H-индол-3-ил)-2-оксоэтил)-2-метилпропионамид} (патент США № 6576648).

[0035] В качестве мациморелина (AEZS-130) можно использовать 2-метилаланил-N-[1(R)-формамидо-2-(1H-индол-3-ил)этил]-D-триптофанамид (патент США № 6861409).

[0036] В качестве капроморелина (CP-424391) можно использовать 2-амино-N-[2-[3a(R)-бензил-2-метил-3-оксо-3,3a,4,5,6,7-гексагидро-2H-пиразоло[4,3-c]пиридин-5-ил]-1(R)-(бензилоксиметил)-2-оксоэтил]изобутирамид (патент EP № 0869968).

[0037] В качестве можно использовать SM-130686 гидрохлорид (+)-3(S)-(2-хлорфенил)-1-[2-(диэтиламино)этил]-3-гидрокси-2-оксо-4-(трифторметил)-2,3-дегидро-1H-индол-6-карбоксиамида (патент США № 6576656).

[0038] Соль агониста GHR-S, которую можно использовать в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой фармацевтически приемлемую соль. Ее примеры включают соли с неорганическими основаниями, соли с органическими основаниями, соли с неорганическими кислотами, соли с органическими кислотами и соли с основными или кислыми аминокислотами.

[0039] Предпочтительные примеры солей с неорганическими основаниями включают: соли щелочных металлов, такие как натриевая соль и калиевая соль; соли щелочноземельных металлов, такие как кальциевая соль и магниевая соль, и соль алюминия и аммонийную соль.

[0040] Предпочтительные примеры солей с органическими основаниями включают триметиламин, триэтиламин, пиридин, пиколин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, дициклогексиламин и N,N'-дибензилэтилендиамин.

[0041] Предпочтительные примеры солей с неорганическими кислотами включают соли с соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, азотной кислотой, серной кислотой и фосфорной кислотой.

[0042] Предпочтительные примеры солей с органическими кислотами включают соли с муравьиной кислотой, уксусной кислотой, трифторуксусной кислотой, фумаровой кислотой, щавелевой кислотой, винной кислотой, малеиновой кислотой, лимонной кислотой, янтарной кислотой, яблочной кислотой, метансульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой и пара-толуолсульфоновой кислотой.

[0043] Предпочтительные примеры солей с основными аминокислотами включают соли с аргинином, лизином и орнитином. Предпочтительные примеры солей с кислыми аминокислотами включают соли с аспарагиновой кислотой и глутаминовой кислотой.

Среди этих солей предпочтительной является натриевая соль или калиевая соль.

[0044] Агонист GHS-R по настоящему изобретению можно получать общепринятым способом. Например, агонист GHS-R по настоящему изобретению можно выделять из природного сырья или можно получать технологией рекомбинантной ДНК и/или способом химического синтеза.

[0045] В случае получения пептидного соединения по настоящему изобретению с использованием технологии рекомбинантной ДНК, примеры векторов для введения в представляющий интерес ген, кодирующий пептидное соединение по настоящему изобретению, включают векторы на основе E. coli (pBR322, pUC18, pUC19 и т.д.), векторы на основе Bacillus subtilis (pUB110, pTP5, pC194 и т.д.), дрожжевые векторы (типов YEp, YRp и YIp) и векторы на основе животной клетки (ретровируса, вируса оспавакцины и т.д.). Можно использовать другой вектор при условии, что вектор может обеспечивать то, что клетки-хозяева стабильно несут представляющий интерес ген. Векторы переносят в соответствующие клетки-хозяева. В качестве способа введения представляющего интерес гена в плазмиды можно использовать способ, описанный, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или способ переноса плазмид в клетки-хозяева.

[0046] В плазмидах промотор является функционально связанным выше гена для экспрессии представляющего интерес гена пептида.

Используемый в настоящем изобретении промотор может представлять собой любой промотор, подходящий для клеток-хозяев для применения для экспрессии представляющего интерес гена. В случае, когда клетки-хозяева необходимо трансформировать, например, бактериальными клетками рода Escherichia, можно использовать промотор lac, промотор trp, промотор lpp, промотор λPL, промотор recA или т.п. Для клеток-хозяев рода Bacillus можно использовать промотор SPO1, промотор SPO2 или т.п. Для дрожжевых клеток можно использовать промотор GAP, промотор PHO5, промотор ADH или т.п. Для животных клеток можно использовать получаемый из SV40 промотор, получаемый из ретровирусов промотор или т.п.

[0047] Получаемые таким образом векторы, содержащие представляющий интерес ген используют для трансформации клеток-хозяев. В качестве клеток-хозяев можно использовать бактериальные клетки (например, рода Escherichia и Bacillus), дрожжевые клетки (например, рода Saccharomyces, Pichia и Candida), животные клетки (например, клетки CHO и клетки COS) или т.п. В качестве среды для культивирования подходящей является жидкая среда. Особенно предпочтительно среда содержит источник углерода, источник азота и т.п., необходимый для роста трансформированных клеток, которые необходимо культивировать. При желании в среду можно дополнительно добавлять витамины, стимулятор роста, сыворотку и т.п.

[0048] После культивирования пептидное соединение по настоящему изобретению выделяют и очищают от культур общепринятым способом. Например, для экстракции представляющего интерес вещества из культивируемых клеток микроорганизмов или животных клеток эти клетки, культивируемые таким образом, собирают, затем суспендируют в буферном растворе, содержащем денатурирующее белок средство (гидрохлорид гуанидина и т.д.) и разрушают с использованием ультразвука, например, с последующим центрифугированием. Затем представляющее интерес вещество можно очищать от супернатанта подходящей комбинацией способов отделения и очистки, таких как гель-фильтрация, ультрафильтрация, диализ, SDS-PAGE и различные хроматографические способы, учитывая молекулярную масса, растворимость, заряд (изоэлектрическую точку), аффинность и т.д. представляющего интерес вещества.

[0049] В случае получения пептидного соединения по настоящему изобретению способом химического синтеза, например, аминокислоты с защитными группами подвергают конденсации жидкофазным способом и/или твердофазным способом для удлинения пептидной цепи. Все защитные группы удаляют кислотой. Получаемый неочищенный продукт очищают известным в данной области способом очистки с получением пептидного соединения по настоящему изобретению.

[0050] Грелин и его производное по настоящему изобретению также можно получать общепринятыми способами. Например, грелин и его производное по настоящему изобретению можно выделять или очищать из природного сырья или можно получать технологией рекомбинантной ДНК и/или способом химического синтеза.

[0051] Вследствие того, что грелин содержит модифицированный (ацетилированный) аминокислотный остаток в своей боковой цепи, аминокислотный остаток можно модифицировать (ацетилировать) реакцией модификации в соответствии с известным в данной области подходом. Например, в способе получения с использованием технологии рекомбинантной ДНК культивируют клетки-хозяева, трансформированные экспрессирующими векторами, содержащими ДНК, кодирующую грелин или его производное, и представляющий интерес пептид можно собирать из культур с получением грелина или его производного по настоящему изобретению. Для получением модифицированного (ацетилированного) соединения представляющего интерес пептид в клетках клетки-хозяева можно подвергать скринингу. Например, для непосредственного получения модифицированного жирной кислотой (ацетилированного) пептидного соединения желательно использовать клетки, обладающие процессирующей протеазной активностью, способной расщеплять полипептид-предшественник пептида в подходящем положении и обладающие активностью ацетилирования остатка серина в пептиде. Такие клетки-хозяева, обладающие процессирующей протеазной активностью и активностью ацетилирования и серина можно отбирать путем трансформации клеток-хозяев экспрессирующими векторами, содержащими кДНК, кодирующую полипептид-предшественник, и подтверждения, что трансформированные клетки продуцируют модифицированное жирной кислотой пептидное соединение, обладающее повышающей концентрацию кальция активностью или активностью стимуляторной секреции гормона роста.

[0052] В способе получения способом химического синтеза, например, аминокислоты с защитными группами подвергают конденсации жидкофазным способом и/или твердофазным способ