Антитела, специфичные к альфа-энолазе, и способы применения в противоопухолевой терапии

Антитела, специфичные к альфа-энолазе, и способы применения в противоопухолевой терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам получения и применения антител, которые связываются с человеческим белком альфа-энолазы (ENO1).

Уровень техники

Опухоли возникают в результате аберрантной, неограниченной пролиферации единственной клетки, генерирующей клон трансформированных клеток. Опухолевые клетки могут экспрессировать уникальные антигены, которые могут распознаваться иммунной системой. Опухолеспецифические антигены включают мутированные онкогены, мутированные нормальные клеточные белки, аберрантно экспрессированные клеточные белки, аномальные белки клеточной поверхности и онкогенные вирусные белки. Иммунная система рассматривает эти опухолеспецифические антигены, как не свои, и может вырабатывать антитела для устранения этих чужеродных антиген-несущих опухолевых клеток, не затрагивая при этом здоровые клетки. Таким образом, идентификация иммуногенных опухолеспецифических антигенов может использоваться для клинических, прогностических или терапевтических применений при лечении злокачественного новообразования.

Некоторые злокачественные опухоли могут быть идентифицированы с помощью плеврального выпота, который представляет собой избыточную жидкость в пространстве между легкими и грудной клеткой. Карцинома легкого, карцинома молочной железы и лимфома обусловливают примерно 75% всех злокачественных плевральных выпотов. Злокачественный плевральный выпот может обогащаться лимфоцитарными инфильтратами и опухолевыми клетками. Опухолеспецифические иммунные комплексы или аутоантитела, такие как антитела к p53, антитела к белкам ядра, и антитела к L-Myc обнаружены в жидкостях выпота и ассоциируются с неблагоприятным прогнозом. Некоторые опухолеспецифические антигены также были идентифицированы в злокачественных выпотах, включая фрагменты цитокератина 19, нейрон-специфическую энолазу (ENO2), антиген плоскоклеточной карциномы и растворимый HLA-I, и т.д.

Альфа-энолаза (энолаза-1, ENO1) представляет собой многофункциональный белок, который был впервые обнаружен в качестве ключевого фермента пути гликолиза. При нормальных условиях ENO1 экспрессируется в цитозоли. Однако также было обнаружено, что ENO1 экспрессируется на клеточной поверхности множества опухолевых клеток в виде рецептора плазминогена и на активированных гематопоэтических клетках, таких как нейтрофилы, лимфоциты и моноциты. Известно, что положительная регуляция белков рецептора плазминогена может индуцировать каскадный ответ урокиназной системы активации плазминогена (uPAS).

Система урокиназной активации плазминогена (uPAS) состоит из урокиназного активатора плазминогена (uPA), распознающего его рецептор (uPAR), и двух специфических ингибиторов, ингибитора 1 активатора плазминогена (PAI-1) и ингибитора 2 активатора плазминогена (PAI-2). Урокиназный активатор плазминогена превращает профермент плазминогена в активную сериновую протеазу, плазмин. Плазмин вовлечен в ряд процессов ремоделирования ткани, таких как ремоделирование базальной мембраны (BM) и внеклеточного матрикса (ECM), которые требуются при опухолевой прогрессии и метастазировании. Кроме того, было представлено, что uPAS может быть вовлечен в неопластическую эволюцию, воздействуя на опухолевый ангиогенез, пролиферацию злокачественных клеток и миграцию, интраваскуляризацию и рост в месте метастазирования.

Конкретно, активация плазминогена может приводить к деградациям внеклеточного матрикса, которые, в свою очередь, могут приводить к повышенному метастазированию опухолевых клеток и инфильтрации иммунных клеток. Другими словами, экспрессия ENO1 на поверхности опухолевых клеток в виде рецептора плазминогена может повышать активность инвазии опухолевых клеток. Таким образом, ENO1 представляет собой потенциальную мишень для противоопухолевой терапии.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воплощения изобретения относится к агентам направленного связывания, которые специфично связываются с человеческим ENO1, ингибируя таким образом связывание лиганда (например, плазминогена) с ENO1. Путем ингибирования связывания плазминогена с ENO1 агенты направленного связывания по изобретению могут ингибировать активацию плазминогена, приводя к уменьшенной деградации внеклеточного матрикса, что, в свою очередь, предотвращает или уменьшает диссоциацию опухолевых клеток из внеклеточного матрикса. Таким образом, агенты направленного связывания согласно воплощениям изобретения могут использоваться для ингибирования опухолевого роста и метастазирования. Механизмы, с помощью которых этого можно достичь, могут включать, но не ограничиваются этим, ингибирование связывания лиганда (такого как плазминоген) с его рецептором ENO1, или устранение интер-реакций между рецептором ENO1 и его лигандами, уменьшая посредством этого эффективную концентрацию ENO1.

Согласно одному воплощению изобретения агент направленного связывания представляет собой антитело, которое может связываться с человеческим ENO1 для предотвращения связывания его лигандов (например, плазминогена) с ENO1. Предотвращение связывания плазминогена с рецептором может предотвращать активацию плазминогена. Это приводит к ингибированию урокиназной системы активации плазминогена (uPAS) во внеклеточном матриксе опухолевых клеток.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело может связываться с ENO1 с высокой аффинностью, такой как Kd менее чем 0,3нМ. Такие агенты тесного связывания могут ингибировать ENO1 с высокой эффективностью.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент направленного связывания представляет собой антитело, которое может связываться с человеческим ENO1 и ингибировать индуцированную активность плазмина или опухолевых клеток с высокой эффективностью, как например, ингибирование на 80%, 90%, или на 100%. Анализы ингибирования могут осуществляться путем индуцирования экспрессии ENO1 (следовательно, активации плазминогена) в опухолевой клетке (такой как человеческие клетки лимфомы U937) с помощью обработки с использованием 10 микрограмм/мл липополисахарида (LPS) в течение 5 часов. Ингибирование такой индуцированной активности плазмина может быть проанализировано с использованием антитела при походящей концентрации. Используя антитело по изобретению, такое ингибирование может быть детектировано при таких низких концентрациях антитела, как 20 микрограмм/мл или менее.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент направленного связывания представляет собой антитело, которое может связываться с человеческим ENO1. Такое антитело может использоваться для ингибирования инвазивной активности опухолевой клетки. Например, антитела по изобретению могут ингибировать более чем на 50%, 60%, или на 70% инвазивную активность клеток CL1-5 немелкоклеточного рака легкого при настолько низких концентрациях антитела, как 50 микрограмм/мл или менее.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент направленного связывания представляет собой антитело, которое может связываться с человеческим ENO1 для ингибирования деградации внеклеточного матрикса, ингибируя посредством этого диссоциацию опухолевых клеток из внеклеточного матрикса. Например, антитело по изобретению может ингибировать более чем на 40%, 50%, или 60% опосредованную плазминогеном диссоциацию клеток CL1-5 из коллагена или фибронектина при настолько низких концентрациях антитела, как 50 микрограмм/мл или менее.

Согласно воплощениям изобретения, агент направленного связывания (т.е. антитело) может иметь аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую область, определяющую комплементарность (CDR), содержащую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 1.

Согласно воплощениям изобретения, агент направленного связывания (т.е. антитело) может иметь аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую область, определяющую комплементарность (CDR), содержащую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 2.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент направленного связывания представляет собой антитело, которое может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит последовательность легкой цепи, содержащую любую из последовательностей LCDR1, LCDR2 или LCDR3, включенных в последовательность 2.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит последовательность легкой цепи, содержащую любые две из последовательностей LCDR1, LCDR2 или LCDR3, включенных в последовательность 2 (то есть,LCDR1 и LCDR2, LCDR1 и LCDR3 или LCDR2 и LCDR3).

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит последовательность легкой цепи, которая содержит последовательности LCDR1, LCDR2 или LCDR3, включенные в последовательность 2. Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело может представлять собой гуманизированное антитело или полностью человеческое моноклональное антитело.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит последовательность тяжелой цепи, содержащую любую из последовательностей HCDR1, HCDR2 или hCDR3, включенных в последовательность 1.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит последовательность тяжелой цепи, содержащую любые две из последовательностей HCDR1, HCDR2 или HCDR3, включенных в последовательность 1 (то есть, HCDR1 и HCDR2, HCDR1 и HCDR3 или HCDR2 и HCDR3).

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, включенные в последовательность 1. Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело может представлять собой гуманизированное антитело или полностью человеческое моноклональное антитело.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит последовательность легкой цепи, содержащую CDR, включающую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 2. Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело может связываться с человеческим белком ENO1 и содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDR, включающую последовательность, представленную в последовательности 1. Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело может представлять собой гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело может связываться с человеческим белком ENO1 и содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 1, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 2. Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитело может представлять собой гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент направленного связывания (т.е. антитело) может конкурировать за связывание плазминогена с человеческим белком ENO1. Согласно некоторым воплощениям изобретения, указанный агент направленного связывания содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую, по меньшей мере, одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 1, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую по меньшей мере, одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 2.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент направленного связывания может связываться с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность ²⁹⁶FD Q D D W G A W Q K F TA³⁰⁹ (SEQ ID NO:9) или ³²⁶K R I A K A V N EK S³³⁶ (SEQ ID NO:10) человеческого белка ENO1 (GenBank: AAH50642.1). Согласно некоторым воплощениям изобретения, указанный агент направленного связывания содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 1, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 2.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент связывания по изобретению содержит антиген-связывающий сайт внутри молекулы, не являющейся антителом. Например, такой агент связывания может содержать одну или несколько CDR, например, набор CDR в каркасе белка, не являющегося антителом, как обсуждается дополнительно ниже.

Некоторые воплощения изобретения относятся к способам для анализа уровня человеческого белка ENO1 у пациента или в образце пациента. Способ по изобретению включает контакт антитела к ENO1 с биологическим образцом пациента и детектирование уровня связывания между указанным антителом и человеческим белком ENO1 в указанном образце. В более конкретных воплощениях, биологическим образцом является кровь или плазма.

Другие воплощения изобретения относятся к композициям, содержащим агент направленного связывания, который может включать антитело или его функциональный фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

Еще другие воплощения изобретения относятся к способам эффективного лечения объекта (например, человека или животного), страдающего заболеванием или расстройством, связанным с ENO1. Способ может включать отбор объекта, нуждающегося в лечении неопластического или не неопластического заболевания, и введение объекту терапевтически эффективной дозы антитела (которое может быть гуманизированным или полностью человеческим моноклональным антителом), которое специфично связывается с белком ENO1.

Антитело по изобретению может использоваться для лечения заболевания или расстройства, связанного с человеческим белком ENO1. Заболевание или расстройство, связанное с человеческим белком ENO1, может представлять собой любое патологическое состояние, возникающее в результате аберрантной активации или экспрессии человеческого белка ENO1. Примеры таких заболеваний включают такие, где человеческий белок ENO1 аберрантно взаимодействует со своими лигандами, изменяя посредством этого свойства клеточной адгезии или передачи клеточных сигналов. Это изменение в свойствах клеточной адгезии или передачи клеточных сигналов может приводить к возникновению неопластических заболеваний или некоторых иммунных заболеваний.

Например, заболевание, связанное с человеческим белком ENO1, может представлять собой неопластическое заболевание, такое как злокачественное новообразование легкого, молочной железы, поджелудочной железы, печени, ободочной и прямой кишки и предстательной железы.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агент направленного связывания (например, антитело) может связываться с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность ²⁹⁶FD Q D D W G A W Q K F T³⁰⁸ (SEQ ID NO:9) или ³²⁶K R I A K A V N EK S³³⁶ (SEQ ID NO:10) человеческого белка ENO1 (GenBank: AAH50642.1) и может использоваться для лечения заболевания или расстройства, связанного с человеческим белком ENO1, как отмечено выше.

Дополнительные воплощения изобретения относятся к способам ингибирования ENO1-индуцированной диссоциации опухолевых клеток объекта из внеклеточного матрикса. Эти способы могут включать отбор объекта (например, человека или животного), нуждающегося в лечении ENO1-индуцированной клеточной диссоциации, и введение указанному объекту терапевтически эффективного количества антитела, где указанное антитело специфично связывается с ENO1. Антитело может быть гуманизированным или полностью человеческим моноклональным антителом.

Дополнительные воплощения изобретения относятся к применениям антитела при получении лекарственного средства для лечения у объекта (например, человека или животного) заболевания или расстройства, связанного с ENO1, где указанное антитело специфично связывается с ENO1. Антитело может быть гуманизированным или полностью человеческим моноклональным антителом.

Согласно некоторым воплощениям изобретения, агенты направленного связывания, описанные в данном документе, могут использоваться при получении лекарственного средства для лечения у животного клеточной диссоциации из внеклеточного матрикса, индуцированной белком ENO1, где указанное антитело специфично связывается с ENO1. Антитело может быть гуманизированным или полностью человеческим моноклональным антителом.

Некоторые воплощения изобретения, описанные в данном документе, относятся к моноклональным антителам, которые связываются с человеческим ENO1 и воздействуют на функции человеческого ENO1. Другие воплощения изобретения относятся к препаратам антител к ENO1 с целевыми свойствами для лечебных применений. Такие свойства могут включать высокую аффинность связывания с ENO1, способность нейтрализации активности ENO1 in vitro и in vivo, и способность ингибировать ENO1-индуцированную клеточную диссоциацию, рост и метастазирование опухолей.

В некоторых воплощениях, изобретение относится к антителу, которое может связываться с человеческим ENO1 с очень высокой аффинностью (т.е., с низкой Kd). Например, человеческое, кроличье, мышиное, химерное или гуманизированное антитело, которое способно связываться с ENO1 с Kd менее, чем примерно 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10 или примерно 10^-11M, или соответствует любому интервалу или значению между ними. Измерения аффинности и/или авидности может осуществляться с использованием тИФА и/или BIACORE, как описано в данном документе, или согласно методам, известным в данной области.

Понятно, что воплощения изобретения не ограничены любой конкретной формой антитела или способом генерирования или получения. Например, антитело к ENO1 может представлять собой полноразмерное антитело (например, содержи интактный человеческий Fc-участок) или фрагмент антитела (например, Fab, Fab' или F(ab')2, FV или Dab (Dab представляют собой кратчайшие функциональные связывающие элементы человеческих антител). Кроме того, антитело может быть получено из гибридомы, которая секретирует антитело, или из рекомбинантно полученной клетки, которая трансформирована или трансфецирована геном или генами, кодирующими антитело.

Другие воплощения изобретения относятся к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим любые из антител, описанных в данном документе, к векторам, содержащим выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитело к ENO1, или к клетке-хозяину, трансформированной любой из таких молекул нуклеиновых кислот.

Кроме того, некоторые воплощения изобретения относятся к способу получения антитела к ENO1 с помощью культивирования клеток-хозяев при условиях, где молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется с получением антитела, с последующим извлечением антитела. Следует понимать, что воплощения изобретения также могут включать любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или фрагмент антитела по изобретению, включая последовательности нуклеиновых кислот, оптимизированные для повышения выхода антител или их фрагментов при трансфекции в клетки-хозяева для продуцирования антитела.

Следующие воплощения изобретения могут относиться к способам получения антител с высокой аффинностью к человеческому ENO1 путем иммунизации млекопитающего с использованием человеческого белка ENO1, его фрагмента и одной или нескольких ортологических последовательностей или их фрагментов.

Другие воплощения относятся к генерации и идентификации выделенных антител, которые могут специфично связываться с человеческим ENO1. Ингибирование биологической активности ENO1 может осуществляться этими антителами для предотвращения ENO1-индуцированной клеточной диссоциации, инвазии и других целевых эффектов злокачественных новообразований.

Другие воплощения изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество антитела к ENO1. Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Еще в других воплощениях, антитело к ENO1 или его фрагмент конъюгировано с терапевтическим агентом. Терапевтический агент может представлять собой, например, токсин или радиоизотоп.

Еще другие воплощения изобретения относятся к способам лечения заболеваний или патологических состояний, ассоциированных с экспрессией ENO1 у пациента. Способы могут включать введение пациенту эффективного количества антитела к ENO1. Антитело к ENO1 может вводиться индивидуально или в комбинации с дополнительными антителами или химиотерапевтическим лекарственным средством или с лучевой терапией. Например, моноклональная, олигоклональная или поликлональная смесь антитела к ENO1, которая блокирует клеточную диссоциацию, может вводиться в комбинации с лекарственным средством, которое, как было продемонстрировано, прямо ингибирует пролиферацию опухолевых клеток. Способ может осуществляться in vivo, и пациентом предпочтительно является человек. В предпочтительном воплощении, способ касается лечения заболевания или расстройства, связанного с ENO1, включающего, в частности, непластическое заболевание, такое как злокачественное новообразование легкого, молочной железы, поджелудочной железы, печени, ободочной и прямой кишки и предстательной железы и/или солидные опухоли.

Некоторые воплощения изобретения относятся к способу мониторинга развития злокачественного новообразования. Способ может включать определение представленности белков альфа-энолазы (ENO1) в образце (например, в опухолевых клетках), где повышенный уровень ENO1 коррелирует с тяжестью злокачественного новообразования. Согласно воплощениям изобретения, представленность может быть определена путем измерения связывания ENO1-специфичного антитела с белками ENO1.

Некоторые воплощения изобретения относятся к способу детектирования злокачественного новообразования. Такой способ может включать определение представленности ENO1-специфичных антиел в образце сыворотки, где низкий уровень ENO1-специфичных антител указывает на присутствие злокачественной опухоли.

Краткое Описание Чертежей

ФИГ. 1A и 1B демонстрируют результаты исследований локализации ENO1 на клеточной поверхности в злокачественных клетках с использованием проточной цитометрии (ФИГ. 1A) и иммуноокрашивания (ФИГ. 1B), соответственно. Подробные процедуры осуществляли, как описано в Примере 1. Данные продемонстрировали, что ENO1 локализован на клеточной поверхности в злокачественных клетках (NHRI-L89 & CA926), но не в нормальных клетках эпителия легкого (NHBE & SAEC).

ФИГ. 2 демонстрирует ингибирование инвазивной активности высокоинвазивных клеток аденокарциномы легкого CL1-5 с помощью поликлонального антитела против ENO1 клеточной поверхности. Подробные процедуры осуществляли, как описано в Примере 2. Данные демонстрируют, что введение поликлонального антитела к ENO1 ослабляет инвазию CL1-5.

ФИГ. 3 демонстрирует, что поликлональное антитело против человеческого ENO1 ослабляет инвазивную способность клеток CL1-5F4 в легком. Введение антитела животному и образование метастатической колонии в легком отслеживали через 12 и 19 дней после опухолевой инъекции с использованием системы IVIS. Подробные процедуры осуществляли, как описано в Примере 3. Данные демонстрируют, что поликлональное антитело к ENO1 ингибирует миграцию CL1-5F4 в легкое in vivo.

ФИГ. 4 демонстрирует генерирование гибридом антитела к ENO1 и подтверждение каждого клона моноклонального антитела с помощью проточной цитометрии. Процедуры иммунизации мышей и генерирование гибридомы и продуцирование каждого антитела и подтверждение антитела с помощью проточной цитометрии описаны в Примере 4. Данные показали, что все 5 гибридомных антител распознают поверхностный ENO1 на клетках CL1-5F4 аденокарциномы легкого.

ФИГ. 5A демонстрирует связывание ENO1 в тИФА 5 антител, выделенных из асцитов индивидуальных гибридом. Очистку с сульфатом аммония, очистку на колонке с протеином A и очистку SDS-PAGE осуществляли, как описано в Примере 5. Данные на ФИГ. 5B демонстрируют значения Kd 5 различных антител к человеческому ENO1.

ФИГ. 6 демонстрирует результаты фибринолитического анализа для U937 5 антител, выделенных из асцитов индивидуальных гибридом, соответственно. Индукцию экспрессии ENO1 с помощью LPS в клетках U937 клеточной линии лимфомы человека и анализ активности плазмина осуществляли, как описано в Примере 6. Эти данные демонстрируют, что 5 различных антител к ENO1 обладают различными ингибирующими активностями против рецептора плазминогена ENO1 и что ингибирующие активности коррелируют со значениями Kd.

ФИГ. 7 демонстрирует результаты ингибирования инвазивных активностей клеток CL1-5, обработанных 5 различными антителами, выделенными из асцитов индивидуальных гибридом, соответственно. Процедуры подробно описаны в Примере 7. Эти данные демонстрируют, что все 5 различных антител к ENO1 могут ингибировать инвазивную активность клеток CL1-5. Интересно, что даже если клон 8 имеет Kd примерно в 7,2-раза выше, чем у клона 10, ингибирование инвазивной активности против клеток CL1-5 с помощью клона 8 аналогично эффекту клона 10.

ФИГ. 8A демонстрирует результаты инвазивных активностей клеток CL1-5, обработанных различными концентрациями антитела EN10 mAb, выделенного из гибридомы. Процедуры осуществляли, как подробно описано в Примере 8. Эти данные демонстрируют, что антитело EN10mAb ингибирует инвазивную активность CL1-5 в дозозависимой манере.

ФИГ. 8B демонстрирует результаты инвазивных активностей клеток U937, обработанных различными концентрациями EN10 mAb, выделенного из гибридомы, после того как индуцировали экспрессию поверхностного ENO1 в клетках с помощью LPS. Процедуры осуществляли, как подробно описано в Примере 8. Эти данные демонстрируют, что EN10 mAb ингибирует инвазивную активность клеток U937 в дозозависимой манере.

ФИГ. 9 демонстрирует, что EN10 mAb распознает ENO1 клеточной поверхности на клетках U937, обработанных с помощью LPS. Процедуры осуществляли, как подробно описано в Примере 9.

ФИГ. 10A демонстрирует адгезивную активность клеток CL1-5 карциномы легкого по отношению к матриксным белкам. Анализ адгезии осуществляли, как описано в Примере 10. Эти данные демонстрируют, что клетки CL1-5 обладают более высокими адгезивными активностями по отношению к коллагену и фибриногену.

ФИГ. 10B демонстрирует результаты ингибирования диссоциации клеток CL1-5 из фибронектина, обработанного EN10 mAb. Анализ ассоциированной с клетками адгезии осуществляли, как описано в Примере 10. Эти данные демонстрируют, что EN10 mAb ингибирует активность диссоциации клеток CL1-5 от фибронектина в дозозависимой манере.

ФИГ. 10C демонстрирует результаты ингибирования диссоциации клеток CL1-5 из коллагена, обработанного EN10 mAb. Анализ ассоциированной с клетками адгезии осуществляли, как описано в Примере 10. Эти данные демонстрируют, что EN10 mAb ингибирует активность диссоциации клеток CL1-5 от коллагена в дозозависимой манере.

На ФИГ. 11A изображена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи EN10 mAb (SEQ ID NO: 1). Показаны каркасные области (FR1, FR2, FR3 и FR4) и CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3). Клонирование EN10 mAb осуществляли, как описано в Примере 11.

На ФИГ. 11B изображены аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи EN10 mAb(SEQ ID NO: 2). Показаны каркасные области (FR1, FR2, FR3 и FR4) и CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Клонирование EN10 mAb осуществляли, как описано в Примере 11.

ФИГ. 12A демонстрирует активности EN10 mAb связывания делеционных мутантов ENO1. Эпитоп связывания EN10 mAb локализован между аминокислотными остатками номер 293 и 434 человеческого белка ENO1. Большую часть делеций ENO1 для определения области связывания EN10 mAb осуществляли, как описано в Примере 12.

ФИГ. 12B демонстрирует 12% SDS PAGE 6 C-концевых делеционных мутантов белка ENO1, очищенных из E.coli. Процедуры очистки делеционных мутантов ENO1 подробно описаны в Примере 12.

ФИГ. 12C демонстрирует активности связывания EN10 mAb и 6 C-концевых делеционных мутантов ENO1. Эпитоп связывания EN10 mAb локализован между аминокислотными остатками номер 296 и 336 человеческого белка ENO1. Большую часть делеций ENO1 для определения области связывания EN10 mAb осуществляли, как описано в Примере 12.

На ФИГ. 13A изображена кристаллическая структура и экспонированные на поверхности аминокислотные остатки между аминокислотными остатками номер 296 и 336 человеческого ENO1. Прогнозирование структуры описано в Примере 13.

ФИГ. 13B демонстрирует 12% SDS PAGE 11 мутантных белков ENO1, полученных мутагенезом в виде сканирования аланином, очищенных из E.coli. Процедуры для очистки мутантных белков ENO1 подробно описаны в Примере 13.

ФИГ. 13C демонстрирует тИФА связывания ENO1 и значения Kd 11 мутантов сканирования аланином против EN10 mAb. Результат предполагает, что последовательности пептида 1 ENO1, FD Q D D W G A W Q K F TA (SEQ ID NO: 9), и пептида 2, K R I A K A V N EK S (SEQ ID NO:10), локализованные между аминокислотными остатками номер 296 и 336 человеческого ENO1, вовлечены в связывание EN10 mAb. Сканирование аланином осуществляли, как описано в Примере 13.

ФИГ. 13D демонстрирует последовательности пептида 1 ENO1 (FD Q D D W G A W Q K F TA (SEQ ID NO: 9)) и пептида 2 (K R I A K A V N EK S (SEQ ID NO:10)) между аминокислотными остатками номер 296 и 336 человеческого ENO1(SEQ ID NO:49), которые участвуют в связывании человеческого ENO1 и EN10 mAb.

ФИГ. 14A демонстрируют 3D-структуру человеческого белка ENO1. На ФИГ.14B изображена предполагаемая структура EN10 mAb Fab (представленного в виде ленточной спирали, легкая цепь - серая, тяжелая цепь - черная) в комплексе с областью связывания плазминогена человеческого белка ENO1. Прогнозирование кристаллической структуры белка ENO1 и EN10 mAb осуществляли, как описано в Примере 14.

ФИГ. 15A демонстрирует экспрессирующий вектор для генерирования химерного EN10 mAb мышь-человек. Процедуры для очистки химерного антитела EN10 mAb описаны в Примере 15.

На ФИГ. 15B изображены результаты, полученные при применении химерного антитела для определения аффинности связывания и констант кинетики EN10 mAb. Процедуры экспрессии, очистки и анализа Kd химерного антитела осуществляли, как подробно описано в Примере 15.

ФИГ. 16 демонстрирует ингибирующие эффекты EN10 mAb в отношении роста опухоли легкого в присутствии компонента комплемента. Введение EN10 mAb и замедление опухолевого роста осуществляли, как описано в Примере 16. Данные демонстрируют, что введение EN10 mAb вместе с компонентом комплемента дважды в неделю обладало эффективностью, аналогичной эффективности обработки такой же дозой коммерческого лекарственного средства ErbituxTM в мышиной модели ксенотрансплантата CL1-5.

ФИГ. 17A, 17B и 17C демонстрируют результаты, полученные при блокаде опухолевого распространения злокачественного новообразования поджелудочной железы в анализе метастатического колониеобразования селезенки-печени с помощью EN10 mAb. Введение EN10 mAb и ингибирование метастатического опухолевого роста с помощью обработки антителом осуществляли, как описано в Примере 17. Результаты исследования выявили, что введение 10 мг/кг EN10 mAb дважды в неделю уменьшало количество метастатических опухолевых узлов, размер опухоли и массу опухоли мышей по сравнению с аналогичными параметрами от такой же дозы контрольного IgG в мышиной метастатической модели селезенки-печени.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не определено иное, то научные и технические термины, использованные в данном документе, имеют тот же смысл, который вкладывается в них обычным специалистом в данной области. Кроме того, до тех пор, пока иное не требуется по контексту, термины в единственном числе будут включать значения во множественном числе, и термины во множественном числе будут включать значения в единственном числе. Как правило, номенклатура и методы, использованные в отношении клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, и белковой и олиго- или полинуклеотидной химии и гибридизации, описанные в данном документе, хорошо известны и широко используются в данной области.

Стандартные методы используются для рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов, тканевой культуры и трансформации (например, электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и методы очистки осуществляются согласно описаниям производителя или так, как они обычно осуществляются в данной области или так, как они описаны в данном документе. Вышеописанные методы и процедуры, как правило, осуществляют согласно стандартным методам, хорошо известным в данной области и как описано в различных общих и в более конкретных публикациях, которые цитируются и обсуждаются на протяжении настоящего описания. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), которая включена в данный документ ссылкой. Номенклатура, применяемая в этой связи, а также лабораторные процедуры и методы аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в данном документе, хорошо известны и широко применяются в данной области. Стандартные методы используются для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов, составов и для доставки, и для лечения пациентов.

Применяемые согласно настоящему описанию следующие термины до тех пор, пока не указано иное, следует понимать, как имеющие следующие значения: используемый в настоящей заявке термин «и/или» следует понимать как конкретное описание каждого из двух конкретных признаков или компонентов вместе с другим или без него. Например, «A и/или B» следует понимать, как описание каждого из (i) A, (ii) B и (iii) A и B, как если бы каждый был представлен в данном документе индивидуально.

Антагонист может представлять собой полипептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид, низкомолекулярное соединение, оигонуклеотид, олигопептид, интерферирующую РНК (РНКи), антисмысловую РНК, рекомбинантный белок, антитело или их конъюгаты или сшитые белки. Для обзора РНКи см. Milhavet O, Gary D S, Mattson M P. (Pharmacol Rev. 2003 December; 55(4):629-48. Review.) и способов с использованием антисмысловой последовательности см. Opalinska J B, Gewirtz A M. (Sci STKE. 2003 Oct. 28; 2003 (206): pe47).

Аберрантная активация или экспрессия «ENO1», связанная с заболеванием, может быть любой аномальной, нежелательной или патологической клеточной адгезией, например, опухолеспецифическая клеточная адгезия. Заболевания, связанные с клеточной адгезией, включают, в частности, не солидные опухоли, такие как лейкоз или лимфома, а также солидные опухоли, такие как меланома, немелкоклеточный рак легкого, гепатоклеточная (печеночная) карцинома, рак желудочно-кишечного тракта, рак головы и шеи, рак системы печени, желудка, молочной железы, яичников, легкого, матки, вульвы, ободочной и прямой кишки и поджелудочной железы.

Термин ENO1 относится к гетеродимерной молекуле энолазы, состоящей из ENO1 и ENO2 или ENO3.

Используемый в настоящей заявке термин «антитело» относится, как правило и в основном, к иммуноглобулинам, аутоантителам, моноклональным антителам и поликлональным антителам, а также к их активным фрагментам. Фрагмент может быть активным по части его связывания с распознаваемым антигеном или он может быть активным по части его биологической функции. Антитела по изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими, полученными с использованием методов, хорошо известных в данной области.

Используемый в настоящей заявке термин «моноклональное антитело» относится к антителам, которые являются химически или иммунологически гомогенными, как правило, полученными с помощью гибридом. См. A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

Используемый в настоящей заявке термин «поликлональное антитело» относится к антителам, которые получают с помощью более чем одного клона плазматических клеток, синтезирующих антитела (B-лимфоциты) в ответ на один антиген. Они, как правило, вырабатываются животными после их иммунизации антигеном.

Используемый в настоящей заявке термин «химерное антитело» относится к антителам, которые содержат последовательности из более чем одного источника. Например, такие антитела могут содержать последовательности из источников, не относящихся к человеку, которые затем модифициру