Гуманизированные не относящиеся к человеку животные с ограниченными локусами тяжелой цепи иммуноглобулина

Гуманизированные не относящиеся к человеку животные с ограниченными локусами тяжелой цепи иммуноглобулина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Предусмотрены генетически сконструированные не относящиеся к человеку животные, которые характеризуются пониженной сложностью вариабельных генов тяжелой цепи иммуноглобулина, причем не относящиеся к человеку животные способны экспрессировать белок ADAM6 или его функциональный фрагмент. Описаны генетически сконструированные не относящиеся к человеку животные, которые экспрессируют антитела из ограниченного числа вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина и/или их вариантов, причем не относящиеся к человеку животные не содержат функциональный эндогенный ген ADAM6, но сохраняют функцию ADAM6, включая в себя мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса вариабельной области тяжелой цепи (V_H) иммуноглобулина, который делает мышь неспособной вырабатывать функциональный белок ADAM6 и приводит к потере фертильности. Описаны генетически модифицированные мыши, содержащие локус V_H иммуноглобулина, характеризующийся ограниченным числом генных сегментов V_H, например, единственным сегментом V_H иммуноглобулина, например, генным сегментом V_H1-69 человека или генным сегментом V_H1-2 человека, и которые дополнительно содержат функцию ADAM6, включая в себя мышей, которые содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая восстанавливает фертильность у самца мыши.

Описаны генетически модифицированные мыши, клетки, эмбрионы и ткани, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный локус ADAM6, причем мыши, клетки, эмбрионы и ткани экспрессируют тяжелую цепь иммуноглобулина, происходящую из единственного генного сегмента V_H человека. Кроме того, мыши, клетки, эмбрионы и ткани не содержат функциональный эндогенный ген ADAM6, но сохраняют функцию ADAM6, характеризующуюся присутствием эктопической последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6. Предусмотрены способы получения последовательностей антитела у фертильных не относящихся к человеку животных, которые применимы для связывания патогенов, включая в себя патогены человека.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Не относящиеся к человеку животные, например мыши, были генетически модифицированы, чтобы быть применимыми инструментами в способах получения последовательностей антител для использования в терапевтических средствах для людей на основе антител. В настоящей области техники известны мыши, которые производят полностью человеческие антитела с когнатными тяжелыми и легкими цепями. Для создания таких мышей, было необходимо инактивировать эндогенные гены иммуноглобулина мыши так, чтобы случайным образом интегрированные полностью человеческие трансгены могли бы функционировать в качестве экспрессированного репертуара иммуноглобулинов в организме мыши. Такие мыши могут производить антитела человека, подходящие для применения в качестве терапевтических средств для людей, но эти мыши демонстрируют существенные проблемы в отношении своих иммунных систем. Эти проблемы приводят к некоторым экспериментальным препятствиям, например, мыши становятся неспособными производить в достаточной степени разнообразные репертуары антител, требуют применения решений для широкомасштабного реконструирования, обеспечивают субоптимальный процесс клональной селекции, вероятно, вследствие несовместимости между элементами человека и мыши, и представляют собой ненадежный источник больших и разнообразных популяций вариабельных последовательностей человека, которые должны были быть действительно применимыми для получения терапевтических средств для людей.

Терапевтические средства для людей на основе антител разрабатывают на основе требуемых характеристик в отношении выбранных антигенов. Гуманизированных мышей иммунизируют выбранными антигенам и иммунизированных мышей используют для получения популяций антител, из которых идентифицируют высокоаффинные когнатные тяжелые и легкие вариабельные домены с требуемыми характеристиками связывания. Некоторые гуманизированные мыши, такие как мыши, у которых гуманизированы только вариабельные области в эндогенных локусах мыши, производят популяции В-клеток, которые схожи по характеру и количеству с популяциями В-клеток мыши дикого типа. В результате этого чрезвычайно большая и разнородная популяция В-клеток доступна у тех мышей, у которых антитела подвергаются скринингу, что отражает большое количество различных реаранжировок иммуноглобулина для идентификации тяжелых и легких вариабельных доменов с наиболее необходимыми характеристиками.

Тем не менее, не все антигены вызывают иммунный ответ, который проявляет очень большое количество реаранжировок из широкого выбора вариабельных сегментов (V). Другими словами, гуморальный иммунный ответ человека на определенные антигены практически ограничен. Ограничение отражается в клональной селекции В-клеток, которые экспрессируют только определенные сегменты V, связывающие определенный антиген с достаточно высокой аффинностью и специфичностью. Некоторые такие антигены являются клинически значимыми, т.е. некоторые из них представляют собой хорошо известные патогены человека. Возникает предположение, что сегмент V, экспрессированный при иммунном ответе человека, представляет собой сегмент V, который в сочетании с сегментом D и J человека более вероятно производит применимое высокоаффинное антитело, чем случайно выбранный сегмент V, который не наблюдался в ответе антитела человека на указанный антиген.

Предполагают, что естественный отбор за тысячелетия истории взаимодействия между людьми и патогенами выбрал наиболее эффективный фундамент или основание для разработки наиболее эффективного оружия для нейтрализации патогена -выбранный генный сегмент V. В настоящей области техники существует потребность в высококачественных антителах, которые связывают и/или нейтрализуют антигены, подобные обсуждаемым выше патогенам. Существует потребность в более быстром создании применимых последовательностей из выбранных генных сегментов V, включая в себя полиморфные и/или соматически мутированные выбранные генные сегменты V, и в более быстром получении применимых популяций В-клеток с реаранжировками генных сегментов V с различными генными сегментами D и J, включая в себя их соматически мутированные варианты, и, в частности, с реаранжировками с уникальными и применимыми областями CDR3. Существует потребность в улучшенных биологических системах, например, не относящихся к человеку животных (таких как, например, мыши, крысы, кролики и т.д.), которые могут создавать терапевтически применимые последовательности вариабельной области антитела из выбранных генных сегментов V в повышенном количестве и с увеличенным разнообразием, что, например, может быть достигнуто у существующих модифицированных животных, при одновременном снижении или устранении неблагоприятных изменений, которые могут быть результатом генетических модификаций. Существует потребность в улучшенных биологических системах, сконструированных так, чтобы они характеризовались коммитированной гуморальной иммунной системой для клональной селекции вариабельных последовательностей антитела, происходящих из ограниченных, выбранных генных сегментов V, включая в себя без ограничения когнатные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей человека, применимые для получения терапевтических средств для людей на основе антител против выбранных антигенов, включая в себя определенные патогены человека. В настоящей области техники остается потребность в получении улучшенных генетически модифицированных мышей, которые применимы в создании последовательностей иммуноглобулина, включая в себя последовательности антител человека, направленных на устранения патогенов, которые обременяют человеческую популяцию.

В настоящей области техники существует потребность в терапевтических антителах, которые способны нейтрализовать вирусные антигены, например, ВИЧ и ВГС, включая в себя антигенспецифические антитела, содержащие тяжелые цепи, происходящие из единственного вариабельного генного сегмента человека. Также существует потребность в дополнительных способах и не относящихся к человеку животных для получения применимых антител, включая в себя антитела, которые содержат репертуар тяжелых цепей, происходящих из единственного сегмента V_H человека, и содержащих разнообразный набор последовательностей CDR, включая в себя тяжелые цепи, которые экспрессируются с когнатными легкими цепями человека, и включая в себя исправление неблагоприятных эффектов вследствие вставки геномных последовательностей человека в геном не относящихся к человеку животных. Требуются способы для отбора CDR для связывающих белков на основе иммуноглобулинов, которые предусматривают повышенное разнообразие связывающих белков, из которых производят выбор, и повышенное разнообразие вариабельных доменов иммуноглобулинов, включая композиции и способы для создания соматически мутированных и подвергнутых клональной селекции вариабельных доменов иммуноглобулинов, для использования, например, в получении терапевтических средств для людей.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусмотрены генетически модифицированные локусы иммуноглобулина, которые содержат некоторое ограниченное количество различных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи (т.е. генов V, генов V_H, генных сегментов V_H или генных сегментов V), например, не более одного, двух или трех различных генов V; или не более одного представителя семейства генных сегментов V, присутствующего, например, в единственной копии или во множественных копиях и/или содержащего один или несколько полиморфизмов, и согласно различным вариантам осуществления локусы не содержат последовательность, которая кодирует эндогенный функциональный белок ADAM6.

Предусмотрены локусы, которые способны к реаранжировке и образованию гена, кодирующего вариабельный домен тяжелой цепи, который происходит из генного репертуара V тяжелой цепи, который является ограниченным, например, который представляет собой единственный генный сегмент V_H или выбран из множества полиморфных вариантов единственного генного сегмента V_H, причем согласно различным вариантам осуществления локусы не содержат эндогенный функциональный ген ADAM6 или его функциональный фрагмент.

Предусмотрены модифицированные локусы иммуноглобулина, включая в себя локусы, которые не содержат эндогенный функциональный ген ADAM6 и содержат последовательности иммуноглобулина человека, например, сегмент V человека, функционально связанный с относящейся к человеку или (или относящейся к человеку/не относящейся к человеку химерной) не относящейся к человеку константной последовательностью иммуноглобулина (и в функциональной связи, например, с сегментом D и/или J). Предусмотрены модифицированные локусы, которые содержат множественные копии единственного генного сегмента V_H, причем одна или несколько копий содержат полиморфный вариант, и эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 или его фрагмент, который является функциональным у не относящегося к человеку животного. Предусмотрены модифицированные локусы, которые содержат множественные копии единственного сегмента V_H, функционально связанного с одним или несколькими сегментами D и одним или несколькими сегментами J, функционально связанными с не относящейся к человеку константной последовательностью иммуноглобулина, например, последовательностью мыши или крысы или человека. Также предусмотрены не относящиеся к человеку животные, содержащие такие гуманизированные локусы, причем не относящиеся к человеку животные характеризуются фертильностью дикого типа.

Предусмотрены не относящиеся к человеку животные, которые содержат вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (например, на трансгене или в качестве вставки или замещения на эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи не относящегося к человеку животного), который содержит единственный сегмент V_H, функционально связанный с генным сегментом D и/или J. Согласно различным вариантам осуществления единственный генный сегмент V_H функционально связан с одним или несколькими генными сегментами D и/или одним или несколькими генными сегментами J на эндогенном вариабельном генном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного. Согласно различным вариантам осуществления не относящиеся к человеку животные дополнительно содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 или его гомолог или ортолог, который является функциональным у самца не относящегося к человеку животного, который содержит модифицированный локус тяжелой цепи. Согласно различным вариантам осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность является смежной с единственным сегментом V_H, генным сегментом D или генным сегментом J. Согласно различным вариантам осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность является смежной с не относящейся к иммуноглобулину последовательностью в геноме не относящегося к человеку животного. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность находится на той же хромосоме, что и модифицированный локус тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность на другой хромосоме, чем модифицированный локус тяжелой цепи.

Предусмотрены не относящиеся к человеку животные, которые модифицированы на их локусах вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина для делеции всех или по существу всех (например, всех функциональных сегментов или почти всех функциональных сегментов) эндогенных сегментов V_H иммуноглобулина и которые содержат сегмент V_H1-69 человека (или сегмент V_H1-2 человека), функционально связанный с сегментом D и J или сегментом J на эндогенном локусе вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина не относящегося к человеку животного. Также предусмотрены не относящиеся к человеку животные, содержащие такие локусы и которые не содержат эндогенный(е) ген(ы) ADAM6.

Предусмотрены способы получения последовательностей иммуноглобулина человека у не относящихся к человеку животных. Согласно различным вариантам осуществления последовательности иммуноглобулина человека происходят из репертуара последовательностей V иммуноглобулина, которые состоят по сути из единственного сегмента V человека, например, V_H1-69 или V_H1-2, и одного или нескольких сегментов D и J или одного или нескольких сегментов J. Предусмотрены способы получения последовательности иммуноглобулина человека в относящихся к человеку животных, тканях и клетках, причем последовательности иммуноглобулина человека связывают антиген.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновых кислот, клетки, зародыши, мыши и способы для получения мышей, которые содержат модификацию, которая дает в результате нефункциональный эндогенный белок ADAM6 или ген ADAM6 мыши (например, нокаут или делецию в эндогенном гене ADAM6), причем мыши содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления мыши содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAM6 грызуна или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент; согласно конкретному варианту осуществления белок ADAM6 грызуна представляет собой белок ADAM6 мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновой кислоты, клетки, зародыши, мыши и способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус иммуноглобулина мыши представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина, и модификация снижает или устраняет активность ADAM6 клетки или ткани самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус иммуноглобулина мыши представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина, и модификация поддерживает или обеспечивает активность ADAM6 клетки или ткани самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрен модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит репертуар сегментов V тяжелой цепи, который ограничен в отношении идентичности сегмента V, и который содержит один или несколько сегментов D и один или несколько сегментов J, или один или несколько сегментов J. Согласно одному варианту осуществления сегмент V тяжелой цепи представляет собой сегмент человека. Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина не содержит эндогенный ген ADAM6. Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус тяжелой цепи дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления нуклеотидная последовательность является смежной с генным сегментом V, D и/или J на модифицированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления модифицированный локус представляет собой не относящийся к человеку локус. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к человеку локус модифицирован с помощью по меньшей мере одной последовательности иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к человеку локус модифицирован с помощью по меньшей мере одной последовательности иммуноглобулина человека и последовательности, которая кодирует белок ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления ограничение касается одного представителя семейства сегментов V. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в двух или более копиях. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в виде двух или более вариантов (например, в двух или более полиморфных формах представителя семейства сегментов V). Согласно одному варианту осуществления один сегмент V представляет собой представителя семейства сегментов V человека. Согласно одному варианту осуществления один представитель семейства сегментов V присутствует в нескольких вариантах, как это наблюдается в человеческой популяции, по отношению к этому варианту. Согласно одному варианту осуществления представителя семейства сегментов V выбирают из таблицы 1. Согласно одному варианту осуществления представитель семейства сегментов V присутствует в нескольких вариантах, как показано для каждого сегмента V, в нескольких аллелях от одного аллеля до нескольких аллелей, показанных в правой колонке таблицы 1.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент; также предусмотрены мыши, которые содержат эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, и по меньшей мере одну генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления эндогенная нуклеотидная последовательность, кодирующая ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, расположена в эктопическом положении по сравнению с эндогенным геном ADAM6 мыши дикого типа.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем применение способов дает в результате самцов мышей, которые содержат модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делецию), и самцы мышей способны производить потомство путем спаривания. Согласно одному варианту осуществления самцы мышей способны производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем применение способов дает в результате самцов мышей, которые содержат модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делецию), и самцы мышей проявляют снижение фертильности, и мыши содержат генетическую модификацию, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется неспособностью спермы самцов мышей мигрировать от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется наличием спермы, которая проявляет in vivo нарушение миграции. Согласно различным вариантам осуществления генетическая модификация, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает замещение эндогенных вариабельных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина ограниченным числом, например, не более чем одним, двумя или тремя различными вариабельными генными сегментами тяжелой цепи (V_H), одним или несколькими дополнительными генными сегментами тяжелой цепи (D_H) и одним или несколькими соединительными генными сегментами тяжелой цепи (J_H) другого вида (например, не относящегося к мыши вида). Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку единственного ортологичного генного сегмента иммуноглобулина V_H, по меньшей мере одного генного сегмента D_H и по меньшей мере одного генного сегмента J_H в эндогенные вариабельные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем делеция приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 ассоциирована со снижением фертильности у самцов мышей. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает инактивацию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем инактивация не приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Инактивация может включать в себя замещение или делецию одного или нескольких эндогенных генных сегментов, которые дают в результате эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который по существу является неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, которое содержит эндогенные генные сегменты. Инактивация может включать в себя другие модификации, которые делают эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, причем модификация не включает в себя замещение или делецию эндогенных генных сегментов. Иллюстративные модификации включают в себя хромосомные вставки и/или транслокации, опосредованные молекулярными техниками, например, с использованием точного размещения сайтов сайт-специфической рекомбинации (например, технологии Cre-lox).

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку в геном мыши фрагмента ДНК, содержащего ограниченное число, например, не более чем один, два или три различных вариабельных генных сегмента тяжелой цепи (V_H), один или несколько дополнительных генных сегментов тяжелой цепи (D_H) и один или несколько соединительных генных сегментов тяжелой цепи (J_H) другого вида (например, не относящегося к мыши вида), функционально связанных с одной или несколькими последовательностями константной области (например, геном IgM и/или IgG). Согласно одному варианту осуществления фрагмент ДНК способен подвергаться реаранжировке для образования последовательности, которая кодирует тяжелую цепь антитела. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку единственного ортологичного генного сегмента иммуноглобулина V_H, по меньшей мере одного генного сегмента D_H и по меньшей мере одного генного сегмента J_H в геном мыши. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, чтобы сделать эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина нефункциональным, причем делеция дополнительно приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 ассоциирована со снижением фертильности у самцов мышей.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат модификацию, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши из эндогенного аллеля ADAM6 так, что самец мыши с модификацией проявляет сниженную фертильность (например, сильно сниженную способность производить потомство путем спаривания), или является по существу стерильным вследствие снижения или устранения эндогенной функции ADAM6, причем мыши дополнительно содержат эктопическую последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному аспекту модификация, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши, представляет собой модификацию (например, вставку, делецию, замещение и т.д.) в локусе иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность или существенную неспособность мыши производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно конкретному варианту осуществления по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сперматозоидов, произведенных в объеме эякулята мыши, являются неспособными пройти через яйцевод in vivo после копуляции и оплодотворить яйцеклетку мыши.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность образования или существенную неспособность образования комплекса ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления потеря функции ADAM6 предусматривает существенную неспособность оплодотворить яйцеклетку мыши путем копуляции с самкой мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6, и содержит белок (или эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок), который предоставляет мыши функциональность ADAM6. Согласно одному варианту осуществления мышь представляет собой самца мыши, и функциональность предусматривает усиленную фертильность по сравнению с мышью, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в пределах локуса иммуноглобулина в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит единственный генный сегмент V_H человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит один генный сегмент V_H человека, 27 генных сегментов D_H человека и шесть генных сегментов J_H человека. Согласно одному варианту осуществления эктопический белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в пределах не относящегося к иммуноглобулину локуса в зародышевой линии мыши. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус представляет собой локус ROSA26. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус ассоциирован с тканеспецифической экспрессией. Согласно одному варианту осуществления тканеспецифическая экспрессия присутствует в репродуктивных тканях. Согласно одному варианту осуществления белок кодируется геномной последовательностью, случайным образом вставленной в зародышевую линию мыши.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит относящуюся к человеку или химерную относящуюся к человеку/мыши или химерную относящуюся к человеку/крысе (например, относящуюся к человеку вариабельную, относящуюся к мыши или крысе константную) легкую цепь и химерную относящуюся к человеку вариабельную/относящуюся к мыши или крысе константную тяжелую цепь. Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит трансген, который содержит химерный ген относящейся к человеку вариабельной/относящейся к крысе или мыши константной легкой цепи, функционально связанный с транскрипционно активным промотором, например, промотором ROSA26. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления химерный трансген относящейся к человеку/мыши или крысы легкой цепи содержит реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи человека в зародышевой линии мыши.

Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность расположена в пределах локуса иммуноглобулина в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит единственный генный сегмент V_H человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит единственный генный сегмент V_H человека, 27 генных сегментов D_H человека и шесть генных сегментов J_H человека. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность расположена в пределах не относящегося к иммуноглобулину локуса в зародышевой линии мыши. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус представляет собой локус ROSA26. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность размещена в виде вставленной случайным образом в зародышевую линию мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6, причем мышь содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которая восполняет потерю функции ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность предоставляет мыши способность производить потомство, которое является сопоставимым с таковым у соответствующей мыши дикого типа, которая содержит функциональный эндогенный ген ADAM6. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет мыши способность образовывать комплекс ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет сперматозоиду мыши способность проходить от матки мыши через яйцевод мыши к яйцеклетке мыши для оплодотворения яйцеклетки.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от числа пометов, которые производит мышь дикого типа мышь того же возраста и линии за шестимесячный период времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 2,5 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 7 раз, приблизительно в 8 раз или приблизительно в 10 раз или более потомства при разведении в течение шестимесячного периода времени, чем мышь такого же возраста и такой же или аналогичной линии, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которую разводят в течение по существу такого же периода времени и по существу при таких же условиях.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит в среднем по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 3 раза или в 4 раза большее число детенышей на помет за 4- или 6-месячный период разведения, чем мышь, которые не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, и которую разводят в течение такого же периода времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, представляет собой самца мыши, и самец мыши производит сперму, которая будучи извлеченной из яйцеводов приблизительно через 5-6 часов после копуляции, отражает миграцию в яйцеводе, которая больше по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, в 100 раз, в 110 раз или в 120 раз или выше, чем у мыши, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, при копуляции с самкой мыши образует сперму, которая способна к прохождению матки и попаданию и прохождению яйцевода в течение приблизительно 6 часов при результативности, которая приблизительно равна сперме мыши дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза или приблизительно в 4 раза или более пометов в сопоставимый период времени, чем мышь, которая не содержит функциональный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, содержащая в своей зародышевой линии не относящуюся к мыши последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок иммуноглобулина, причем не относящаяся к мыши последовательность иммуноглобулина содержит вставку гена ADAM6 мыши или его гомолога или ортолога или функционального фрагмента. Согласно одному варианту осуществления не отно