Функциональные локусы fad2 и соответствующие специфичные для сайта-мишени связывающиеся белки, способные индуцировать направленные разрывы

Функциональные локусы fad2 и соответствующие специфичные для сайта-мишени связывающиеся белки, способные индуцировать направленные разрывы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США №61/697886, поданной 7 сентября 2012 г., полное содержание которой, таким образом, включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, в целом, к композициям и способам для применения в технологии рекомбинантных растений (например, для получения трансгенного растения). Более конкретно, настоящее изобретение относится к растительным клеткам и растениям, содержащим локусы в их геномах, которые можно использовать для сайт-специфического введения любой интересующей нуклеиновой кислоты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие растения генетически трансформируют экзогенными нуклеиновыми кислотами (например, трансгенами) для введения желательных признаков, например, для повышения сельскохозяйственной ценности. Примеры усовершенствований для повышения сельскохозяйственной ценности, которые могут быть достигнуты благодаря генетической трансформации, включают: улучшение питательных качеств, повышение урожайности, устойчивость к вредителям или болезням, устойчивость к засухе и стрессам, улучшение качества плодоовощной продукции (например, улучшение пигментации и/или роста), устойчивость к гербицидам, производство промышленно полезных соединений и/или материалов из растений, и/или производство фармацевтических продуктов. Введение клонированных генов в клетки растений и получение стабильных плодородных трансгенных растений можно использовать для создания генетической модификации растения, стабильной на протяжении нескольких поколений, и таким образом, становится возможной генетическая инженерия сельскохозяйственных культур.

В методах генетической трансформации и получения трансгенных растений экзогенную ДНК, как правило, случайным образом вводят в ядерную или пластидную ДНК эукариотической растительной клетки, с последующим выделением клеток, содержащих интегрированную экзогенную ДНК, и дальнейшей регенерацией стабильно трансформированного растения. Трансгенные растения, как правило, получали при помощи технологии опосредованной Agrobacterium трансформации. Успехи, достигнутые при использовании данных методов, стимулировали разработку других методов для введения интересующей молекулы нуклеиновой кислоты в геном растения, таких как опосредованное ПЭГ поглощение ДНК протопластами, бомбардировка микрочастицами и опосредованная силиконовыми нитями трансформация.

Однако во всех этих методах трансформации растений экзогенные нуклеиновые кислоты, вводимые в геном растений, интегрируются случайным образом в геном растительной клетки, и в непредсказуемом количестве копий. Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1030, Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2): 846, D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1): 93. Например, трансгены часто интегрируются в форме повторяющихся последовательностей, либо всего трансгена, либо его частей. Такая сложная схема интеграции обычно отрицательно влияет на уровень экспрессии интегрированной нуклеиновой кислоты (например, путем разрушения транскрибированной РНК за счет механизмов посттранскрипционного выключения генов или в результате индукции метилирования интегрированной ДНК). Кроме того, место расположения сайта интеграции обычно влияет на уровень экспрессии интегрированной нуклеиновой кислоты. Более того, интегрирование экзогенной ДНК может оказывать разрушительное воздействие на область генома, в которой происходит интеграция, и тем самым влиять или нарушать нормальное функционирование этой области-мишени, вызывая нежелательные побочные эффекты. Сочетание факторов, включая вышеизложенные, приводит к вариациям в широких пределах уровня экспрессии трансгена или экзогенный ДНК (и в целом, агрономического качества) среди различных трансгенных растительных клеток и линий растений, даже тех, которые получены одними и теми же методами. Поскольку интегрирование происходит случайным образом, специалист-практик не может контролировать эти эффекты, когда он или она пытается получить новое растение с желаемыми характеристиками.

С учетом вышеизложенных соображений, при исследовании эффектов от введения конкретной экзогенной нуклеиновой кислоты в растение необходимо создавать большое число линий трансгенных растений и анализировать их для получения значимых результатов. Аналогично, при создании трансгенного растения, содержащего конкретную интегрированную нуклеиновую кислоту для придания трансгенному растению желаемого фенотипа, необходимо получать большую популяцию независимо созданных линий трансгенных растений, чтобы иметь возможность отбора линии растения с оптимальной экспрессией нуклеиновой кислоты и с минимальным или отсутствующим побочным влиянием на общий фенотип и характеристики трансгенного растения. Эти практические соображения приобретают дополнительную важность в случае трансгенных растений, полученных путем включения нескольких экзогенных нуклеиновых кислот (то есть, пакетирования генов). В таких растениях может быть усилено такое явление, как посттранскрипционное выключение гена.

Разработано несколько способов в попытке контролировать вставки трансгенов в растения. Смотри, например, Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci. 6: 155-9. Такие способы опираются на основанную на гомологичной рекомбинации интеграцию трансгенов, которая была успешно использована как в случае прокариотов, так и низших эукариотов. Paszkowski et al. (1988) EMBO J. 7: 4021-6. Однако до недавнего времени в растениях преобладающий механизм интеграции трансгенов имел в основе незаконную рекомбинацию, которая подразумевает небольшую гомологию между рекомбинирующими цепями ДНК. Таким образом, основной задачей в данной области является обнаружение и избирательное создание редких событий гомологичной рекомбинации, которые маскируются гораздо более эффективными интеграционными событиями за счет незаконной рекомбинации. Более того, даже в случае достижения избирательного создания и обнаружения событий направленной гомологичной рекомбинации, событие должно быть направлено в желаемый участок генома хозяина для того, чтобы извлечь максимальную выгоду из данной стратегии.

Например, предполагаемым преимуществом направленной генетической трансформации является снижение вариабельности экспрессии трансгена от события к событию, по сравнению с событиями трансформации, которые получают в результате случайного интегрирования. Другим предполагаемым преимуществом является значительное сокращение числа событий, необходимых для скрининга введенных нуклеиновых кислот, сортировки трансформационных конструктов и получения событий, которые вносят вклад в желаемые общие характеристики полученного трансгенного растения. Критическим фактором, необходимым для реализации этих преимуществ, является идентификация определенных мест в геноме, где функционирование трансгена будет соответствующим и, по возможности, где неблагоприятные эффекты на растение-хозяина будут устранены или сведены к минимуму.

В последнее время были описаны методы и композиции для направленного расщепления геномной ДНК. Такие направленные события расщепления можно использовать, например, для индукции направленного мутагенеза, индукции направленных делеций последовательностей клеточной ДНК и содействия направленной рекомбинации и интеграции в заданный хромосомный локус. Смотри, например, Urnov et al. (2010) Nature 435(7042): 646-51, патентные публикации США 20030232410, 20050208489, 20050026157, 20050064474, 20060188987, 20090263900, 20090117617, 20100047805, 20110207221, 20110301073, 2011089775, 20110239315, 20110145940 и международную публикацию WO 2007/014275, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме и для всех целей. Расщепление может происходить за счет использования определенных нуклеаз, таких как сконструированные нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN), подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (TALENs), или использования системы CRISPR/Cas с разработанной crRNA/tracr РНК («одиночной направляющей РНК») для направления специфического расщепления. В патентной публикации США №20080182332 описано использование неканонических нуклеаз с «цинковыми пальцами» (ZFNs) для направленной модификации геномов растений, в патентной публикации США №20090205083 описана опосредованная ZFN направленная модификация локуса EPSPS растения, в патентной публикации США №20100199389 описана направленная модификация локуса Zp15 растения и в патентной публикации США №20110167521 описана направленная модификация растительных генов, вовлеченных в биосинтез жирных кислот. Кроме того, в Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9): 3055-3060 описано использование разработанных ZFNs для направленного добавления гена в заданный локус. В патентной публикации США 20110041195 описаны способы получения гомозиготных диплоидных организмов.

Тем не менее, сохраняется потребность в композициях и способах для модифицирования и/или модулирования экспрессии генов FAD2 в растениях, включая создание растений с направленными вставками нужных трансгенов в локус FAD2.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для модулирования экспрессии генов FAD2 (например, в растениях, водорослях и грибах) и использованию данных локусов в качестве сайтов для направленного интегрирования интересующей последовательности нуклеиновой кислоты (например, экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты) в клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин может содержать один или более геномов с одной или более последовательностями FAD2 (например, гомологами или паралогами), любая или все из которых могут быть избирательно модифицированы и/или разрушены. В конкретных примерах настоящего изобретения описаны гены FAD2 2.3 и FAD2 2.6, а также соответствующие гомологи и паралоги в Glycine max (например, G. max культиваров Jack, Williams 82, X5, Westag и Maverick) и их использование в качестве локусов для направленного интегрирования интересующей последовательности нуклеиновой кислоты. Как описано в настоящем документе, хотя гены FAD2 вовлечены в биосинтез жирных кислот в организме хозяина, их модифицирование или разрушение (например, в результате интегрирования экзогенной нуклеиновой кислоты в кодирующую последовательность FAD2) неожиданно может не оказывать никакого или оказывать минимальное неблагоприятное воздействие на полученный организм-хозяина.

В настоящем документе также описано использование одного или более конкретных локусов FAD2 в тандеме с полипептидом, способным осуществлять расщепление и/или интегрирование определенных последовательностей нуклеиновой кислоты в локусах FAD2. Примеры использования локусов FAD2 в тандеме с полипептидом, способным осуществлять расщепление и/или интегрирование в локусах FAD2, включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из белков с «цинковыми пальцами», мегануклеаз, доменов TAL, TALENs, РНК-направляемых CRISPR-Cas9, рекомбиназ, лейциновых «молний», CRISPr/Cas и других, известных специалистам в данной области. Конкретные примеры включают димерный («слитый») белок, содержащий полипептид сайт-специфического ДНК-связывающего домена и полипептид расщепляющего домена (например, нуклеазы), такой как белок ZFN, содержащий полипептид «цинковый палец» и полипептид нуклеазы FokI. Например, в настоящем документе описана демонстрация in vitro и in vivo эффективности и специфичности конкретных ZFNs, разработанных для связывания и индукции двухцепочечных разрывов в генах FAD2 2.3 и FAD2 2.6, и в их сочетаниях, без расщепления соответствующих гомологов или паралогов. В некоторых вариантах осуществления конкретные локусы FAD2 можно использовать с любым из вышеуказанных полипептидов для осуществления сайт-специфического интегрирования интересующей нуклеиновой кислоты, которая впоследствии экспрессируется в хозяине, причем с минимальным неблагоприятным воздействием на агрономические характеристики хозяина.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны полипептиды, содержащие ДНК-связывающий домен, который специфически связывается с геном FAD2. В некоторых вариантах осуществления такой полипептид может также содержать домен или полудомен нуклеазы (расщепляющий) (например, ZFN, рекомбиназы, транспозазы или хоминг-эндонуклеазы, включая хоминг-эндонуклеазу с модифицированным ДНК-связывающим доменом, домены TAL, TALENs, РНК-направляемые CRISPR-Cas9) и/или домен лигазы, так что полипептид может индуцировать направленный двухцепочечный разрыв и/или способствовать рекомбинации интересующей нуклеиновой кислоты в участке разрыва. В конкретных вариантах осуществления ДНК-связывающий домен, который направлен на локус FAD2, может представлять собой ДНК-расщепляющий функциональный домен. Вышеуказанные полипептиды можно использовать в некоторых вариантах осуществления для включения экзогенной нуклеиновой кислоты в геном организма-хозяина (например, из видов растений или животных) в одном или более локусах FAD2. В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающие домены содержат белок с «цинковыми пальцами», имеющий один или более «цинковых пальцев» (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более «цинковых пальцев»), сконструированный (не существующий в природе) для связывания с любой последовательностью в гене FAD2. Любой из белков с «цинковыми пальцами», описанных в настоящем документе, может связываться с сайтом-мишенью в кодирующей последовательности гена-мишени или в прилегающих последовательностях (например, промоторе или других элементах экспрессии). В некоторых вариантах осуществления белок с «цинковыми пальцами» связывается с сайтом-мишенью в гене FAD2, например, как показано в таблице 1. Спиральные области узнавания иллюстративных FAD2-связывающих «цинковых пальцев» приведены в таблице 2. Один или более из компонентов связывающих доменов типа «цинковые пальцы» белка с «цинковыми пальцами» может быть каноническим (C2H2) «цинковым пальцем» или неканоническим (например, C3H) «цинковым пальцем» (например, N-концевой и/или C-концевой «цинковый палец» может быть неканоническим «пальцем»).

В настоящем документе также описаны способы разрушения или корректирования гена FAD2. Кроме того, в настоящем документе описаны генетически модифицированные организмы-хозяева (например, трансгенные растения), полученные способами в соответствии с вариантами осуществления изобретения. В конкретных примерах трансгенный организм, полученный способом в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, может представлять собой, без ограничения, водоросль, гриб, однодольное растение, двудольное растение и так далее. В некоторых конкретных вариантах осуществления двудольное растение может представлять собой растение сои (Glycine max).

Гены FAD2, описанные в настоящем документе, могут включать гены любого растения, водорослей или грибов, которые имеют один или более генов FAD2.

Вышеуказанные и другие признаки станут более очевидными из следующего далее подробного описания некоторых вариантов осуществления, в котором содержатся ссылки на сопроводительные фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 приведено выравнивание кодирующих последовательностей FAD2 2.3 из Williams 82 (SEQ ID NO: 4), Westag (SEQ ID NO: 5), X5 (SEQ ID NO: 6), Jack (SEQ ID NO: 7) и Maverick (SEQ ID NO: 8).

На фигуре 2 приведено выравнивание кодирующих последовательностей FAD2 2.6 из Williams 82 (SEQ ID NO: 9), Westag (SEQ ID NO: 10), X5 (SEQ ID NO: 11), Jack (SEQ ID NO: 12) и Maverick (SEQ ID NO: 13).

На фигуре 3 показана активность ZFNs, разработанных для генов FAD2 2.3 и 2.6, в анализе DLSSA. ZFNs, разработанные для локусов FAD2 2.3 и 2.6, оценивали на расщепляющую активность в отношении последовательностей FAD2 2.3 и 2.6, которые были клонированы в клетки млекопитающих в качестве репортеров.

На фигуре 4 приведена плазмидная карта pDAB115620.

На фигуре 5 приведена плазмидная карта pDAB115622.

На фигуре 6 приведена плазмидная карта pDAB7221.

На фигуре 7 схематично изображены зонды/праймеры для анализа разрушения локуса. Указаны сайты связывания F2 ZFN для генов FAD2 2.3 и 2.6 и праймеры, используемые для анализа разрушения локуса.

На фигуре 8 приведена последовательность продуктов «внутренней-внешней» (In-Out) ПЦР, полученных в результате направления на мишень с помощью NHEJ донорской последовательности при использовании нуклеазы с «цинковыми пальцами» F2 ZFN2 в локусе FAD2 2.3. Референсная последовательность (на фигуре сверху) представляет собой конфигурацию направленной вставки вектора донора в обратной ориентации. Одноцепочечные концы ДНК, возникающие в результате расщепления FokI, были заполнены для создания референсной последовательности. Приведены последовательности, секвенированные по методу Сэнгера. Последовательности связывания ZFN для F2 ZFN2 подчеркнуты. Плазмидные клоны с последовательностью, аналогичной указанной последовательности, перечислены справа.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Нуклеотидные последовательности изображены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. Показана только одна цепь каждой нуклеотидной последовательности, однако следует иметь в виду, что комплементарная цепь включена при каждой ссылке на изображенную цепь.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор нескольких вариантов осуществления

Варианты осуществления изобретения относятся к подходу для направленного интегрирования экзогенных нуклеиновых кислот (например, трансгенов) в геном хозяина без существенного негативного влияния на другие характеристики фенотипа хозяина, помимо тех, которые затронуты интегрированием нуклеиновой кислоты. Некоторые варианты осуществления можно использовать для «пакетирования» нескольких нуклеиновых кислот в геноме одного хозяина. Такой подход требует разработки и применения четырех взаимосвязанных технологий: технологий направления на цель, позволяющих вносить двухцепочечные разрывы в определенные участки геномной ДНК (смотри, например, Puchta et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 5034-40, Siebert and Puchta (2002) Plant Cell 14: 1121-31, D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnol. J. 6(1): 93-102, Cai et al. (2009) Plant Mol. Biol. 69(6): 699-709, Shukla et al. (2009) Nature 459(7245): 437-41), Shan et al. (2103) Nature Biotechnol. 31: 686-680, Le et al. (2013) Nature Biotechnol 31: 688-691, Nekrasov et al. (2013) Nature Biotechnol. 31: 691-693, Ainely et al. (2013) Plant Biotechnol. J. (онлайн 19 августа); технологий доставки, делающих возможной доставку оптимизированной экзогенной (донорской) нуклеиновой кислоты (Bibikova et al. (2003) Science 300(5620): 764); технологий интегрирования, включающих модификацию генов хозяина (с упором либо на гомологичную рекомбинацию, либо на пути NHEJ), с тем, чтобы увеличить частоту HDR или NHEJ для направленных вставок донорской ДНК; аналитических инструментов для улучшения и характеризации событий направленного интегрирования; и определенных нужных участков генома хозяина («функциональных локусов»), которые генетически хорошо изучены и которые поддерживают стабильную экспрессию гена из поколения в поколение без значительного ущерба для трансформированного организма хозяина. Смотри также патентные публикации США 20030232410, 20050208489, 20050026157, 20050064474, 20060188987, 20090263900, 20090117617, 20100047805, 20110207221, 20110301073, 2011089775, 20110239315, 20110145940, 20080182332, 20090205083, 20100199389, 20110167521. Например, в растениях функциональный локус представляет собой локус, в котором негативное влияние на агрономические или качественные характеристики трансгенного растения, в локус которого был введен трансген, является незначительным или отсутствует.

В вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, использованы преимущества того неожиданного факта, что гены FAD2 растения являются функциональными локусами для направленной вставки экзогенных нуклеиновых кислот (например, гена(ов), некодирующих последовательностей ДНК, таких как сконструированные посадочные площадки (Engineered Landing Pads, ELPs) (патентная заявка США 12/011735) и сконструированные платформы для вставки трансгена (Engineered Transgene Insertion Platform, ETIP) (находящаяся на рассмотрении патентная заявка США №61/697882), а также трансформационной единицы(единиц) растения). Повсеместная распространенность локусов FAD2 в растениях и свидетельства того, что изменение или нокаут FAD2 в каноле, кукурузе, подсолнечнике, пшенице, хлопке и соевых бобах не несет отрицательных последствий для агрономических или качественных характеристик, делает локусы FAD2 широко используемым классом функциональных локусов в коммерчески используемых видах растений.

В некоторых вариантах осуществления используют сайт-специфическое расщепление двухцепочечной ДНК в локусе FAD2, например, в результате доставки и экспрессии специфического для сайта-мишени узнающего и расщепляющего ДНК белка. В конкретных примерах таким FAD2-специфичным узнающим и расщепляющим ДНК белком может быть, например, без ограничения, ZFN, TALEN, РНК-направляемая CRISPR-Cas9, рекомбиназа (например, рекомбиназы Cre, Hin, RecA, Tre и FLP), мегануклеаза и сконструированный белок, полученный из любого из вышеперечисленных или их эквивалентов. Расщепление может также осуществляться с использованием системы CRISPR/Cas с разработанной crRNA/tracr РНК («одиночной направляющей РНК») для направления специфического расщепления. В некоторых вариантах осуществления такой двухцепочечный разрыв может быть восстановлен путем интегрирования донорской нуклеиновой кислоты в сайт расщепления в функциональном локусе FAD2, например, путем управляемой гомологией репарации (Homology Directed Repair, HDR) или путем негомологичного соединения концов (Non-Homologous End Joining, NHEJ).

Данное изобретение иллюстрирует полезность локусов FAD2 в качестве функциональных локусов, например, путем описания локусов FAD2 2.3 и FAD2 2.6 в сое (Glycine max) и соответствующих FAD2-специфичных ZFNs, которые можно использовать для интегрирования экзогенной нуклеиновой кислоты в локус FAD2 2.3 и/или FAD2 2.6.

Варианты осуществления настоящего изобретения направлены на решение многих нерешенных проблем в данной области. Например, избирательность подхода направленного интегрирования, описанного в настоящем документе, может уменьшать или устранять необходимость повторных полевых испытаний, нужных для устранения нежелательных трансгенных событий, при том, что данные исследования являются дорогостоящими из-за задействованных ресурсов и обременительных нормативных требований в данной области. Кроме того, подходы направленной вставки ДНК, описанные в настоящем документе, могут быть особенно полезными в случае пакетирования трансгенов.

Хотя природную нуклеотидную последовательность в эндогенном локусе FAD2 можно использовать для прямого направления на цель интересующей нуклеиновой кислоты, в некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту можно сначала направлять на по меньшей мере один локус FAD2 в организме хозяина, так что интегрирование других интересующих молекул нуклеиновой кислоты в организм хозяина облегчается. В других примерах можно использовать нуклеотидные последовательности, не гомологичные природным последовательностям организма хозяина (например, образованные практически случайным образом последовательности нуклеиновой кислоты), которые фланкируют сайт узнавания ДНК (например, сайт узнавания для «цинковых пальцев»).

II. Термины

При использовании в данной заявке, включая формулу изобретения, термины в форме единственного числа включают форму их множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на «растение» также относится и к множеству растений. Кроме того, в зависимости от контекста используемый термин «растение» может также относиться к генетически аналогичному или идентичному потомству данного растения. Аналогично, термин «нуклеиновая кислота» может относиться к множеству копий молекулы нуклеиновой кислоты. Подобным же образом, термин «зонд» может относиться ко многим аналогичным или идентичным молекулам зонда.

Числовые диапазоны включают числа, ограничивающие диапазон, и определенно включают каждое целое и дробное число в пределах заданного диапазона. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое им обычно придают специалисты в данной области.

Для облегчения обзора различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, приводятся следующие объяснения специальных терминов:

Выделенный: «выделенный» биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок) был в значительной степени отделен, произведен отдельно от, или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в которой компонент естественным образом присутствует (то есть, другой хромосомной и внехромосомной ДНК и РНК, и белков), при осуществлении химического или функционального изменения компонента (например, нуклеиновую кислоту можно выделять из хромосомы, разрушая химические связи, соединяющие нуклеиновую кислоту с остальной ДНК в хромосоме). Молекулы нуклеиновых кислот и белки, которые были «выделены», включают молекулы нуклеиновых кислот и белки, очищенные стандартными методами очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные методом рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты, белки и пептиды.

Скрещивание: используемый в настоящем документе применительно к растениям термин «скрещивание» или «скрещенные» означает слияние гамет путем опыления для получения потомства (например, клеток, семян и растений). Этот термин включает как половое скрещивание (то есть, опыление одного растения другим), так и самооплодотворение (то есть, самоопыление, например, при использовании пыльцы и семяпочки от одного и того же растения).

Обратное скрещивание: методы обратного скрещивания можно использовать для введения последовательности нуклеиновой кислоты в растение. Этот метод широко используется в течение многих десятилетий для введения новых признаков в растения. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. В типичном протоколе обратного скрещивания растение исходного интересующего сорта (рекуррентный родитель) скрещивают с растением второго сорта (нерекуррентный родитель), которое несет интересующую последовательность нуклеиновой кислоты, которую предстоит переносить. Полученное от этого скрещивания потомство затем снова скрещивают с рекуррентным родителем, и процесс повторяют до тех пор, пока не будет получено растение, в котором практически все желаемые морфологические и физиологические характеристики рекуррентного родителя будут восстановлены в преобразованном растении, в дополнение к перенесенной последовательности нуклеиновой кислоты от нерекуррентного родителя.

Интрогрессия: используемый в настоящем документе термин «интрогрессия» означает передачу аллеля (или модифицированного аллеля, содержащего экзогенную нуклеиновую кислоту) в генетический фон в определенном локусе. В некоторых вариантах осуществления интрогрессия специфического аллеля в локусе может происходить путем передачи аллеля по меньшей мере одному потомству через половое скрещивание двух родителей, относящихся к одному и тому же виду, при этом по меньшей мере один из родителей имеет специфическую аллельную форму в своем геноме. Потомство, содержащее специфический аллель, можно повторно обратно скрещивать с растениями линии, имеющей желаемый генетический фон. Потомство от обратного скрещивания можно отбирать на наличие специфической аллельной формы, с тем, чтобы создать новый сорт, в котором специфическая аллельная форма зафиксирована в генетическом фоне. В некоторых вариантах осуществления интрогрессия специфического аллеля может происходить путем рекомбинации между двумя донорскими геномами (например, в слитом протопласте), при этом по меньшей мере один из донорских геномов имеет специфическую аллельную форму в своем геноме. Интрогрессия может включать передачу специфической аллельной формы, которая может представлять собой, например, и без ограничения, разрушенный или модифицированный аллель, трансген, PTU и ELP.

Зародышевая плазма: используемый в настоящем документе термин «зародышевая плазма» означает генетический материал отдельного растения, группы растений (например, линии, сорта или семейства растений) и клона, полученного из растения или группы растений. Зародышевая плазма может быть частью организма или клетки, или она может быть отделена (например, выделена) от организма или клетки. Как правило, зародышевая плазма обеспечивает генетический материал определенной молекулярной моделью, которая является основой для наследственных качеств растения. Используемый в настоящем документе термин «зародышевая плазма» относится к клеткам конкретного растения, семенам, ткани конкретного растения (например, ткани, из которой могут быть выращены новые растения) и не семенным частям конкретного растения (например, листьям, стеблям, пыльце и клеткам). Используемый в настоящем документе термин «зародышевая плазма» является синонимом термина «генетический материал» и его можно использовать для обозначения семени (или другого растительного материала), из которого растение может быть размножено. Термин «банк зародышевой плазмы» может относиться к организованной коллекции различных семян или другого генетического материала (где каждый генотип однозначно идентифицирован), из которого известный культивар может быть культивирован и из которого новый культивар может быть создан.

Ген: используемый в настоящем документе термин «ген» (или «генетический элемент») может означать последовательность наследуемой геномной ДНК, имеющую функциональное значение. Ген может представлять собой природную нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту, которая была интегрирована в геном. Термин «ген» можно также использовать для обозначения, например, и без ограничения, кДНК и/или мРНК, кодируемую последовательностью наследуемой геномной ДНК.

Молекула нуклеиновой кислоты: используемый в настоящем документе термин «молекула нуклеиновой кислоты» может означать полимерную форму нуклеотидов (то есть, рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов и/или модифицированной формы любых из перечисленных выше). Используемый в настоящем документе термин «молекула нуклеиновой кислоты» является синонимом терминов «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид». Термин включает как смысловые, так и антисмысловые цепи РНК, кДНК, геномной ДНК, а также их синтетические формы и смешанные полимеры. Термин включает любую топологическую конформацию, в том числе одноцепочечную, двухцепочечную, частично дуплексную, триплексную, шпилечную, кольцевую и запертую конформации. Молекула нуклеиновой кислоты может включать или природные или модифицированные нуклеотиды, либо и те и другие. Такие нуклеотиды могут быть связаны друг с другом естественными и/или искусственными нуклеотидными связями.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы химическими или биохимическими методами, или могут содержать дериватизированные нуклеотидные основания, как легко понятно специалистам в данной области. Такие модификации включают, например, и без ограничения: метки, метилирование, замену одного или более из природных нуклеотидов аналогом и межнуклеотидные модификации (например, незаряженные связи, например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты и карбаматы, заряженные связи, например, фосфоротиоаты и фосфородитиоаты), подвешенные фрагменты, например, пептиды, интеркаляторы, например, акридин и псорален, хелаторы, алкиляторы, и модифицированные связи, например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты).

Экзогенные: «экзогенная» молекула представляет собой молекулу, которая не является родной для определенной системы (например, зародышевой плазмы, сорта, элитного сорта и/или растения), применительно к нуклеотидной последовательности и/или местоположению в геноме (то есть, локусу) в случае полинуклеотида (и применительно к аминокислотной последовательности и/или клеточной локализации в случае полипептида). В вариантах осуществления экзогенные или гетерологичные полинуклеотиды или полипептиды могут представлять собой молекулы, которые были искусственно введены в биологическую систему (например, клетку растения, ген растения, конкретный вид или сорт растения и/или хромосому растения) и не являются родными для данной конкретной биологической системы. Таким образом, обозначение нуклеиновой кислоты как «экзогенной» может указывать на то, что нуклеиновая кислота происходит из иного источника, нежели природный источник, или это может указывать на то, что нуклеиновая кислота имеет неестественную конфигурацию, генетическое местоположение или расположение элементов.

Напротив, например, «родная» или «эндогенная» нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту (например, ген), которая не содержит иной нуклеотидный элемент, нежели те, которые обычно присутствуют в хромосоме или другом генетическом материале, в котором нуклеиновая кислота обычно находится в природе. Эндогенный генный транскрипт кодируется нуклеотидной последовательностью в ее естественном хромосомном локусе, а не введен искусственно в клетку.

Функционально связанные: первая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональном взаимоотношении со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, когда промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. При получении рекомбинантными методами функционально связанные последовательности нуклеиновой кислоты, как правило, являются смежными и, если необходимо соединить две кодирующие белок области, в одной и той же рамке считывания. Однако элементы не обязательно должны быть смежными, чтобы быть функционально связанными.

Промотор: промотор представляет собой область ДНК, которая, как правило, расположена выше (ближе к 5'-области) в нуклеиновой кислоте и которая стимулирует транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промоторы делают возможной надлежащую активацию или репрессию нуклеиновой кислоты(кислот), с которой они функционально связаны. Промотор содержит определенные последовательности, которые узнаются факторами транскрипции. Эти факторы связываются с промоторными последовательностями ДНК, что приводит к рекрутированию РНК-полимеразы, фермента, который синтезирует РНК с кодирующей области нуклеиновой кислоты.

Трансформированные: вектор «трансформирует» или «трансдуцирует» клетку, когда он переносит молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Клетка является «трансформированной» молекулой нуклеиновой кислоты, когда молекула нуклеиновой кислоты становится стабильно реплицируемой в клетке, либо за счет встраивания молекулы нуклеиновой кислоты в клеточный геном, либо за счет эписомной репликации. Используемый в настоящем документе термин «трансформация» охватывает все методы, с помощью которых молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в клетку. Примеры включают, но не ограничиваются ими: трансфекцию вирусными векторами, трансформацию плазмидными векторами, электропорацию (Fromm et al. (1986) Nature 319: 791-3), липофекцию (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7), микроинъекцию (Mueller et al. (1978) Cell 15: 579-85), опосредованный Agrobacterium перенос (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-7), прямое поглощение ДНК и бомбардировку микрочастицами (Klein et al. (1987) Nature 327: 70).

Введенные: используемый в настоящем документе термин «введенная», когда речь идет о перемещении экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку, означает включение нуклеиновой кислоты в клетку с использованием любой методологии, доступной в данной области. Этот термин охватывает методы введения нуклеиновой кислоты, включая, например, и без ограничения, трансфекцию, трансформацию и трансдукцию.

Трансген: используемый в настоящем документе термин «трансген» означает экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующую последовательность. Например, трансген может кодировать полезное для применения в промышленности или фармацевтике соединение, или продукт экспрессии, который способствует приобретению желаемого сельскохозяйственного признака (например, устойчивости к гербицидам или устойчивости к вредителям). В другом примере трансген