Связывающие mica агенты

Связывающие mica агенты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/595902, поданной 7 февраля 2012 г., и предварительной заявки на патент США №61/625841, поданной 18 апреля 2012 г.; все указанные заявки полностью включены в настоящий документ посредством ссылок, включая все чертежи.

ССЫЛКИ НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

К настоящей заявке прилагается перечень последовательностей в электронном формате. Указанный перечень последовательностей представлен в виде файла с названием «РСТ Seq list MICA_ST25», созданного 7 февраля 2013 г., имеющего размер 77 кБ. Информация, представленная в электронном формате в перечне последовательностей, включена в настоящий документ полностью посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

В настоящем изобретении предложены антигенсвязывающие белки, способные связываться с полипептидами MICA. Указанные антигенсвязывающие белки обладают повышенной активностью при лечении расстройств, характеризующихся наличием MICA-экспрессирующих клеток, в частности, опухолевых клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунорецептор NKG2D в норме экспрессируется на Т-клетках человека (например, Т-клетках CD8⁺, Т-клетках γδ) и НК-клетках. На преактивированных клетках CD8⁺ NKG2D функционирует как синергистический костимулятор CD28- и TCR-сигнализации за счет связывания DAP10, тогда как в НК-клетках он функционирует как прямой активатор. Таким образом после захвата лиганда NKG2D передает прямые активирующие или костимулирующие сигналы через сопряженный адаптерный белок DAP10, способствуя таким образом формированию иммунитета против рака и инфекционных заболеваний.

Идентифицированы и описаны различные лиганды NKG2D человека (hNKG2D), включая полипептиды, родственные А и В цепям главного комплекса гистосовместимости класса I (MICA и MICB), семейство UL16-связывающих белков (ULBP) и семейство индуцируемых ретиноевой кислотой ранних траскриптов-1 (RAET1). MICA часто ассоциирован с эпителиальными опухолями, индуцируемыми микробными инфекциями, и аберрантно экспрессируется в определенных очагах повреждения при аутоиммунных заболеваниях. Структура MICA сходна с укладкой белков ГКГС (МНС) класса I, с доменом-платформой α1α2 и мембрано-проксимальным Ig-подобным α3-доменом (Li et al., 2001 Nat. Immunol. 2:443). И MICA, и близкородственный ему MICB, который также функционирует в качестве лиганда NKG2D, полиморфны; было показано, что указанный полиморфизм влияет на сродство к NKG2D (Steinle et al. 2001 Immunogenetics 53:279).

У мышей, у которых отсутствуют гены цепей ГКГС класса I (MIC), семейства белков, структурно родственных ULBP, ранние индуцируемые ретиноевой кислотой (RAE-1) молекулы функционируют в качестве лигандов NKG2D. Было показано, что экспрессия RAE-1 индуцируется канцерогенами и стимулирует противоопухолевую активность Т-клеток. При этом NKG2D мышей распознает полипептиды MICA человека (Wiemann (2005) J. Immunol. 175:820-829).

Понимание роли MICA в биологии раковых заболеваний усложняется тем фактом, что MICA высвобождается на поверхности опухолевых клеток (например, аллель *019) и на поверхности экзосом (*08 аллель) в растворимой форме (Ashiru et al. (2010) Cancer Res. 70(2):481-489)). Высокие уровни растворимого MICA (sMICA) могут обнаруживаться, например, в сыворотке пациентов со злокачественными новообразованиями ЖКТ (Salih et al., 2002 J. Immunol. 169:4098). Сообщалось, что ММП ADAM10 и ADAM17, а также дисульфидизомераза Erp5, принимают участие в расщеплении и выделении (шеддинге) MICA (Waldhauer (2008) Cancer Research 68 (15) 6368-76; Kaiser et al. (2007) Nature; и Salih (2002) J. Immunol 169: 4098-4102). Мембраносвязанный MICA, как сообщалось, понижающе регулирует экспрессирование NKG2D на НК-клетках и/или Т-клетках (Von Lilienfeld-Toal et al. (2010) Cancer Immunol. Immunother.). В частности, Wiemann (2005), выше, исследовал MICA-трансгенных мышей и пришел к выводу, что понижающая регуляция поверхностного NKG2D на нетрансгенных спленоцитах была наиболее выражена после совместного культивирования со спленоцитами от MICA-трансгенных мышей in vitro, и только незначительно - после обработки сывороткой мышей H2Kb-MICA, при этом инкубирование с контрольными клетками и сывороткой нетрансгенных мышей nontgLM, соответственно, не оказывало эффекта; в целом данные свидетельствуют о том, что снижение количества поверхностного NKG2D на H2-K-MICA НК-клетках приводит к дисфункции NKG2D, и о том, что понижающую регуляцию NKG2D главным образом обуславливает постоянное воздействие клеточно-связанным MICA in vivo.

Также, согласно имеющимся сообщениям, выяснилось, что NKG2D на НК-клетках понижающе регулируется sMICA (Groh et al. (2002) Nature; Arreygue-Garcia (2008) BMC; Jinushi et al. (2005) J. Hepatol.), что приводит к меньшей реакционноспособности НК-клеток. Обоснованием, возможно, является то, что аналогичные системы были обнаружены в других семействах белков, например, Ig-подобных белков и суперсемействе ФНО; как было показано, они высвобождаются в растворимой форме, и высвобождение указанных молекул влияет на взаимодействие между клетками за счет снижения плотности лигандов и модулирует НК-клетки, несущие соответствующий рецептор (Salih 2002). В этой связи попытки получения антител против MICA направлены на разработку антител, которые подавляют выделение MICA.

Также сообщалось, что экспрессия лигандов NKG2D MICA и MICB на здоровых клетках может нарушать равновесие между активацией иммунитета и толерантностью, и активировать аутоиммунитет. Исследования генетического сцепления показали, что наблюдается положительная зависимость между некоторыми аллелями MICA и диабетом I типа; развитие заболевания у мышей NOD в предиабетическом периоде, на островковых клетках которых экспрессируется Rael, может быть полностью предотвращено лечением NKG2D-блокирующими моноклональными антителами, которые сокращают размножение и функционирование аутореактивных CD8+Т-клеток. Активность молекул MICA и MICB также сильно повышена в синовиоцитах при РА, и они активируют Т-клетки NKG2D-зависимым образом. Кроме того, у пациентов с ревматоидным артритом, как сообщалось, наблюдаются высокие уровни ИЛ-15 и ФНО-α в сыворотке и воспаленных суставах, что индуцирует экспрессирование NKG2D на CD4+CD28- субпопуляции Т-клеток. Имеются сведения о массивной инфильтрации интраэпителиальными NKG2D+CD8+CD Т-лимфоцитами в кишечнике при глютеновой болезни; у пациентов с активной формой заболевания существенно повышается экспрессирование белков MIC на поверхности эпителиальных клеток. При воспалительных заболеваниях кишечника были обнаружены повышенные уровни экспрессирования MIC на кишечных эпителиальных клетках, и обнаружено, что экспрессирование NKG2D на некоторых кишечных эпителиальных CD4+Т-клетках коррелирует с воспалением кишечника.

До настоящего времени подходы к лечению воспаления, основанные на системе NKG2D, были направлены на блокаду собственно NKG2D, а не его лигандов (Ogasawara et al. (2004) Immunity 20(6):757-767; Andersson et al. (2011) Arthritis. Rheum. 63(9):2617-2629; Steigerwald et al. (2009) MAbs 1 (2):115-127. Одной из возможных причин концентрации на NKG2D, а не на его лиганде, является очевидная трудность направленного воздействия на систему NKG2D-лигандов, включающую множество лигандов, и в некоторых случаях - значительное число аллелей.

Существует более 50 аллелей MICA и MICB, и идентифицировано по меньшей мере 13 аллелей MICB. Последовательности аминокислот полипептидов MIC в домене α1α2 (домен, вовлеченный в формирование контактной поверхности NKG2D) идентичны всего на 43%, и 80% замен аминокислот являются неконсервативными (Steinle et al. (2001) Immunogenetics 53:279-287; Steinle et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:12510-12515), что указывает на маловероятность получения антител, эффективных для большинства индивидуумов в популяции. Кроме того, биморфизм метионин/валин в положении 129 MICA определяет различия в связывании NKG2D, и несмотря на то, что боковая цепь остатка 129 частично погружена и образует гидрофобные связи с глутамином 136, аланином 139 и метионином 140 в первом α2-спиральном участке, это может быть связано с конформационными отличиями указанного домена от форм MICA с валином 129 (Steinle et al. (2001) Immunogenetics 53:279-287).

Таким образом, существует потребность в новых подходах к направленному воздействию на MICA терапевтическими агентами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно одному аспекту настоящее изобретение является результатом, в том числе, обнаружения антител с высоким сродством в отношении всех аллелей MICA человека (а также в отношении MICA не являющихся человеком приматов).

Указанные антитела связывают, в частности, один или более аллелей MICA из каждой из двух основных групп MICA, которые, как установлено, представляют основные семейства MICA: аллелей группы 1, сильно связывающих NKG2D (в том числе MICA*001, *002, *007, *012, *017 и *018) и группы 2, слабо связывающих NKG2D (МIСА*004, *006, *008, *009 и *019). Связываясь с эпитопом, присутствующим на MICA подгрупп *001, *004, *007 и *008, или *001, *004, *007, *008 и *019, указанные антитела охватывают аллели обеих групп, присутствующие практически у всех индивидуумов. Необязательно, ЕС50 указанных антител составляет не более чем 5 мкг/мл, необязательно не более чем 3 мкг/мл, не более чем 2 мкг/мл, не более чем 1 мкг/мл или не более чем 0,5 мкг/мл для связывания с клетками, модифицированными для экспрессии на их поверхности *001, для клеток, модифицированных для экспрессии на их поверхности *004, для клеток, модифицированных для экспрессии на их поверхности *007 и для клеток, модифицированных для экспрессии на их поверхности *008.

Высокоаффинное связывание обладает преимуществом, в том числе, эффективного опосредования антителом CDC (комплементзависимой цитотоксичности, КЗЦ) и АЗКЦ (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, АЗКЦ). В настоящем изобретении предложены эпитопы MICA в составе доменов α1 и/или α2, представляющие собой оптимальные связывающие антитело области для индуцирования высокой АЗКЦ-и/или КЗЦ-активности, и в то же время обнаруживаемые во всех основных аллелях MICA. Указанные эпитопы обычно расположены на боковой стороне доменов α1 и/или α2, и либо находятся полностью на наружной стороне связывающей поверхности NKG2D, либо частично заходят на связывающую поверхность NKG2D. Кроме того, идентифицированы эпитопы α3, способствующие повышенным уровням АЗКЦ/КЗЦ и демонстрирующие связывание с несколькими аллелями.

Также были идентифицированы подгруппы антител, блокирующие взаимодействие MICA с NKG2D. Помимо индуцирования АЗКЦ- и КЗЦ-активности при наличии Fc-доменов, связываемых Fcγ-рецепторами, или блокирования провоспалительной активности при наличии Fc-доменов, по существу не связываемых Fcγ-рецепторами, указанные антитела обладали полезной способностью блокировать индуцированное sMICA понижающее модулирование NKG2D.

Были также идентифицированы другие подгруппы антител, не блокирующие способность MICA на поверхности клеток (например, опухолевых клеток, трансфектантов) индуцировать NKG2D активность в NKG2D-экспрессирующей иммунной клетке, приведенной в контакт с указанной MICA-экспрессирующей клеткой в присутствии антитела против MICA. Помимо индуцирования АЗКЦ- и КЗЦ-активности, указанные антитела обладали полезной способностью действовать в обход ингибирования NKG2D, так что NKG2D-экспрессирующие иммунные эффекторные клетки сохраняли способность лизировать целевые клетки через NKG2D (например, дополнительно к любому опосредованному Fcγ-рецепторами механизму).

Рекомбинантный и связанный с клеточной поверхностью MICA, по-видимому, способен находиться в различных конформациях, и связывание клеточносвязанного MICA может оказывать отдаленное действие на белок MICA. В частности, блокирование способности MICA на поверхности клеток (например, опухолевых клеток, трансфектантов) индуцировать сигнализацию через NKG2D неожиданным образом не всегда коррелирует со способностью блокировать MICA-NKG2D взаимодействия при применении рекомбинантных белков (исследование Biacore). Также крайне неожиданным было то, что, хотя мультиаллельные антитела, как было обнаружено, не находятся полностью в составе зоны связывания NKG2D на плато домена α1α2, MICA-блокада способности MICA на поверхности клеток (например, опухолевых клеток, трансфектантов) индуцировать NKG2D-сигнализацию не коррелировала с расположением связывающего эпитопа. Некоторые антитела, находящиеся далеко от области взаимодействия NKG2D, были способны блокировать индуцирование активности NKG2D, тогда как некоторые другие антитела, находясь рядом с областью взаимодействия NKG2D или частично перекрываясь с ней, не блокировали индуцирование активности NKG2D. Антитела также различались по способности опосредовать КЗЦ как функции их эпитопов.

Аллели MICA группы 1 обычно содержат М в качестве остатка 129, в то время как аллели группы 2 в качестве остатка 129 содержат V. Согласно одному из вариантов реализации группы MICA характеризуют в соответствии с присутствием остатка метионина (М) или валина (V) в положении 129 полипептида MICA, при этом М ассоциирован с формой MICA, сильно связывающей NKG2D, а V ассоциирован с более слабым связыванием с NKG2D.

Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены антитела, перекрестно реагирующие с аллелем MICA, содержащим метионин в положении 129, и аллелем MICA, содержащим валин в положении 129. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложено моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом MICA человека, содержащим метионин в положении 129, и полипептидом MICA человека, содержащим валин в положении 129. ЕС50 указанных антител необязательно составляет не более чем 5 мкг/мл, необязательно не более чем 3 мкг/мл, не более чем 2 мкг/мл, не более чем 1 мкг/мл или не более чем 0,5 мкг/мл для связывания с клетками, модифицированными для экспрессии на их поверхности полипептида MICA человека, содержащего метионин в положении 129, и с клетками, модифицированными для экспрессии на их поверхности полипептида MICA человека, содержащего валин в положении 129.

Согласно одному варианту реализации указанное антитело также связывается с полипептидом MICB, содержащим валин в положении 152 (например, с полипептидом MICB, соответствующим последовательности SEQ ID NO: 6).

Обнаруженные области связывания присутствуют и на гликозилированном MICA, в частности, гликозилированном MICA, экспрессируемом преимущественно опухолевыми клетками человека.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение является результатом, в том числе, обнаружения антител, эффективных in vitro и in vivo для индуцирования лизиса эффекторными клетками (например, НК-клетками и/или Т-клетками) MICA-экспрессирующих опухолевых клеток, в то же время блокирующих взаимодействие MICA с NKG2D. Антитела, блокирующие взаимодействия NKG2D-MICA, обладают преимуществом, заключающимся в том, что такие антитела способны предотвращать индуцированную sMICA понижающую регуляцию NKG2D, как показано в настоящем описании. Такие блокирующие антитела могут быть особенно полезны для лечения пациентов с высокими уровнями растворимого MICA, например, в кровотоке. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложены антитела, эффективные in vitro и in vivo для индуцирования лизиса эффекторными клетками (например, НК-клетками и/или Т-клетками) MICA-экспрессирующих опухолевых клеток, и подавляющие индуцированное sMICA понижающее модулирование экспрессирования NKG2D на поверхности иммунной эффекторной клетки, по существу без блокирования выделения MICA из MICA-экспрессирующих клеток (например, опухолевых клеток). Такие антитела могут подавлять индуцированное sMICA понижающее модулирование экспрессирования NKG2D путем ингибирования взаимодействия MICA с NKG2D. Указанное антитело необязательно содержит CDR легкой и тяжелой цепей, необязательно с одной или большим количеством модификаций аминокислот в CDR, антител 9С10, 19Е9, 12А10, 18Е8, 14 В4 или 10F3.

Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложены антитела, эффективные in vitro и in vivo для индуцирования лизиса эффекторными клетками (например, НК-клетками и/или Т-клетками) MICA-экспрессирующих опухолевых клеток по существу без блокирования выделения MICA из MICA-экспрессирующих клеток (например, опухолевых клеток), и по существу без блокирования взаимодействия MICA с NKG2D. Указанное антитело необязательно содержит CDR легкой и тяжелой цепей, необязательно с одной или большим числом модификаций аминокислот в CDR, антител 6Е4, 20С6, 16А8, 15F9 10А7 или 14В4.

Согласно одному из вариантов реализации предложены антитела, которые связываются с доменом α1α2 (домен, участвующий в формировании контактной поверхности NKG2D), перекрестно реагирующие с несколькими аллелями MICA (например, аллелем MICA, содержащим метионин в положении 129, и аллелем MICA, содержащим валин в положении 129; аллелями MICA *001, *004, *007 и *008) и связывающие с высоким сродством такие аллели MICA (например, с ЕС50, составляющей не более чем 5 мкг/мл, необязательно не более чем 3 мкг/мл, не более чем 2 мкг/мл, не более чем 1 мкг/мл или не более чем 0,5 мкг/мл для связывания с клетками, модифицированными для экспрессии на их поверхности полипептида MICA человека, соответствующего указанному аллелю). Указанные антитела необязательно связываются с областями на домене α1α2, расположенными с наружной стороны или частично с наружной стороны контактной поверхности NKG2D, но не входящими полностью в состав контактной поверхности NKG2D.

Анализ связывания с аллелями MICA и оценка соответствующих значений ЕС50 могут осуществляться с применением, например, проточной цитометрии, в соответствии со способами, описанными в настоящем документе в примере 3.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение является результатом обнаружения антител, связывающих домен α1 и/или α2 MICA, по существу не блокируя взаимодействие MICA с NKG2D (например, при условии, что каждый из MICA и NKG2D экспрессируется на поверхности клеток). Такие антитела могут необязательно характеризоваться отсутствием конкуренции с hNKG2D за связывание MICA. Как вариант, указанные антитела не подавляют способность MICA индуцировать NKG2D активность в NKG2D-экспрессирующей клетке. Такие антитела могут, как вариант, быть охарактеризованы как не снижающие или не блокирующие способность NKG2D- экспрессирующей эффекторной клетки (например, СD16-негативной эффекторной клетки) к лизированию MICA-экспрессирующей целевой клетки. Как вариант, указанные антитела по существу не блокируют выделение MICA из опухолевых клеток.

Согласно одному из вариантов реализации не блокирующее домен α1α2 антитело связывает эпитоп на полипептиде MICA, соответствующем последовательности SEQ ID NO: 1, содержащий один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из K81 и D82, один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из Q83 и К84, один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из Н109, Y111 и L116, необязательно остаток D113, один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из Q131, S132 и Q136, один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из S133, R134 и Т137, и/или 1, 2, 3 или 4 остатка, выбранных из группы, состоящей из Ml40, N141, R143 и N144 (например, антитело 20С6 и 10А7).

Согласно одному из вариантов реализации не блокирующее домен α1α2 антитело связывает эпитоп, содержащий один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из R6 и N8, один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из Е97 и Н99, один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из Е100, D101 и N102, один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из S103, Т104 и R105, необязательно остаток Е115, и/или один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из L178, R179 и R180 (например, антитело 15F9).

Согласно одному из вариантов реализации не блокирующее домен α1α2 антитело связывает эпитоп, содержащий один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из Q48 и W49 полипептида MICA, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, и/или 1, 2, 3 или 4 остатка, выбранных из группы, состоящей из Е51, D52, V53 и L54 полипептида MICA, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1 (например, антитело 6Е4).

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение является результатом, в том числе, обнаружения антител, связывающих α3-домен MICA, отличающихся тем, что указанные антитела не подавляют взаимодействие MICA с NKG2D (например, при условии, что каждый из MICA и NKG2D экспрессируется на поверхности клеток). Необязательно указанные антитела по существу не блокируют выделение MICA из опухолевых клеток. Необязательно такое антитело может, как вариант, быть охарактеризовано как не конкурирующее с hNKG2D за связывание с MICA.

Согласно одному из вариантов реализации не блокирующее α3 домен антитело связывает эпитоп, содержащий один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из S224, Н225 и D226, один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из Т227, Q228 и Q229, и/или один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из W230 и D232 (например, антитела 16А8).

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение является результатом обнаружения антител, связывающих α1- и/или α2-домен MICA и подавляющих взаимодействие MICA с NKG2D (например, при условии, что каждый из MICA и NKG2D экспрессируется на поверхности клеток). Такое антитело может, как вариант, быть охарактеризовано как конкурирующее с hNKG2D за связывание с MICA. Указанные антитела необязательно подавляют индуцированное sMICA понижающее модулирование экспрессирования NKG2D на поверхности иммунной эффекторной клетки, по существу не блокируя выделение MICA из опухолевых клеток.

Согласно одному из вариантов реализации блокирующее домен α1α2 антитело связывает эпитоп, содержащий один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из Е100, D101 и N102, один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из S103, Т104 и R105, один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из N121 и Е123, и/или один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из Т124 и Е126 (например, антитела 19Е9, 18Е8 и 10F3).

Согласно одному из вариантов реализации блокирующее α1α2 антитело связывает эпитоп, содержащий 1, 2 или 3 остатка, выбранных из группы, состоящей из N56, K57 и Т58 полипептида MICA, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, и/или один или два остатка, выбранных из группы, состоящей из R61 и R64 полипептида MICA, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1 (например, антитело 9С10 и 12А10).

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение является результатом, в том числе, обнаружения антител, связывающих α3 домен MICA, отличающихся тем, что указанные антитела подавляют взаимодействие MICA с NKG2D (например, при условии, что каждый из MICA и NKG2D экспрессируются на поверхности клеток). Необязательно указанные антитела по существу не блокируют выделение MICA из опухолевых клеток. Необязательно такое антитело может, как вариант, быть охарактеризовано как конкурирующее с hNKG2D за связывание с MICA. Указанные антитела необязательно подавляют индуцированное sMICA понижающее модулирование экспрессирования NKG2D на поверхности иммунной эффекторной клетки. Указанные антитела могут по существу блокировать выделение MICA из опухолевых клеток или как вариант, могут по существу не блокировать выделение MICA из опухолевых клеток.

Согласно одному из вариантов реализации блокирующее α3-домен антитело связывает эпитоп, содержащий один, два или три остатка, выбранных из группы, состоящей из Т227, Q228 и Q229 (антитело 14 В4).

Без связи с конкретной теорией считается, что, несмотря на представленные в научной литературе данные, предполагающие наличие причинной связи между MICA (например, sMICA или мембраносвязанным MICA) и понижающей регуляцией NKG2D и нарушениями в эффекторных клетках, сам по себе MICA в условиях опухоли не всегда вызывает существенное нарушения в эффекторных клетках. В частности, в то время как sMICA может понижающе регулировать NKG2D, концентрации sMICA in vivo во многих случаях могут быть слишком низкими для того, чтобы они сами по себе могли существенно подавлять NKG2D (см. пример 9). Кроме того, в условиях опухоли (например, развившееся заболевание или заболевание на поздней стадии) пациент, как правило, находится в состоянии иммуносупрессии за счет ряда других компонентов помимо MICA (например, ТРФ-бета), обладающие потенциальной способностью, помимо других эффектов, понижающе модулировать NKG2D. В связи с этим агенты, блокирующие или не блокирующие взаимодействие NKG2D-MICA и не подавляющие выделение MICA, эффективны при лечении раковых заболеваний, при условии, что они способны индуцировать КЗЦ и/или АЗКЦ. Антитела, не блокирующие взаимодействия NKG2D-MICA, обладают преимуществом, поскольку MICA-экспрессирующие опухолевые клетки потенциально могут оставаться распознаваемыми для NKG2D на имеющихся иммунокомпетентных эффекторных клетках (например, при восстановлении иммунокомпетентности у пациента во время или после лечения, при продолжительном лечении, при повторных назначениях или при введении высоких доз). Антитела, блокирующие взаимодействие NKG2D-MICA, обладают преимуществом, заключающимся в том, что такие антитела могут предотвращать MICA-индуцированную понижающую регуляцию NKG2D (см. пример 9). Такие блокирующие антитела могут, в частности, подходить для лечения пациентов с высокими уровнями растворимого MICA, например, в кровотоке.

Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено связывающее MICA соединение, предпочтительно антитело, которое специфически связывается с полипептидом MICA (антитело против MICA), при этом не уменьшая на детектируемую величину связывание MICA и NKG2D (например, взаимодействие поверхностного MICA на опухолевых клетках с поверхностным NKG2D на эффекторных клетках), например, по существу не блокируя взаимодействие MICA и NKG2D. Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено связывающее MICA соединение (например, связывающий MICA полипептид), которое связывается с полипептидом MICA, по существу не блокируя выделение MICA из опухолевых клеток. Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено связывающее MICA соединение, которое связывается с полипептидом MICA, по существу не блокируя взаимодействие MICA с NKG2D и по существу не блокируя выделение MICA из опухолевых клеток.

Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложены антитела, связывающие MICA человека (в частности, в доменах α1 и/или α2), распознающее основные аллели MICA: MICA*001, MICA*004, MICA*008 и необязательно также MICA*007 и/или MICA*019. Согласно одному из вариантов реализации указанные антитела необязательно также распознают MICA не являющихся человеком приматов (например, яванского макака). Согласно одному из вариантов реализации указанные антитела необязательно также распознают полипептид MICB, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO 6. Согласно другому варианту реализации указанные антитела так же, как вариант, не распознают MICB. Как вариант, указанные антитела по существу не блокируют выделение MICA из опухолевых клеток. Как вариант, указанные антитела по существу не блокируют взаимодействие MICA с NKG2D.

Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено антитело, которое специфически связывается с гликозилированным полипептидом MICA, экспрессируемым опухолевой клеткой человека.

Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено антитело, которое специфически связывается с полипептидом MICA, экспрессируемым клеткой не являющегося человеком примата.

Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено антитело, которое специфически связывается с полипептидом MICA (антитело против MICA), отличающееся тем, что указанное антитело связывает полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 2 (MICA*004) и/или полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 4 (MICA*008). Согласно одному из вариантов реализации указанное антитело также связывает полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 1 (MICA*001). Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено антитело, которое специфически связывается с полипептидом MICA, отличающееся тем, что указанное антитело связывает полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 5 (MICA*019). Согласно одному из вариантов реализации указанное антитело также связывает полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 3 (MICA*007). Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено антитело, которое специфически связывается с полипептидом MICA, отличающееся тем, что указанное антитело связывает полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 2 (MICA* 004), полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 4 (MICA*008) и полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 5 (MICA*019). Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложено антитело, которое специфически связывается с полипептидом MICA, отличающееся тем, что указанное антитело связывает полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 1 (MICA*001), полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 2 (MICA*004), полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 4(MICA*008), и полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 5 (MICA*019), необязательно также отличающееся тем, что указанное антитело связывает полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO 3 (MICA*007). За счет связывания с аллелями MICA*001, *004 и *008, (и предпочтительно также *007 и *019) в обеих группах аллелей MICA, Группе 1 и Группе 2, лечение таким анти-MICA агентом согласно настоящему изобретению подходит фактически для всей человеческой популяции. Согласно любому варианту реализации полипептид, соответствующий последовательностям SEQ ID NO 1-5, может содержать О-гликан (N-ацетиллактозамин, соединенный с серином или треонином). Согласно любому варианту реализации полипептид, соответствующий последовательностям SEQ ID NO 1-5, может содержать О-гликан кора 2 (О-гликан, содержащий N-ацетилглюкозаминовую цепь, соединенную с N-ацетилгалактозамином) и/или N-связанный гликан. Согласно одному из вариантов реализации указанное антитело связывается с полипептидом MICA, по существу не блокируя взаимодействие MICA с NKG2D и/или по существу не блокируя выделение MICA из опухолевых клеток. Согласно одному из вариантов реализации указанное антитело связывает домен α1 и/или α2 MICA. Согласно одному из вариантов реализации указанное антитело связывает α3-домен MICA.

Предпочтительно, указанное соединение представляет собой антитело, необязательно тетрамерное антитело, содержащее две тяжелые цепи Ig и две легкие цепи Ig. Предпочтительно, указанное антитело обладает сродством к связыванию (K_D), необязательно бивалентным сродством к связыванию, полипептида MICA человека, составляющим менее чем 10^-9 М, предпочтительно менее чем 10^-10 М или предпочтительно менее чем 10^-11. Предпочтительно, указанное антитело представляет собой истощающее антитело, необязательно отличающееся тем, что указанное антитело индуцирует АЗКЦ и/или КЗЦ в отношении экспрессирующей MICA опухолевой клетки.

Согласно конкретному варианту реализации в настоящем изобретении предложено антитело, опосредующее элиминацию MICA-экспрессирующих опухолевых клеток НК-клеткой или Т-клеткой (например, in vivo или in vitro) по существу без подавления NKG2D-опосредованной цитотоксичности экспрессирующей hNKG2D НК- или Т-клетки.

Согласно конкретному варианту реализации антитело согласно настоящему изобретению не конкурирует с hNKG2D за связывание с MICA.

Согласно конкретному варианту реализации при связывании антитела согласно настоящему изобретению с MICA на MICA-экспрессирующей клетке в указанной MICA-экспрессирующей клетке по существу не снижается количество поверхностного hNKG2D за счет, например, стимуляции понижающего регулирования и/или интернализации hNKG2D, указанное антитело обладает высоким сродством и малой скоростью диссоциации, вступает в перекрестную реакцию с MICA яванского макака и/или макака-резуса, и принадлежит к истощающему изотипу, такому как, например, IgG1 человека.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложено антитело, которое специфически связывает MICA, отличающееся тем, что указанное антитело обладает одной или несколькими (включая любую их комбинацию, или все) из следующих характеристик:

(a) Kd связывания полипептида MICA составляет менее чем 10^-8 М, предпочтительно менее чем 10^-9 М, или предпочтительно менее чем 10^-10 М;

(b) связывается по меньшей мере с одним остатком в сегменте, соответствующем остаткам домена, выбранным из группы, состоящей из 1-88, 89-181 и 182-274 полипептида MICA, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, и/или связывается с эпитопом (один или более аминокислотных остатков на MICA) согласно описанию в настоящем документе;

(c) связывается с двумя, тремя, четырьмя или пятью полипептидами из MICA*001, *004, *007, *008, и *019, содержащими последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1-5, соответственно;

(d) по существу не блокирует выделение MICA из опухолевых клеток;

(e) по существу не блокирует взаимодействие MICA с NKG2D (например, взаимодействие поверхностного MICA на опухолевых клетках с поверхностным NKG2D на эффекторных клетках);

(f) не вызывает существенного уменьшения лизиса MICA-экспрессирующих клеток эффекторными клетками (например, NKG2D+CD16- НК-клетками);

(g) индуцирует комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) и/или антитело зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) в отношении клетки, которая экспрессирует MICA на поверхности; и

(h) конкурирует за связывание полипептида MICA с антителом 6Е4, 20С6, 16А8, 15F9 и 10А7.

Согласно любому из представленных в настоящем документе вариантов реализации антитело согласно настоящему изобретению может характеризоваться любым одним или несколькими признаками из приведенных выше в пп.(а)-(h).

Согласно одному из вариантов реализации предложен способ тестирования антитела против MICA, при этом указанный способ включает: (i) оценку того, блокирует ли указанное антитело выделение MICA из MICA-экспрессирующих клеток и/или (ii) оценку того, блокирует ли указанное антитело взаимодействие MICA с NKG2D. Этап (i) может необязательно включать приведение антитела, связывающего полипептид MICA, в контакт с клеткой, экспрессирующей полипептид MICA. Этап (ii) может необязательно включать приведение антитела, связывающего полипептид MICA, в контакт с полипептидом MICA (например, выделенным полипептидом или полипептидом, экспрессируемым на поверхности клетки), в присутствии полипептида NKG2D (например, выделенного полипептида или полипептида, экспрессируемого на поверхности клетки).

Согласно другому варианту реализации предложен способ получения антитела, связывающего полипептид MICA у субъекта-млекопитающего, необязательно для лечения ракового заболевания, при этом указанный способ включает следующие этапы: а) получение совокупности антител, необязательно иммунизация не являющегося человеком млекопитающего иммуногеном, содержащим полипептид MICA; и b) осуществление отбора антитела из указанной совокупности, причем этот этап включает:

(i) проверка того, связывается ли антитело с полипептидом MICA человека, необязательно одним, двумя, тремя, четырьмя или всеми полипептидами из соответствующих последовательностям SEQ ID NO 1-5, и отбор антитела в том случае, если оно связывается с полипептидом(ами) MICA человека; и/или

(ii) проверка того, блокирует ли антитело выделение MICA из MICA-экспрессирующих клеток, и отбор антитела в том случае, если оно не блокирует выделение; и/или

(iii) проверка того, блокирует ли антитело взаимодействие MICA (например, поверхностного MICA) с NKG2D, предпочтительно отличающееся тем, что указанное антитело вызывает существенное снижение лизиса MICA-экспрессирующих клеток эффекторными клетками (например, NKG2D+CD16- НК-клетками, и отбор антитела в том случае, если оно не блокирует взаимодействие MICA (например, поверхностного MICA) с NKG2D, предпочтительно отличающееся тем, что указанное антитело не вызывает существенного снижения лизиса MICA-экспрессирующих клеток.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение является результатом, в том числе, открытия блокирующих антител против MICA, обладающих высоким сродством ко всем основным аллелям MICA человека, принадлежащим к двум главным группам аллелей MICA (а также к MICA и MICB не являющихся человеком приматов). Согласно одному из вариантов реализации группы MICA характеризуются присутствием остатка метионина (М) или валина (V) в положении 129 полипептида MICA, при этом М ассоциирован с формой MICA, сильно связывающей NKG2D, а V ассоциирован с более слабым связыванием NKG2D. Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены блокирующие антитела, которые перекрестно реагируют с аллелем MICA, содержащим метионин в положении 129, и аллелем MICA, содержащим валин в положении 129. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложено моноклональное антитело, ко