Средство, обладающее противотуберкулезным действием

Средство, обладающее противотуберкулезным действием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, а именно к созданию лекарственных препаратов на основе новогаленовых средств, обладающих противотуберкулезной активностью, и может быть применено для доклинических и клинических исследований по лечению туберкулеза, в том числе вызванного устойчивыми штаммами ко многим препаратам.

Борьба с туберкулезом относится к одному из наиболее приоритетных направлений современной медицины (Приймак А.А. Размышления о туберкулезе // Пульмонология - 2005. - С. 35-38; Туберкулез - национальное руководство / Под ред. М.И. Перельмана. – М.: ГЭОТАР. - 2007. - 752 с.). В последние десятилетия значимость этой проблемы возросла в связи с формированием высокой устойчивости к лечению туберкулеза (Туберкулез / Под ред. Б. Блума. - М.: Медицина, 2002. - 677 с.). Одной из основных причин, обусловливающих развитие эпидемии туберкулеза во всем мире, служит распространение лекарственно-устойчивых форм заболевания, плохо поддающихся лечению ограниченным набором известных противотуберкулезных препаратов.

Лечение пациентов с лекарственно-устойчивым туберкулезом и особенно туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), по крайней мере к двум основным препаратам - изониазиду и рифампицину - требует значительно более дорогостоящего и длительного лечения с применением препаратов, нередко вызывающих серьезные побочные реакции (Васильев А.В., Гришко А.Н. Туберкулез в Российской Федерации 2011 г. Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации и в мире.- М., 2013 // Туберкулез и город: проблемы профилактики, диагностики и лечения. - СПб., 1996. - С. 9-16). Такие реакции проявляются выраженным гепатотоксическим действием, а также тошнотой, рвотой, болевыми ощущениями в области сердца, психозами, появлением периферических невритов с атрофией мышц и параличей конечностей и др. Кроме того, противопоказаниями к назначению ряда препаратов являются сахарный диабет, воспаление зрительного нерва и глаза, беременность, детский возраст и др (Лекарственные средства: пособие по фармакотерапии для врачей: (В 2-х т.) / М.Д. Машковский. - 11-е изд., стер. - М.: Медицина. Ч. 1. - 621 с.). Все это обусловливает необходимость поиска новых безопасных антибактериальных средств с противотуберкулезным действием. Одним из источников нетоксичных лекарственных препаратов антимикробного действия, в том числе и в отношении устойчивых к известным препаратам микроорганизмов, могут стать экстракты из лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Нами впервые получено противотуберкулезное средство из кроющих листьев початков антоциановой диплоидной формы кукурузы обыкновенной (Zea mays L.).

Антоциановая форма кукурузы Zea mays L., обладающая доминантными генами маркера «коричневый Саратовский» была создана на кафедре генетики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского и предложена в качестве источника для получения принципиально нового безопасного красного красителя для пищевой и фармацевтической промышленности. Все части растения за исключением тычиночных цветков окрашены в интенсивно-фиолетовый цвет.

К преимуществам данного вида растительного сырья относятся отсутствие токсичности, канцерогенной и мутагенной активности и возможность его использования, как красителя (Купчак Т.В., Николаева Л.О., Шимолина Л.Л. Выделение и идентификация антоцианов из гибридной кукурузы // Фармацевтический журнал. 1995. №6. С. 62-64; Полуконова H.В., Дурнова Н.А., Райкова С.В., Разуваева К.А., Щербаченко А.С, Алъмяшев Р.Ш. Анализ химического состава и биологических свойств спиртового экстракта растительного сырья гибридной формы кукурузы Zea mays L. // Материалы IV Всерос. с междунар. участием научно-метод.конфер «Фармобразование 2010». Воронеж. 2010 а. С. 306-311; Полуконова Н.В., Федорова И.П., Гопиенко А.В., Тырнов B.C. Токсикологическая, канцерогенная и мутагенная безопасность антоциановой формы кукурузы Zea mays L. как источника красного красителя // Бюллетень ботанического сада СГУ. Вып. 9. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2010 б. С. 78-83), а также удобством выращивания и заготовки с применением автоматизированных технических средств. По данным Рейвна П.Х. с соавторами (Рейвн П.Х., Эверт Р.Ф., Айкхорн С.Е. Современная ботаника. М.: Мир. 1990. Т.2. 258 с.), растение может широко культивироваться на территории России с выходом сырья до 10 т/га.

Кроме того, в сырье содержится целый комплекс биологически активных веществ (Купчак Т.В., Николаева Л.О., Шимолина Л.Л. Выделение и идентификация антоцианов из гибридной кукурузы // Фармацевтический журнал. 1995. №6. С. 62-64; Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Райкова С.В., Разуваева К.А., Щербаченко А.С, Альмяшев Р.Ш. Анализ химического состава и биологических свойств спиртового экстракта растительного сырья гибридной формы кукурузы Zea mays L. // Материалы IV Всерос. с между нар. участием научно-метод. конфер «Фармобразование 2010». Воронеж. 2010. С. 306-311): фенольных соединений (не менее 28), 11 фенольных кислот и 13 флавоноидов, из них не менее четырех антоцианов. Флавоноиды представлены производными флавона и флавонола. Антоцианы, представлены производными флавия со свободными ортодигидрокси группировками в кольце В (хризантемин, идеин). Установлено отсутствие антрагликозидов, дубильных веществ, кумаринов, кардиотонических гликозоидов и алкалоидов.

Среди других препаратов из растительного сырья известен водно-спиртовой экстракт корней и надземных частей солодки голой Glycyrrhiza glabra, обладающий выраженной противотуберкулезной активностью (патент №2362577, 2007 г., Сухенко Л.Т., Урляпова Н.Г., Назарова Г.Н), в котором содержатся: тритерпеновый сапонин глицирризин, Са и К соли глицирризиновой кислоты (до 20-30%); глицирретиновая кислота (до 10-20%), в т.ч. и соединения группы флавоноидов. Активность данного экстракта сравнительно высокая - концентрация менее 2,5×10^-4 мг/мл активных веществ полностью подавляла рост МБТ. Недостатком данного средства служит то, что способ изготовления занимает более 10 дней, а сам препарат может быть использован только, как дополнение к комплексной противотуберкулезной терапии и не подходит для самостоятельной терапии из-за низкой эффективности, в частности нет данных о способности данного средства влиять на резистентные штаммы с МЛУ.

Недостатком данного экстракта корней и надземных частей солодки голой Glycyrrhiza glabra служит высокое содержание глицирризина и глицирризиновой кислоты, которые, как известно (Солодки корень. Описание препарата в справочнике Видаль) нарушают метаболизм кортизола в организме, что способствует развитию псевдоальдостеронизма и может привести к сердечно-сосудистым заболеваниям. Кроме того, в процессе получения экстракт подвергался автоклавированию, в результате чего под действием высоких температур многие активные компоненты (в т.ч. флавоноиды), которые могли бы оказать антиоксидантное действие, разрушались, а в лечении туберкулеза не маловажным аспектом является и снижение интоксикации, так как на фоне этого заболевания, как общеизвестно, возможно развитие вторичного амилоидоза и кахексии.

Известно также средство (RU 2223107, 05.09.2007), обладающее противотуберкулезным действием, содержащее лист алоэ ( perfoliata L.), корневище аира (Acorus calamus L.), листья березы (Betula pendula L.), цветки гибискуса (Hibiscus moscheutos L.), корневища и корни девясила (Jnula helenium L.), цветки липы (Tilia cordata Mill), плоды лимонника (Schisandra glabra (Brickell) Render), лист крапивы (Urtica dioica L.), траву фиалки (Viola tricolor L.,), лист мяты (Mentha×piperita L.), корень солодки (Glycyrrhiza glabra L.), траву хвоща (Equisetum arvense L.,) и траву череды (Bidens tripartita L.), Фитохимический анализ заявленного средства установил наличие в нем таких биологически активных веществ, как флавоноиды, дубильные вещества, полисахариды, сапонины, эфирные масла, витамины, органические кислоты. Основным биологически активным компонентом являются флавоноиды и полисахариды.

Недостатком данной композиции является невозможность достоверно определить химические соединения, оказавшие противотуберкулезное действие. Экстрагирование до получения сухого экстракта производилось при температуре 90-95 градусов, что разрушающе действует на флавоноиды, заявленные как одни из основных действующих веществ данной композиции.

Нами впервые предложено средство в виде экстракта, обладающее противотуберкулезной активностью. Средство получено разработанным нами ранее способом (RU 2482863, 15.02.2012), позволяющим получать нетоксичные экстрактивные вещества даже из ядовитых растений. Для полученного экстракта из листьев кукурузы нами уже описаны положительные эффекты на организм животных с перевиваемым раком печени и, в то же время, негативное воздействие на опухолевые клетки, проявляющиеся как в виде цитотоксического, так и цитостатического эффектов (Navolokin N.A., Polukonova N.V., Maslyakova G.N., Bucharskaya A.B., Durnova N.A. Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with trasplanted liver cancer // Russian Open MedicalJournal 2012. P. 1-4.; Наволокин H.A., Мудрак Д.А., Матвеева О.В., Тычина С.А., Бучарская А.Б., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. Влияние растительных экстрактов, содержащих флавоноиды, на лейкоцитарную формулу и красный костный мозг лабораторных крыс с перевитой саркомой 45 // Успехи современного естествознания. 2015. №4. С. 134-14).

Технической задачей настоящего изобретения служит расширение арсенала средств из растительного сырья, обладающих противотуберкулезной активностью, экономически более доступных и нетоксичных.

Нами впервые установлены свойства средства, представляющего собой сухой экстракт из кроющих листьев початков антоциановой диплоидной формы кукурузы обыкновенной (Zea mays L.).

Преимуществом предлагаемого экстракта служит отсутствие токсичности и доступность сырья, из которого получают средство, а также наличие антимутагенной, антиоксидантной активности и общего положительного влияния на организм (Курчатова М.Н., Дурнова Н.А., Полуконова Н.В. Влияние экстрактов, содержащих биофлавоноиды, на индукцию микроядер диоксидином в эритроцитах крови беспородных белых мышей // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2014. №2. С. 58-65; Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Тычина С.А., Корчаков Н.В. Изменения лейкоцитарной формулы, красного костного мозга и опухоли лабораторных крыс с перевитой саркомой-45 при введении экстрактов аврана лекарственного, бессмертника песчаного, кукурузы антациановой. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2015. Т. 11, №3. С. 328-332).

Нами впервые установлены свойства средства, представляющего собой сухой экстракт листьев кукурузы антациановой, полученного путем их измельчения, экстракцией спиртом 96%, выпариванием экстракта, добавлением хлороформа, удалением хлороформа, причем экстракцию спиртом проводят на водяной бане до кипения и кипятят в течение 14-15 минут, выпаривают при температуре 55-60°С, выпаренный экстракт разводят сначала дистиллированной водой 40-50°С, затем добавляют хлороформ в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, далее отделяют водную фракцию и высушивают ее. Полученная биологическая активная композиция обладает новым свойством: противотуберкулезным действием.

Параметры подлинности и качества средства.

Средство, полученное данным способом из кукурузы антоциановой содержит следующие вещества: этиловый эфир гексадекановой кислоты; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; 1-(4-метоксифенил)-метоксипропан; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); этиловый эфир линоленовой кислоты; 9,12-октадекановая кислота; 2-(5-хлор-2-метоксифенил) пиррол, производные прунина и нарингенина, кверцетин и др. вещества.

Стандартизация экстракта проводилась по содержанию кверцетина, концентрация которого составила 57,57 мкг/мл.

Полученный таким образом экстракт представляет собой биологически активную композицию, с новым фармакологическим свойством - противомикробным, в частности противотуберкулезным, ранее не известным как для растения кукуруза антациановая, так и для описанного выше средства.

Средство представляет собой сухой экстракт, багрово-фиолетового цвета, смешивается с водой и спиртом этиловым в любых соотношениях.

Полученный нами упаренный экстракт листьев кукурузы антоциановой нетоксичен, что обусловлено химическим составом и подтверждено ранее на крысах (N.A. Navolokin, N.V. Polukonova, G.N. Maslyakova, А.В. Bucharskaya, N.A. Durnova / Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with transplanted liver cancer//Russian Open Medical Journal 2012; 1: 0203).

Определение противотуберкулезного эффекта экстракта кукурузы антациановой.

Работа проведена на базе бактериологической лаборатории ГБУЗ «Тамбовский областной клинический противотуберкулезный диспансер». В работе использованы водные растворы сухих экстрактов кроющих листьев початков растений антоциановой диплоидной формы кукурузы обыкновенной (Zea mays L.). Экстракт приготовлен авторским способом [Патент Российская Федерация. 2013. №2482863; Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Курчатова М.Н. и др. Химический анализ и способ получения новой биологически активной композиции из травы аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.): Химия растительного сырья. 2013. №4. С. 165-173]. При определении доброкачественности определяли следующие его числовые показатели сырья: влажности - менее 12%, золы общей - менее 10%, органических примесей - менее 1%, неорганических примесей - менее 1%, что соответствовало ГОСТу «Трава кукурузы гибридной» (Купчак Т.В. Фитохимическая характеристика гибридной формы кукурузы Zea mays L. и технология антоцианового красящего препарата. Автореф. дисс. …к.фарм.н. СПб. 1998. 23 с.).

С целью изучения противотуберкулезной активности экстракта первоначально провели исследование динамики роста музейного штамма H37Rv под действием экстракта из кроющих листьев початков кукурузы обыкновенной в концентрации 4,5 мг/мл.

Наблюдения проводили в течение 28 суток, на питательную среду засевали два титра МБТ с содержание клеток, соответствующее 50×10⁷ и 500×10 микробных тел в 1 мл.

Клинические штаммы микобактерий туберкулеза (МБТ) были получены при посеве респираторного материала (мокрота) от больных, проходящих лечение в ГБУЗ «Тамбовский областной клинический противотуберкулезный диспансер». Лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам первого ряда (изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу) исследовали с использованием стандартной методики оценки лекарственной устойчивости микобактерий на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (HiMedia, Индия) методом абсолютных концентраций [Приказ МЗ РФ от 21 марта 2003 г. N 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»; Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств. Ч. 6. М., 1986].

Культуру Mycobacterium tuberculosis (МБТ) расценивали как устойчивую или резистентную к препарату (далее к экстракту) только при наличии роста 20 колоний (R) и более и как чувствительную при росте не более 20 колоний (S).

Анализ проводили на двух штаммах МБТ, для которых нами бактериологическим исследованием (методом абсолютных концентраций) была предварительно установлена множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), т.е. лекарственная устойчивость к рифампицину и изониазиду.

Молекулярно-генетическое исследование анализируемых штаммов МБТ с МЛУ проводили с помощью метода гибридизации на биочипах «ТБ-БИОЧИП» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия) по методике, рекомендованной производителем. Метод включал в себя выделение ДНК М. tuberculosis из респираторных образцов, проведение двух последовательных мультиплексных ПЦР, гибридизации продуктов амплификации второй стадии ПЦР на биочипе. Результаты гибридизации регистрировали на портативном анализаторе биочипов (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия) с соответствующим программным обеспечением.

Для первого штамма устойчивость к рифампицину обусловлена аминокислотной заменой His→Cys в положении 526 гена rpoВ и дополнительной мутацией в гене inhA, тогда как у второго- только заменой Ser→Leu 531 ко дона в гене rpoВ. Лекарственная устойчивость к изониазиду вызвана заменой аминокислоты Ser на Thr(1) ко дона 315 в гене katG как для первого, так и для второго штамма (табл. 1).

При исследовании активной бактериостатической/бактерицидной концентрации было заложено четыре линии культур: первая линия представляла собой положительный контроль (ряд из двух пробирок с каждым штаммом без воздействия), вторая линия - ряд из двух пробирок без засева штаммами для исключения случайного роста МБТ (отрицательный контроль). Третья линии (культуры с клиническими штаммами, обладающими МЛУ) была экспериментальной и содержала шесть пробирок с разными разведениями экстракта I (129 мг/мл); II (64,5 мг/мл); III (32,3 мг/мл); IV (16,1 мг/мл); V (8,1 мг/мл); VI (4,0 мг/мл).

Установление минимальной подавляющей концентрации (МПК) для экстракта кукурузы проводили по методу серийных разведений на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (производство HiMedia, Индия) [Приказ МЗ РФ от 21 марта 2003 г. N 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»]. Водный раствор сухого спиртового экстракта добавляли к среде во время ее приготовления при температуре 20-25°С, равномерно распределяя его. МБТ засевали в стандартном титре (содержание клеток, соответствующее 1×10⁷ микробных тел /мл. Контроль роста колоний возбудителя туберкулеза проводили в течение 28 суток [Приказ МЗ РФ от 21 марта 2003 г. N 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»].

Собственная модификация стандартного метода заключалась в замене абсолютных концентраций серийным разведением с целью определения порога концентраций экстракта, при преодолении которого рост МБТ не определялся.

Результаты исследования.

В обеих повторностях была показана высокая бактерицидная активность экстракта кукурузы в течение всего периода наблюдения (табл. 2).

Примечание: (+) - 1-20 КОЕ - скудный рост МБТ

(++) - 21-100 КОЕ - умеренный рост МБТ

(+++) - более 100 КОЕ - обильный рост МБТ

Исследованы активности разных концентраций экстракта кукурузы в отношении лекарственно резистентных клинических штаммов М. tuberculosis, отличающихся нуклеотидными заменами, определяющими лекарственную устойчивость. Установили, что в отношении штаммов М. tuberculosis с МЛУ экстракт кукурузы антоциановой обладает бактерицидной активностью при концентрации раствора в среде 32,3 мг/мл (для первого штамма с заменами His→Cys и Ser→Thr(1)) и 64,5 мг/мл (для второго с заменами Ser→Leu и Ser-→Thr(1)) (табл. 1). Выраженного бактериостатического эффекта экстракта кукурузы на указанные лекарственно устойчивые штаммы М. tuberculosis при заданных концентрациях не обнаружили, хотя отметили замедление роста (выросли отдельные колонии) при концентрациях начиная с 16,1 как для первого, так и от для второго штаммов по сравнению с контрольными посевами.

В результате экстракт антоциановой кукурузы оказался эффективен в отношении штаммов, характеризующихся следующими аминокислотными заменами: His→Cys, Ser→Leu, определяющими изменения в структуре (β-субъединицы РНК-полимеразы МБТ, и Ser→Thr (1), инактивирующей фермент каталазу-пероксидазу микобактерий (табл. 3).

Примечание: *Число КОЕ (колонию образующая единица) указано, если его можно подсчитать. При большом числе КОЕ, не поддающемся подсчету, указана приблизительная доля (%) поверхности питательной среды с ростом МБТ.

Результат: S - штамм чувствителен, R - штамм устойчив.

Таким образом, экстракт кукурузы антоциановой обладает противотуберкулезной активностью. Действие представлено бактерицидным эффектом. Музейный штамм чувствителен при концентрации с 4,5 мг/мл. Клинические штаммы, резистентные к препаратам первого ряда, чувствительны к экстракту кукурузы, начиная с концентрации 64,5 мг/мл.

Пример 1.

Листья кукурузы измельчали и просеивали через сито с размером ячеек не более 3 мм. Взвесили 10 г измельченного сырья, поместили его в колбу объемом 500 мл, добавили 100 мл этилового спирта 96%, на водяной бане довели до кипения и кипятили в течение 14 мин. Экстракт из колбы процедили в стеклянную емкость через 4 слоя широкого бинта, остаток растительного материала тщательно отжали, залили еще 100 мл этилового спирта 96%. Довели до кипения и снова профильтровали в ту же стеклянную емкость. Полученный экстракт выпарили досуха в термостате при температуре 55°С. В стеклянную емкость с выпаренным экстрактом добавили 8 мл дистиллированной воды, затем с помощью шприца перенесли полученный раствор в пластиковую центрифужную пробирку объемом 11 мл, добавили 2 мл хлороформа, встряхнули несколько раз до однородности, остудили до комнатной температуры и центрифугировали в течение 15 мин (для удаления неполярных примесей (хлорофилла) и др.) при скорости 1500 оборотов в минуту. Водную фракцию собирали с помощью шприца, поместили в заранее взвешенную чашку Петри, высушили и в таком виде хранили до начала эксперимента. Вес сухого экстракта подсчитали как разницу между весом чашки Петри с сухим экстрактом и весом пустой чашки Петри. Получили 225 мг сухого экстракта кукурузы.

Первоначально провели исследование динамики роста музейного штамма H37Rv под действием экстракта листьев кукурузы в концентрации 4,5 мг/мл.

На питательную среду засевали два титра МБТ с содержанием клеток, соответствующим 50×10⁷ и 500×10⁷ микробных тел в 1 мл. Анализ проводили на двух штаммах МБТ, для которых была предварительно установлена множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), т.е. лекарственная устойчивость к рифампицину и изониазиду. Было заложено четыре линии культур: первая линия представляла собой положительный контроль (ряд из двух пробирок с каждым штаммом без воздействия), вторая линия - ряд из двух пробирок без засева штаммами для исключения случайного роста МБТ (отрицательный контроль). Третья линии (культуры с клиническими штаммами, обладающими МЛУ) была экспериментальной и содержала шесть пробирок с разными разведениями экстракта I (129 мг/мл); II (64,5 мг/мл); III (32,3 мг/мл); IV (16,1 мг/мл); V (8,1 мг/мл); VI (4,0 мг/мл). Установление минимальной подавляющей концентрации (МПК) для экстракта кукурузы проводили по методу серийных разведений на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена.

Водный раствор сухого спиртового экстракта добавляли к среде во время ее приготовления при температуре 20-25°С, равномерно распределяя его. МБТ засевали в стандартном титре (содержание клеток, соответствующее 1×10⁷ микробных тел /мл. Контроль роста колоний возбудителя туберкулеза проводили в течение 28 суток. Собственная модификация стандартного метода заключалась в замене абсолютных концентраций серийным разведением с целью определения порога концентраций экстракта, при преодолении которого рост МБТ не определялся.

В результате в обеих повторностях была показана высокая бактерицидная активность экстракта кукурузы в течение всего периода наблюдения. Установили также, что в отношении штаммов М. tuberculosis с МЛУ экстракт кукурузы обладает бактерицидной активностью при концентрации раствора в среде 32,3 мг/мл (для первого штамма с аминокислотными заменами His→Cys и Ser→Thr(l)) и 64,5 мг/мл (для второго с аминокислотными заменами Ser→Leu и Ser→Thr(l)).

Таким образом, экстракт кукурузы обладает противотуберкулезной активностью. Преимуществами данного средства является отсутствие токсичности при бактерицидном эффекте, а также эффективность в отношении клинических штаммов, устойчивых к препаратам первого ряда, которые на данный момент не дают лечебного эффекта. МПК экстракта кукурузы в отношении клинических штаммов с МЛУ составляет 64,5 мг/мл.

Средство, обладающее противотуберкулезным действием, представляющее собой сухой экстракт, полученный путем измельчения кроющих листьев початков антоциановой диплоидной формы кукурузы, экстракции спиртом 96% на водяной бане до кипения и кипячения в течение 14-15 минут, выпаривания при температуре 55-60°С, разведения выпаренного остатка сначала дистиллированной водой при температуре 40-50°С, затем добавления хлороформа в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждения до комнатной температуры и центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут с последующим отделением водной фракции и высушиванием ее.