Способы диагностики глаукомы

Способы диагностики глаукомы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение принадлежит к области медицинской диагностики и относится, в частности, к способам диагностики глаукомы, основанным на анализе аутоиммунной реактивности. Данное изобретение включает два способа диагностики глаукомы. Как первый, так и второй способ диагностики основан на аутоиммунной реактивности в жидкостях организма пациентов, страдающих от глаукомы. Дополнительный аспект изобретения относится к терапевтическим способам, модулирующим аутоиммунную реактивность у пациентов, страдающих от глаукомы.

Первый способ диагностики глаукомы основан на анализе аутоиммунной реактивности жидкостей организма против глазных антигенов, которые, по меньшей мере, частично очищены. Второй способ диагностики глаукомы основан на анализе действия аутоантител в жидкостях организма, на экспрессии белков в выращенных in vitro ганглиозных клетках сетчатки (RGC).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Глаукома представляет собой группу глазных расстройств, характеризующихся прогрессирующей утратой ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов, и постепенной утратой поля зрения. Она представляет собой одну из ведущих причин слепоты во всем мире. Глаукома имеет распространенность среди приблизительно 1-2% всего населения Европы. До 3-4% людей в возрасте более чем 60 лет поражены заболеванием. Наиболее распространенная форма глаукомы представляет собой первичную открытоугольную глаукому (POAG) с распространенностью в диапазоне от 1,1% до 2%.

Патогенез глаукомы понятен только частично, и за заболевание отвечает не только увеличенное внутриглазное давление. Увеличенное внутриглазное давление все еще рассматривают как главный фактор риска, но другие патогенные факторы, такие как процессы апоптоза, увеличенные уровни оксида азота или вовлеченность иммунной системы, вероятно, также имеют значение.

Кроме того, увеличенное внутриглазное давление довольно распространено (10% населения в возрасте 40 лет), тем не менее, только у некоторых из этих людей с течением времени развивается глаукома. До настоящего времени отсутствуют стандартные диагностические тесты для идентификации тех лиц с увеличенным внутриглазным давлением, у которых будет развиваться глаукома. Поскольку раннее лечение глаукомы является критичным для предупреждения утраты зрения, существует потребность в улучшенных диагностических средствах, которые позволяли бы обнаруживать глаукому на ранней стадии независимо от увеличенного внутриглазного давления.

Увеличенное внутриглазное давление известно как главная причина гибели клеток сетчатки и развития глаукомы. Увеличенное давление как причина гибели клеток воспроизведено in vitro. Agar et al. (Brain Res. 2006. 1086 (1): p. 191-200) воздействовал на культуры линий ганглионарных клеток in vitro увеличенным гидростатическим давлением, что вызывало гибель клеток.

Тем не менее, также известно, что приблизительно 30% случаев глаукомы не сопровождается увеличением внутриглазного давления. По меньшей мере некоторые формы глаукомы соответствуют картине нейродегенеративных заболеваний с прогрессирующей дисфункцией аспектов нервной системы наряду с прогрессирующей атрофией пораженных структур периферической или центральной нервной системы. Таким образом, обсуждаются дополнительные причины и механизмы, помимо увеличенного внутриглазного давления, которые могут приводить к разрушению ганглиозных клеток сетчатки, такие как, например увеличенный уровень оксида азота или опосредованный Т-клетками процесс или аутоиммунные приступы.

Возможности раннего обнаружения глаукомы все еще ограничены. Измерение внутриглазного давления может помочь выявить некоторых из пациентов, но колебание уровней давления может также привести к ложно-отрицательному результату. К тому времени, когда пациенты сами отмечают утрату зрительной функции, значительный необратимый дефект ганглиозных клеток сетчатки в большинстве случаев уже успевает произойти.

Примерно 30% случаев глаукомы, которые не сопровождаются увеличенным внутриглазным давлением, называются нормотензивной глаукомой. Традиционный способ обнаружения, при котором измеряют увеличенное внутриглазное давление, не эффективен в случае этих пациентов.

Учитывая отсутствие способа диагностики нормотензивной глаукомы, а также отсутствие способа обнаружения глаукомы на ранней стадии, необходимо разработать способы для обнаружения глаукомы независимо от внутриглазного давления. То, что аутоиммунитет является важным фактором при глаукоме продемонстрировано в нескольких исследованиях, в которых выявлены сывороточные антитела против глазных антигенов. Например белки теплового шока HSP27, HSP60, α-В-кристаллин, γ-энолаза, α-фодрин, глутатион-S-трансфераза и глюкозаминогликаны обладают разными уровнями связывающей реактивности у пациентов, страдающих от глаукомы, по сравнению со здоровыми субъектами (например Joachim, S.C., et al„ Curr. Eye Res. 2007, 32(6): p. 501-9.) Интересно, что для жидкостей организма пациентов, страдающих от глаукомы, характерна не только увеличенная реактивность антител, которые могут оказывать аутоагрессивное влияние, но и сниженная аутоиммунная реактивность для некоторых антигенов. Кроме того, может быть продемонстрировано, что прямое применение антител против HSP приводит к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки в ситуации культуры клеток (Tezel G, et al. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1998; 39:2277-2287).

Ранее были раскрыты способы диагностики, основанные на паттерне специфической аутоиммунной реактивности у пациентов, страдающих от глаукомы. Например, в WO 2004/036220 раскрыты способы диагностики глаукомы путем анализа комплекса репертуара аутоантител против глазных антигенов в жидкостях организма, таких как сыворотка крови, слезы, внутриглазная жидкость или слюна. В качестве источника глазных антигенов используют неочищенные смеси антигенов сетчатки глаза, антигенов зрительного нерва и другие и измеряют сложные паттерны аутоиммунной реактивности. Разнообразные аналитические иммунологические способы, включая анализ путем вестерн-блоттинга, хемилюминисцентный анализ, ИФА (иммуноферментный анализ), радиоиммуноанализ для обнаружения и измерения паттерна аутоиммунной реактивности, а также способы цифрового обнаружения, обработки и анализа изображения использовали для формирования и сравнительного анализа паттернов аутоиммунной реактивности у тестируемых индивидов, здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы. В документе WO 2004/036220 раскрыты способы диагностики глаукомы, основанные на паттернах аутоиммунной реактивности против глазных антигенов, которые не выделены из сложных смесей, включающих большое количество глазных антигенов, большая часть которых не идентифицирована. Различие паттернов аутоиммунной реактивности в жидкостях организма тестируемых индивидов, здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, таким образом позволяет получить диагностический результат. Тем не менее, исследования в области диагностики, касающиеся других заболеваний, таких как рак, показали, что диагностика, основанная на аутоиммунной реактивности против биомаркеров неизвестной идентичности, часто не надежна. Таким образом, существует потребность в надежных способах диагностики глаукомы, которые не зависят от увеличенного внутриглазного давления.

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить альтернативные и улучшенные надежные способы диагностики для обнаружения глаукомы независимо от увеличенного внутриглазного давления путем анализа жидкостей организма. Дополнительная задача изобретения заключается в том, чтобы предложить способы диагностики для обнаружения глаукомы с избирательными степенями чувствительности и специфичности, используемыми для быстрого тестирования и для профессионального лабораторного тестирования. Дополнительные задачи изобретения включают предоставление элементов, несущих антиген, и наборов для диагностики глаукомы, а также вновь идентифицированных глазных антигенов, служащих в качестве биомаркеров для диагностики глаукомы и в качестве блокирующих агентов в терапевтическом лечении глаукомы.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из аспектов изобретения относится к первому способу диагностики глаукомы, основанному на анализе аутоиммунной реактивности в жидкостях организма против по меньшей мере одного образца, содержащего по меньшей мере один из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов, где аутоиммунную реактивность против одного или более чем одного известного глазного антигена измеряют и преобразуют в индекс глаукомы в отношении предпочтительно взвешенного вклада их измеренной аутоиммунной реактивности в диагностический результат.

Дополнительные аспекты изобретения включают элементы, несущие антиген, несущие по меньшей мере один частично очищенный глазной антиген и способы получения этих элементов, несущих антиген, и их применения для диагностики глаукомы. Дополнительные аспекты включают наборы для диагностики глаукомы, содержащие элемент, несущий антиген, и возможно вспомогательные материалы. Дополнительные аспекты включают способы отбора жидкости организма, такой как слезы, для применения в способе диагностики глаукомы. Другие дополнительные аспекты включают глазные антигены, служащие в качестве биомаркеров для диагностики глаукомы или служащие в качестве терапевтических агентов в терапевтическом лечении глаукомы или служащие для приготовления специфических антител, связывающихся с таким глазным антигеном, для применения в диагностике или терапевтическом способе или композиции.

Первый способ диагностики глаукомы включает стадии (а) взятия по меньшей мере одного образца, содержащего по меньшей мере один по меньшей мере частично очищенный глазной антиген, (б) осуществления реакции жидкости организма по меньшей мере с одним образцом глазного антигена, (в) обнаружения и/или количественной оценки реакций между аутоантителами в жидкости организма и по меньшей мере одним образцом глазного антигена на стадии (б) для определения величины аутоиммунной реактивности, (г) сравнения измеренных значений аутоиммунной реактивности со стандартными данными, полученными для пациентов, страдающих от глаукомы, и/или здоровых индивидов для определения индекса глаукомы для по меньшей мере одного образца антигена и (д) возможно, определения диагностического результата путем оценки по меньшей мере одного индекса глаукомы.

Термин "жидкость организма индивидуумов-людей или животных" в контексте данной заявки на изобретение включает, но не ограничивается указанным, сыворотку крови, слезы, слюну, мочу, внутриглазную жидкость, стекловидное тело глаза или цереброспинальную жидкость и ее фракции, или гомогенат образцов тканей индивидуумов-людей или животных и его фракции. В предпочтительных воплощениях способа диагностики глаукомы используют сыворотку крови или слезы.

"Глазной антиген" относится к любому антигену, который обнаруживают также в глазу и, очевидно, некоторые из этих глазных антигенов, упомянутые ниже, явно обнаруживаются повсеместно. Глазные антигены, представленные в глазу, в частности включают антигены сетчатки глаза, антигены зрительного нерва, антигены головки зрительного нерва, антигены трабекулярной сети, увеальные антигены. Известно, что антигены, связанные с глаукомой, не ограничиваются белками, представленными в ганглиозных клетках сетчатки, но включают антигены, которые характерны для соседних клеток, таких как клетки глии или компоненты цитоскелета.

Кроме того, для данной заявки на изобретение, термин "глазные антигены" - включая все из конкретно обозначенных глазных антигенов, упомянутых ниже - применяется не только к физиологическим, природным формам соответствующих белков, но также к посттрансляционно модифицированным формам и к любым другим природным или искусственным производным, таким как пептиды, и формам, которые являются меченными, расщепленными, химически модифицированными иным образом, включая комбинации упомянутых модификаций.

"По меньшей мере частично очищенные глазные антигены" относятся к глазным антигенам, которые выделены из сложной смеси белков их физиологической окружающей среды путем по меньшей мере частичной очистки белков при помощи стандартных способов очистки белка. Глазные антигены доступной коммерческой чистоты также рассматривают как по меньшей мере частично очищенные глазные антигены для применения в способе диагностики глаукомы в контексте данного описания. Такая частичная очистка позволяет получить по меньшей мере 70 масс. % одного или более чем одного желаемого глазного антигена от общей массы белка, предпочтительно по меньшей мере 80 масс. %, более предпочтительно по меньшей мере 90 масс. %, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95 масс. %.

Термин глазной антиген образец относится к образцу, содержащему один или более чем один по меньшей мере частично очищенный глазной антиген. В предпочтительных воплощениях способа по изобретению образец глазного антигена содержит только один глазной антиген и индексы глаукомы определяют индивидуально для каждого из частично очищенных глазных антигенов по отдельности. В дополнительных предпочтительных воплощениях два или более чем два частично очищенных глазных антигена комбинируют с по меньшей мере одним из образцов глазного антигена. Для таких образцов глазных антигенов измеренные аутоиммунные реактивности соответствует аутоиммунной реакции против комбинации двух или более чем двух глазных антигенов, которые таким образом дают один индекс глаукомы. В противоположность антигенам, не выделенным из их физиологической окружающей среды, такой как глазные клеточные лизаты, относительные количества компонентов комбинации антигенов являются контролируемыми. Такая контролируемая комбинация антигенов также может привести к взвешиванию т.е. действию весового коэффициента, который модулирует вклад измеренной аутоиммунной реактивности некоторых глазных антигенов в диагностический результат.

В данном описании термины 'глазные антигены' или 'антигены' часто используются взаимозаменяемо и заменяют несколько более длинные выражения 'по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов' или 'образцы из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов'.

Аутоиммунная реактивность или взаимозаменяемо иммунореактивность и реактивность аутоантитела в контексте данного описания относятся к связывающей активности аутоантител, представленных в жидкостях организма в отношении по меньшей мере частично очищенного глазного антигена, который инкубируют с жидкостью организма.

Способы обнаружения и измерения аутоиммунной реактивности включают стандартные иммунологические аналитические способы, такие как анализ путем вестерн-блоттинга, хемилюминисцентный анализ, ИФА, радиоиммуноанализы, микрочипы и другие. Антигены наносят и фиксируют на элементе, несущем антиген, и затем инкубируют с жидкостью организма, содержащей обнаруживаемые антитела. Затем связанные аутоантитела идентифицируют для определения аутоиммунной реактивности. Способы идентификации включают, например предварительное мечение анализируемого образца, добавление вторичного антитела, который связывается с антигенсвязанными аутоантителами или с косвенной меткой, например мечеными козьими антителами против человеческих иммуноглобулинов и т.д. Дополнительно способы включают анализ адресуемых элементов, таких как гранулы, наночастицы, метки и т.д. Способы обнаружения также могут включать способы, которые не требуют мечения, например типа SELDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией), MALDI (масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией в присутствии матрицы) или другие способы с антителами на чипе.

Первый способ диагностики глаукомы по изобретению основан на различии средней аутоиммунной реактивности у здоровых индивидов по сравнению с пациентами, страдающими от глаукомы, против некоторых глазных антигенов. Таким образом, некоторые титры аутоантител против некоторых глазных антигенов в жидкостях организма используют в качестве диагностического свидетельства глаукомы.

Один из аспектов изобретения относится к вновь идентифицированным глазным антигенам, с которыми аутоантитела связываются дифференцированно у здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, и которые полезны с диагностической точки зрения в качестве маркеров (или биомаркеров) для обнаружения глаукомы и для терапевтического лечения.

Для того чтобы получить информацию на основании измеренных сигналов аутоиммунных реактивностей против образцов глазного антигена измеренные сигналы или значения аутоиммунной реактивности сравнивают со стандартными данными, в предпочтительных воплощениях сравнение со стадии г) осуществляют для каждого образца глазного антигена отдельно. В предпочтительных воплощениях стандартные данные включают средние значения для аутоиммунной реактивности, измеренные против каждого образца глазного антигена для здоровых контрольных индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы. В других предпочтительных воплощениях стандартные данные включает средние значения для аутоиммунной реактивности, измеренные в отношении каждого образца глазного антигена, характерные для некоторых стадий заболевания. Таким образом, диагностика различных стадий глаукомы, а также мониторинг прогресса глаукомы попадают в объем способа по изобретению. В дополнительных предпочтительных воплощениях стандартные данные по аутоиммунной реактивности включает аутоиммунную реактивность, характерную для субтипов специфических форм глаукомы.

Такие стандартные данные также могут быть получены при помощи контрольных реакций стадий (а) - (в) способа диагностики глаукомы из жидкостей организма здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, которые проводят параллельно с тестируемыми образцами, или такие стандартные данные могут иметь происхождение из сохраненных данных из контрольных реакций, проведенных в идентичных условиях в различные моменты времени.

В предпочтительных воплощениях индекс глаукомы рассчитывают для каждого образца глазного антигена на основании измеренного значения аутоиммунной реактивности путем сопоставления измеренного значения для тестируемого индивида со стандартными данными и перевода измеренного значения аутоиммунной реактивности в индекс глаукомы. В упрощенном примере индекс глаукомы определяют по аутоиммунной реактивности, измеренной для каждого индивидуального образца глазного антигена с использованием шкалы диагностики глаукомы от 0 до 100, где 0 соответствует среднему значению измеренной аутоиммунной реактивности против конкретного глазного антигена у здоровых индивидов и 100 соответствует среднему значению измеренной аутоиммунной реактивности против этого антигена у пациентов, страдающих от глаукомы.

В предпочтительных воплощениях способа по изобретению для расчета преобразования значения измеренной аутоиммунной реактивности в соответствующий индекс глаукомы в соответствии со стадией (г) используют алгоритмы с использованием стандартных методов многопараметрических статистических способов, иерархические алгоритмы или искусственные нейронные сети. Аналогично, в некоторых предпочтительных воплощениях на стадии (д) используют алгоритмы для анализа определенных индексов глаукомы для каждого из образцов глазных антигенов для определения диагностического результата, и в дополнительных предпочтительных воплощениях алгоритмы используют для обеих стадий. В других дополнительных вариантах по меньшей мере один индекс глаукомы со стадии (г) представляет собой последнюю стадию первого способа диагностики глаукомы. В соответствии с этих вариантами стадия (д) не входит в первый способ диагностики глаукомы, но осуществляется практикующим врачом, который выводит диагностический результат на основании индексов глаукомы.

Основное преимущество способа диагностики глаукомы по изобретению заключается в том, что диагностический результат основывается на анализе индексов глаукомы из частично очищенных антигенов известной идентичности.

В предпочтительных воплощениях весовой коэффициент присваивается по меньшей мере одному из образцов глазных антигенов. Такие весовые коэффициенты модулируют вклад аутоиммунной реактивности против конкретного образца глазного антигена для достижения диагностического результата. В предпочтительных воплощениях весовой коэффициент вводят путем вычислений на стадии (в) или (г), или (д) первого способа диагностики, тем не менее, в некоторые предпочтительных воплощениях весовой коэффициент вводят на стадиях (а) или (б) и в других дополнительных воплощениях весовые коэффициенты вводят в более чем одной стадии (а) - (д). Весовые коэффициенты оказывают действие на модулирование диагностического результата независимо от стадии, на которой они введены. Взвешенный индекс глаукомы получаеют в результате введения весового коэффициента на любой одной или более чем одной стадии (а) - (д).

В соответствии с предпочтительными воплощениями, в которых диагностический результат основан на взвешенном индексе глаукомы, специфический весовой коэффициент вводят на расчетной стадии, когда сигналы, испускаемые аутоантителами, связывающимися с индивидуальными антигенами, обнаруживают и измеряют при помощи средства обнаружения сигнала, такого как оптический ридер.

В соответствии с дополнительными предпочтительными воплощениями весовой коэффициент вводят путем дифференцированного определения веса для количества индивидуальных антигенов, подвергающихся реакции с аутоиммунными антителами, и/или путем определения веса одной или более чем одной из аналитических стадий для обнаружения и измерения аутоиммунной реактивности в отношении индивидуальных антигенов. Примеры таких воплощений включают обнаружение аутоиммунной реактивности с гранулами, сконструированными таким образом, чтобы быть специфическими в отношении различных антигенов, причем определение веса может быть осуществлено с помощью дифференцированной интенсивности мечения антигенспецифических гранул или дифференцированно градуированной чувствительности детектирующего средства.

Вес индексов глаукомы определяют, например, таким образом, что индексы глаукомы для образцов глазных антигенов с высокой диагностической релевантностью в большей степени вносят вклад в диагностический результат. В упрощенном примере образец X глазного антигена, который вызывает аутоиммунные реактивности, различающиеся большой значимой величиной между пациентами, страдающими от глаукомы, и здоровыми индивидами, и имеет стандартные данные средних значений с низкими стандартными отклонениями, в общем обладают более высокой диагностической релевантностью по сравнению с образцом Y глазного антигена, который вызывает аутоиммунные реактивности, отличающиеся только слегка между пациентами, страдающими от глаукомы, и здоровыми индивидами, и обладает средними стандартными значениями с высоким стандартным отклонением. Соответственно и конкретно, в тесте на глаукому, который разработан для максимизации специфичности, индексы глаукомы для образца антигена X могут быть иметь больший вес, чем индексы глаукомы для образца антигена Y при модулировании их соответствующего вклада в диагностический результат.

Дополнительное преимущество первого способа диагностики заключается в том, что известные частично очищенные глазные антигены, которые содержатся в образцах глазных антигенов, взятых на стадии а), и/или любой назначенный весовой коэффициент, выбирают в зависимости от цели конкретного диагностического теста для глаукомы. Например в скрининговом тесте, разработанном для диагностики глаукомы на ранней стадии заболевания, может быть желательно максимизировать чувствительность. Для такого применения диагностического теста некоторых количество ложно-положительных результатов рассматривают как приемлемые, но ложно-отрицательные результаты должны быть исключены.

Дополнительное преимущество предпочтительных воплощений первого способа диагностики заключается в том, что из сведений о физиологической роли антигенов, которое приводит к высокой оценке глаукомы у конкретного пациента, может быть извлечена дополнительная диагностическая информация, что обогащает диагностический результат.

По мере того, как становится известным, как прогресс заболевания коррелирует с аутоиммунной реактивностью против глазных антигенов, такие антигены, характерные для специфической стадии, конкретно ранней стадии, могут быть использованы в качестве биомаркеров для мониторинга прогресса заболевания, включая мониторинг эффективности медицинского лечения для замедления или остановки прогресса заболевания. Клинически, весьма важно идентифицировать среди индивидов с увеличенным внутриглазным давлением тех, у которых развивается глаукома, для начала лечения до необратимой гибели ганглиозных клеток сетчатки.

В предпочтительных воплощениях стадии (а) способа диагностики глаукомы по меньшей мере 2 частично очищенных глазных антигена, или по меньшей мере 3 или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 2 и меньше чем 5 или 10 антигенов из Группы 1, состоящей из следующих 46 глазных антигенов, включены в один или более чем один образец из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов: актина, альбумина, альфа-1-антитрипсина, аннексина II, аннексина V, бета-2-адренергического рецептора, нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), кальретикулина, кардиолипина, альфа-А-кристаллина, альфа-В-кристаллина, бета-L-кристаллина, бета-S-кристаллина, гамма-кристаллина, ДНК топоизомеразы 1, фибронектина, α-фодрина (=спектрина), глиофибриллярного кислого белка (GFAP), глутатион-S-трансферазы, белка теплового шока HSP10 (=шаперонина), HSP27, HSP60, HSP70, инсулина, jo-1, лизоцима, белка, связывающего миелин (МВР), миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (MOG), миоглобина, нейронспецифической энолазы (NSE), нейротрофина 3, пероксиддисмутазы, 3-фосфосерина, преальбумина, ингибитора протеинкиназы С, протеинкиназы С, супероксиддисмутазы, альфа-синуклеина, гамма-синуклеина, тиреоглобулина, трансферрина, транстиретина, ингибитора топоизомеразы, убиквитина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), виментина.

Антигены следующей подгруппы вышеупомянутых антигенов, названной Группа 2, впервые идентифицированы в качестве диагностических маркеров для глаукомы. В дополнительных предпочтительных воплощениях стадии (а) способа диагностики глаукомы по меньшей мере 1 частично очищенный глазной антиген, или по меньшей мере 2 или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 2 и меньше чем 5 или 10, или 20 антигенов следующей Группы 2 включены в один или более чем один образец из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов: альбумина, аннексина II, нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), кальретикулина, кардиолипина, бета-S-кристаллина, гамма-кристаллина, ДНК топоизомеразы 1, фибронектина, инсулина, jo-1, лизоцима, миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (MOG), миоглобина, нейротрофина 3, пероксиддисмутазы, 3-фосфосерина, преальбумина, ингибитора протеинкиназы С, протеинкиназы С, супероксиддисмутазы, альфа-синуклеина, гамма-синуклеина, тиреоглобулина, трансферрина, транстиретина, ингибитора топоизомеразы, убиквитина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

8 отношении некоторых из антигенов вышеупомянутой Группы 1 ранее было известно, что реактивность аутоантител против них отличаются у пациентов, страдающих от глаукомы, и здоровых индивидов. Это было подтверждено (см.примеры и графические материалы), и их реактивность в качестве аутоантител обладает диагностической релевантностью также при глаукоме. Эти глазные антигены из Группы 3 представляют собой: актин, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок (GFAP), глутатион-S-трансфераза, HSP27, HSP60, HSP70, белок, связывающий миелин (МВР), нейронспецифическая энолаза (NSE), виментин.

Антигены в Группе 1 классифицируются на три подгруппы А, В и С. При помощи способов, описанных в примерах и графических материалах, в которых измеряют аутоиммунную реактивность против различных глазных антигенов у здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, оценивают диагностическую релевантность антигенов. Антигены в группе С или предпочтительно антигены в группе В, или более предпочтительно антигены в группе А, входят в по меньшей мере один образец глазных антигенов, используемых для первого способа диагностики глаукомы.

24 частично очищенных глазных антигена из следующей группы идентифицированы как высокорелевантные диагностические маркеры для глаукомы, и классифицируются как антигены Группы А: актин, альфа-1-антитрипсин, аннексии V, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, бета-L-кристаллин, бета-S-кристаллин, гамма-кристаллин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок (GFAP), глутатион-S-Трансфераза, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, белок, связывающий миелин (МВР), нейронспецифическая энолаза (NSE), ингибитор протеинкиназы С, супероксиддисмутаза, трансферрин, транстиретин, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), виментин. В предпочтительных воплощениях по меньшей мере один образец глазных антигенов, которые берут на стадии а), содержит по меньшей мере 2 антигена, выбранные из Группы А глазных антигенов.

9 частично очищенных глазных антигенов из следующей группы идентифицированы как высокорелевантные диагностические маркеры для глаукомы и классифицируются как антигены Группы В: аннексии II, бета-2-адренергический рецептор, кальретикулин, белок теплового шока HSP10 (=шаперонин), инсулин, пероксиддисмутаза, протеинкиназа С, альфа синуклеин, гамма-синуклеин. В дополнительных предпочтительных воплощениях по меньшей мере один образец глазных антигенов, которые берут на стадии а), содержит по меньшей мере 2 антигена, выбранные из Группы А и/или из Группы В глазных антигенов:

Также 14 частично очищенных глазных антигенов из следующей Группы С идентифицированы как релевантные диагностические маркеры для глаукомы: альбумин, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кардиолипин, ДНК топоизомераза 1, фибронектин, лизоцим, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (MOG), миоглобин, нейротрофин 3, 3-фосфосерин, тиреоглобулин, ингибитор топоизомеразы.

В дополнительных предпочтительных воплощениях по меньшей мере один образец из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов содержит по меньшей мере 1 антиген, или предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 1 и меньшей чем 5 или 10 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 2 и меньше чем 20 или все из антигенов, которые относятся к Группе 2 или как Группе 2, так и Группе А, классифицированной как Группа 2-А, или которые относятся к Группе 2 и также к Группе А или к Группе В, классифицированной как Группа 2-АВ.

Еще один аспект изобретения относится к элементу, несушему антиген, несущему, несущий по меньшей мере один образец, содержащий по меньшей мере один по меньшей мере частично очищенный глазной антиген.

Предпочтительные воплощения элемента, несущего антиген, включают микроматричные чипы, тестовые полоски с латеральным потоком и микрожидскостные чипы. В некоторые предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, содержит заранее определенную зону антигена, которая представляет собой площадь поверхности на полоске или слайде, или планшете и т.п, или заранее определенную поверхность в устройстве на которое образцы глазного антигена нанесены в виде пятен или микропятен. В других предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, дополнительно содержит приемную зону для жидкости организма. В дополнительных предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, содержит гранулы или другой субстрат, который покрыт образцами глазных антигенов. В дополнительных предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, несет взвешенные количества образцов глазных антигенов, и в других дополнительных воплощениях элемент, несущий антиген, содержит глазные антигены, выбранные из Группы 1 или Группы 2, или Группы А или Группы А и В или Группы 2-А. Понятно, что в объем изобретения также входит использование комбинации вышеупомянутых признаков для элемента, несущего антиген, по изобретению.

В предпочтительном воплощении первого способа диагностики глаукомы элемент, несущий по меньшей мере один образец из числа образцов глазных антигенов, представляет собой чип с микроматрицей антигенов. По меньшей мере один образец глазных антигенов нанесен в виде пятен на матрицу или микроматрицу антигенов в двумерной или трехмерной матрице пятен на элементе, несущем антиген, который, например представляет предметное стекло, планшет или чип, или нитроцеллюлозный слайд, или гидрогелевый слайд и т.п. Белковые матрицы готовят путем нанесения по меньшей мере 2, предпочтительно 3-5, или 3-9 или 3-12 образцов по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов, где применимо, из конкретной группы антигенов, описанных выше, на несущий элемент, такой как покрытый нитроцеллюлозой слайд. Матрицы инкубируют с подходящим образом разбавленными образцами жидкости организма, такими как сыворотка крови, слезы или внутриглазная жидкость. Аутоиммунную реактивность обнаруживают, например путем визуализации реакции аутоантитело-антиген на матрицах в соответствии с общепринятыми способами, известными в области техники, такими как, например обработка флуоресцентно меченым антителом против IgG, с последующим сканированием флуоресценции. Сигналы, испущенные вторичными антителами, оцифровывают; интенсивность пятен измеряют и, возможно, сравнивают с результатами для жидкостей организма контрольных индивидов с использованием многопараметрических статистических способов. Альтернативные способы обнаружения реактивности аутоантитела включают визуализацию при помощи антитела против человеческого IgG, связанного с ферментативными реакциями, с компонентом, добавленным или представленным на элементе, несущем антиген, что приводит к появлению окрашивания или к изменению окрашивания. Такое изменение цвета в некоторых применениях может быть визуализировано непосредственно или при помощи детектирующего средства, такого как оптический ридер. В других дополнительных предпочтительных воплощениях аутоиммунные реактивности измеряют при помощи конкурентного анализа, который представляет собой еще один принятый способ иммуноанализа: например имеющиеся в продаже моноклональные флуоресцентные антитела, специфические в отношении некоторых глазных антигенов, конкурируют с аутоантителами, которые присутствуют в жидкости организма со стадии б) за взаимодействие с по меньшей мере частично очищенными глазными антигенами, взятыми на стадии а). Сильная аутоиммунная реактивность жидкости организма против конкретного глазного антигена при таком анализе приводит в результате к получению слабого сигнала, поскольку немеченые аутоантитела в жидкости организма затрудняют связывание с антигенами имеющихся в продаже флуоресцентно меченых антител. Очевидно, что изобретение не ограничено примерами стандартных иммунологических анализов, известных в области техники, которые упомянуты здесь как простые примеры, но распространяется на любой стандартный иммунологический анализ, известный в области техники как применимый для определения аутоиммунной реактивности в жидкостях организма против по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов.

В некоторых предпочтительных применениях весовой коэффициент, назначаемый индивидуальным антигенам для модуляции их вклада в диагностический результат, вводят, например путем нанесения пятен, содержащих различные количества антигена, на микроматрицу, или дифференцированного определения веса сигналов, испускаемых антителами,