Анализ адромедуллина и способы определения зрелого адромедуллина

Анализ адромедуллина и способы определения зрелого адромедуллина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предметом настоящего изобретения является способ in vitro для терапии периода наблюдения у пациентов с сепсисом, в котором концентрацию зрелого ADM 1-52 и/или зрелого ADM 1-52-Gly в образце биологической жидкости указанного пациента с сепсисом определяют, используя анализ, включающий два связующих, которые связывают две различные области в пределах области зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly, которая представляет собой аминокислотный 21-52-амид SEQ ID No. 1 или аминокислотный 21-52-Gly SEQ ID No. 2, где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.

Предметом представленного изобретения, кроме того, являются анализы и способы калибрования.

Пептидный адромедуллин (ADM) описан впервые у Kitamura et al., (смотри также 1; цифровые данные основаны на прилагаемом списке литературы) как новый гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, который был выделен из феохромоцитомы человека. В том же году, также были описаны кДНК, кодирующая пептид предшественника, содержащий 185 аминокислот, и полная аминокислотная последовательность данного пептида предшественника. Пептид предшественника, который содержит, среди прочего, сигнальную последовательность из 21 аминокислоты на N-конце, называют как "пре-проадреномедуллин" (пре-проADM). Пре-проADM содержит 185 аминокислот и имеет последовательность, которая соответствует SEQ ID No: 3. Зрелый ADM отображается в SEQ ID No. 4 и зрелый ADM-Gly отображается в SEQ No. 5.

Пептидный адромедуллин (ADM) представляет собой пептид, который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID No: 2), и который содержит аминокислоты от 95 по 146 из пре-проADM, из которого он формируется путем протеолитического расщепления. В настоящее время, по сути, только несколько фрагментов из пептидных фрагментов, образованных при расщеплении пре-проADM, были более точно охарактеризованы, в частности физиологически активные пептиды адромедуллина (ADM) и "РАМР", пептид, содержащий 20 аминокислот (22-41), которые следуют за 21 аминокислотой сигнального пептида в пре-проADM. Для обоих как ADM, так и РАМР, к тому же физиологически активные суб-фрагменты были обнаружены и исследованы более детально. Открытие и характеристика ADM в 1993 инициировало интенсивные исследования активности и поток публикаций, результаты которых были недавно подытожены в различных обзорных статьях, в контексте представленного описания, в котором ссылка делается, в частности, на статьи, которые были найдены в выпуске "Peptides", посвященном ADM (Peptides 22 (2001)), в частности (2) и (3). Дополнительным обзором является (4). В научных исследованиях на сегодняшний день, было обнаружено, среди прочего, что ADM может быть рассмотрен как полифункциональный регуляторный пептид. Он высвобождается в кровообращение в неактивной форме, продолженной глицином (5). Кроме того, существует связывающий белок (6), который является специфическим для ADM, и возможно, аналогичным образом, модулирует действие ADM.

Данные физиологические воздействия ADM, а также РАМР, которые имеют первостепенное значение в исследованиях на сегодняшний день, представляли собой воздействия, влияющие на кровяное давление. Таким образом, ADM является эффективным вазодилататором, причем существует возможность связать гипотензивный эффект, в частности, с пептидными сегментами в C-терминальной части ADM.

Кроме того, было обнаружено, что вышеуказанный далее физиологически активный пептид РАМР, образованный из пре-проADM, аналогичным образом демонстрирует гипотензивное действие, даже если он по-видимому, имеет механизм действия, отличающийся от такого ADM (смотри также в дополнение к вышеупомянутым обзорным статьям (3) и (4) также (7), (8) или (9) и (10)).

Кроме того, было обнаружено, что концентрации ADM, которые могут быть измерены в кровотоке и других биологических жидкостях, присутствуют, при ряде патологических состояний, значительно выше концентраций, которые были обнаружены у здоровых контрольных личностей. Таким образом, уровень ADM значительно возрастает у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертоническими расстройствами, сахарным диабетом, в острой фазе шока и при сепсисе, и при септическом шоке, хотя и в разной степени. Концентрации РАМР, кроме того, являются возросшими при некоторых указанных патологических состояниях, но уровни плазмы снижаются по отношению к ADM ((3); страница 1702).

Кроме того, известно, что необычно высокие концентрации ADM должны наблюдаться при сепсисе или при септическом шоке (смотри также (3) и (11), (12), (13), (14) и (15)). Полученные результаты относятся к типичным гемодинамическим изменениям, которые известны как типичный симптом развития болезни у пациентов с сепсисом и другими тяжелыми синдромами, такими как, например, SIRS.

Хотя, предполагается, что ADM и РАМР образуются из одного и того же пептида предшественника, пре-проADM (SEQ ID No: 3), в котором аминокислотные последовательности, соответствующие данным пептидам присутствуют в виде частичных пептидов в эквимолярных количествах, концентрации ADM или РАМР, измеряемые в биологических жидкостях, по всей видимости, отличаются. В этом нет ничего необычного.

Таким образом, измеряемые концентрации различных продуктов разрушения одного и того же пептида предшественника могут различаться, например, потому что они представляют собой результат различных конкурирующих путей разрушения, которые, например, в случае различных патологических состояний, приводят к различной фрагментации предшествующего пептида и, следовательно, различным продуктам разрушения. Определенные частичные пептиды, содержащиеся в пептиде предшественника, могут быть образованы как свободные пептиды или не могут быть образованы, и/или различные пептиды образуются различными путями и в различных количествах. Даже если только один путь разрушения берут для обработки пептида предшественника, и, следовательно, все продукты разрушения происходят от одного и того же пептида предшественника, и должны быть сформированы в чистом виде, главным образом, в эквимолярных количествах, сравнительно устойчивые концентрации различных частичных пептидов и фрагментов, измеряемые в биологических жидкостях могут быть очень разными, а именно, например, когда их индивидуальные пептиды образуются с разной скоростью и/или имеют различные индивидуальные стабильности (время жизни) в соответствующей биологической жидкости, или если же они удаляются из кровотока на основании различных механизмов выведения и/или при разных скоростях выведения.

Адромедуллин играет решающие роли во время развития сепсиса ((16), (17)) и при многочисленных острых и хронических заболеваниях ((18), (4)).

ADM повышается при сепсисе и является прогностическим для последствий при сепсисе ((19), (14), (11)). Лечение сепсиса доводят до конца для раннего контролируемого наблюдения успешности лечения или неблагоприятного исхода, что является существенной остаточной неудовлетворенной клинической необходимостью.

В настоящее время не существует никаких ADM анализов, пригодных для рутинных диагностик. Чувствительность общедоступных в настоящее время тестов, чтобы определить зрелый ADM, является слишком низкой. Таким образом, для анализа является необходимым большой объем плазмы. Кроме того, в настоящее время, общедоступные анализы демонстрируют стабильность, связанную предварительно аналитическими ограничениями, например, образцы должны быть стабилизированы апротинином ((20), (21)). Вдобавок, некоторые анализы ADM требуют широкомасштабную подготовку образцов перед измерением (11).

Целью представленного изобретения является обеспечение анализа, который пригоден как рутинный способ для прямого измерения зрелого ADM, подходящий для стандартной автоматизированной лаборатории и технологии диагностики на месте.

Удивительно, но оказалось, что такой анализ может быть использован для контроля лечения у пациентов с сепсисом.

Объектом представленного изобретения является способ in vitro для контролирования терапии у пациентов с сепсисом, в котором определяют концентрацию зрелого ADM 1-52 и/или зрелого ADM 1-52-Gly в образце биологической жидкости указанного пациента с сепсисом, используя анализ, включающий два связующих вещества, которые связываются с двумя различными областями в пределах области зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly, который является аминокислотным 21-52-амидом SEQ ID No. 1 или аминокислотным 21-52-Gly SEQ ID No. 2, в котором каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.

В одном варианте осуществления изобретения объектом является способ in vitro для контролирования терапии у пациентов с сепсисом, в котором одно из указанных связующих связывается с областью, которая включена в следующую последовательность зрелого ADM и/или зрелого ADM 1-52-Gly: ADM 21-32: CTVQKLAHQIYQ (SEQ ID No. 6)

и в котором указанный второй из данных связующих связывается с областью, которая включена в следующую последовательность зрелого ADM и/или зрелого ADM 1-52-Gly: ADM 42-52: APRSKISPQGY (SEQ ID No. 7)

В одном варианте осуществления изобретения чувствительность анализа указанного анализа способна определять количество ADM у здоровых субъектов и составляет <10 пг/мл, предпочтительно <40 пг/мл, более предпочтительно <70 пг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения указанное связующее демонстрирует аффинность связывания со зрелым ADM и/или зрелым ADM 1-52-Gly, по меньшей мере, 10⁷ Μ^-1, предпочтительно 10⁸ Μ^-1, предпочтительная аффинность составляет больше чем 10⁹ М^-1, наиболее предпочтительная - больше чем 10¹⁰ М^-1. Квалифицированный специалист в данной области с уровня техники знает, что может быть рассмотрено компенсирование более низкой аффинности путем применения более высокой дозы соединений и данное мероприятие не будет приводить к выходу за пределы объема изобретения.

Для определения аффинности антител к адромедуллину, определяли кинетики связывания адромедуллина с иммобилизованным антителом посредством поверхностного плазмонного резонанса без введения метки, используя систему Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany). Обратимую иммобилизацию антител осуществляли, используя анти-мышиное Fe антитело, ковалентно связанное с высокой плотностью с поверхностью СМ5 сенсора в соответствии с инструкциями производителя (набор для захвата мышиного антитела; GE Healthcare), (22).

В одном варианте осуществления изобретения указанное связующее выбирают из группы, включающей анти-адромедуллиновое антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или не-Ig матрицу, связывающуюся с адромедуллином.

Доведение до конца терапии означает, что, по меньшей мере, одну концентрацию ADM зрелого 1-52 (SEQ ID No. 4) и/или зрелого ADM 1-52-Gly (SEQ ID No. 5) определяют в образце, предпочтительно больше чем один раз, предпочтительно два раза или один раз в день после начала терапии.

В одном варианте осуществления изобретения он может быть так называемым POC-тестом (диагностика на месте), который представляет собой технологию тестирования, которая позволяет выполнение теста в пределах менее чем 1 час около пациента без требования полностью автоматизированной системы анализа. Одним из примеров данной технологии является иммунохроматографическая технология проведения теста.

В одном варианте осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич иммуноанализ, с использованием какого-либо вида технологии детектирования, включая, но, не ограничиваясь этим, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно полностью автоматизированный анализ. В одном варианте осуществления изобретения такой анализ представляет собой меченый ферментом сэндвич анализ. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые могут быть использованы для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®.

Разнообразные иммунологические анализы известны и могут быть использованы для анализов и способов представленного изобретения, они включают: радиоиммунологические анализы ("RIA"), гомогенные иммуноферментные анализы ("EMIT"), фермент-связанные иммуносорбентные исследования ("ELISA"), апоферментный реактивационный иммуноанализ ("ARIS"), иммуноанализы с индикаторными полосками и иммунно-хроматографические анализы.

В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, один из указанных двух связующих метят для того, чтобы их детектировать.

Предпочтительные способы детектирования включают иммуноанализы в различных форматах, таких как, например, радиоиммунологический анализ (RIA), хемилюминесцентные- и флуоресцентные-иммуноанализы, фермент-связанные иммуноанализы (ELISA), сферические матрицы на основе Luminex, белковые микроматричные анализы, и быстрые форматы исследований, такие как, например, иммунно-хроматографические тест-полоски.

В предпочтительном варианте осуществления указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку с радиоактивным йодом.

Анализы могут быть гомогенными или гетерогенными анализами, конкурентными и неконкурентными анализами. В одном варианте осуществления, анализ представлен в форме сэндвич анализа, который является неконкурентным иммуноанализом, в котором молекула, которую детектируют и/или количественно определяют, связывается с первым антителом и со вторым антителом. Первое антитело может быть связанным с твердой фазой, например, сферой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или полоской, и второе антитело представляет собой антитело, которое метят, например красителем, радиоактивным изотопом, или реакционно-способным, или каталитически активным фрагментом. Количество меченого антитела, связанного с анализируемым образцом, затем измеряют, используя соответствующий способ. Общий состав и процедуры, связанные с "сэндвич анализами" хорошо установлены и известны квалифицированному специалисту в данной области (23).

В другом варианте осуществления анализ включает две молекулы захвата, предпочтительно, антитела, которые оба присутствуют как дисперсии в жидкой реакционной смеси, в которой первый маркирующий компонент присоединяется к первой молекуле захвата, где указанный первый маркирующий компонент является частью маркирующей системы, основанной на флуоресцентном- или хемилюминесцентном гашении или усилении, и второй маркирующий компонент указанной маркирующей системы присоединяется ко второй молекуле захвата, таким образом, что при связывании обеих молекул захвата с анализируемым образцом измеряемый сигнал генерируется таким образом, что позволяет детектирование сформированных сэндвич-комплексов в растворе, содержащем образец.

В другом варианте осуществления, указанная маркирующая система содержит криптаты редкоземельных металлов или хелаты редкоземельных металлов в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности с красителем цианинового типа.

В контексте представленного изобретения, анализы, основанные на флуоресценции, включают использование красителей, которые, например, могут быть выбраны из группы, состоящей из FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеина), VIC, NED, флуоресцеина, флуоресцеинизотиоцианата (FITC), IRD-700/800, цианиновых красителей, таких как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), ΤΕΤ, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE), Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6С (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, BODIPY красителей, таких как BODIPY TMR, орегоновый зеленый, кумаринов, таких как умбеллиферон, бензимидов, таких как хехст 33258; фенантридинов, таких как техасский красный, якима желтый, Alexa Fluor, PET, бромистый этидий, акридиновых красителей, карбазольных красителей, феноксазиновых красителей, порфириновых красителей, полиметиновых красителей, и т.д.

В контексте представленного изобретения, анализы, основанные на хемилюминесценции, включают использование красителей, которые основаны на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в (24). Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.

Как упоминается в данном документе, "анализ" или "диагностический анализ" может быть какого-либо типа, применяемого в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании с анализируемым образцом, чтобы быть детектированным одним или больше зондами захвата с определенной аффинностью. Что касается взаимодействия между молекулами захвата и молекулами-мишенями, или молекулами, представляющими интерес, константа аффинности предпочтительно составляет больше, чем

В контексте представленного изобретения, "молекулы связующего вещества" представляют собой молекулы, которые могут быть использованы для связывания молекул-мишеней или молекул, представляющих интерес, то есть с анализируемыми образцами (то есть в контексте представленного изобретения РСТ и его фрагментов), из образца. Молекулы связующего вещества, таким образом, должны иметь соответствующую форму, как пространственную, так и с точки зрения особенностей поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, присутствие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, чтобы специфически связываться с молекулами-мишенями или молекулами, представляющими интерес. Таким образом, связывание, например, может быть опосредованным через взаимодействия ионной, ван-дер-Ваальсовской, пи-пи, сигма-пи, гидрофобной или водородной связи или комбинации из двух или больше упомянутых выше взаимодействий между молекулами захвата и молекулами-мишенями или молекулами, представляющими интерес. В контексте представленного изобретения, молекулы связующего вещества, например, могут быть выбраны из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, молекулы углевода, молекулы РНК, белка, антитела, пептида или гликобелка. Предпочтительно, молекулы связующего вещества представляют собой антитела, включая их фрагменты с достаточной аффинностью к мишени или молекуле, представляющей интерес, и включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученных из вариантной цепи с длиной, по меньшей мере, из их 12 аминокислот.

Хемилюминесцентная метка может быть меткой сложного эфира акридиния, стероидными метками, включающими изолюминольные метки и тому подобное.

Ферментные метки могут быть лактатдегидрогеназой (LDH), креатинкиназой (CPK), щелочной фосфатазой, аспартатаминотрансферазой (AST), аланинаминотрансферазой (ALT), кислой фосфатазой, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой и т.д.

В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, один из указанных двух связывающих веществ является связанным с твердой фазой, как магнитные частицы, и полистирольными поверхностями.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация зрелого ADM 1-52 и/или зрелого ADM 1-52-Gly, измеренная в образце плазмы или крови, находится в диапазоне 10-500 пг/мл.

Уровни ADM представленного изобретения определялись согласно описанному ADM анализу. Указанные выше значения могли быть отличающимися в других ADM анализах, в зависимости от их способа калибровки. Указанные выше значения соответственно должны применяться для таких по-разному откалиброванных ADM анализов, принимая во внимание различия в калибровке. ADM анализы могли быть откалиброваны согласно корреляции и корректированию посредством своих нормальных диапазонов (здоровое население). Альтернативно, коммерчески доступные контрольные образцы могли быть использованы для корректирования различных калибровок (ICI Diagnostics, Berlin, Germany). Согласно описанному ADM анализу определяли среднее значение нормальной совокупности, которое составляло 24,7 пг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения применяется пороговая чувствительность в соответствии, с чем значение выше пороговой чувствительности показывает, что пациент не реагирует или плохо реагирует на терапию, тогда как значение ниже указанной пороговой чувствительности показывает пациента, который реагирует на терапию.

В одном варианте осуществления изобретения применяется пороговая чувствительность от 60 до 80 пг/мл, предпочтительно 70 пг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения указанный образец выбирают из группы, включающей человеческую цитратную плазму, гепаринизированную плазму, ЭДТА плазму, цельную кровь.

В одном варианте осуществления изобретения взятый указанный образец непосредственно измеряют без какой-либо дополнительной подготовки образца.

В одном варианте осуществления изобретения указанный способ осуществляют на полностью автоматизированном приборе. Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®.

В одном варианте осуществления изобретения зрелый ADM 1-52 и/или зрелый ADM 1-52-Gly определяют, по меньшей мере, в двух образцах, где указанные образцы берут в различные моменты времени от указанных пациентов с сепсисом. Указанные образцы могут браться один раз в день в дни терапии. Такой диагностический режим может быть применен для другого биомаркера, который описывают, например (25) и также (26).

В одном варианте осуществления изобретения объем измеряемого образца составляет меньше или равно 50 мкл.

Способ in vitro для контролирования терапии у пациентов с сепсисом в соответствии с представленным изобретением может быть комбинированным с дополнительными клиническими и/или лабораторными параметрами и/или клиническими показателями, такими как, например, Apache 2 показатель, SOFA показатель, или другие, или одним или больше параметрами, содержащимися в пределах показателя. Изменяемые величины/параметры могут комбинировать постоянно или с перерывами, используя стандартные статистические способы.

Объектом изобретения, кроме того, является анализ для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце, который включает два связующих, которые связываются с двумя различными областями в пределах области зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly, который представляет собой аминокислотный 21-52-амид SEQ ID No. 1 или аминокислотный 21-52-Gly зрелого адромедуллина SEQ ID No. 2, где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот, и где указанный анализ не является выполняемым вручную сэндвич анализом с трубкой покрытой сложным эфиром акридиния.

Объектом изобретения, кроме того, является анализ для определения зрелого адромедуллина, и/или адромедуллина-Gly, и/или адромедуллина-Gly в образце, который включает два связующих, которые связываются с двумя различными областями в пределах области зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly, который представляет собой аминокислотный 21-52-амид SEQ ID No. 1 или аминокислотный 21-52-Gly зрелого адромедуллина SEQ ID No. 2, где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот, и где указанный анализ не является выполняемым вручную сэндвич анализом с трубкой покрытой сложным эфиром акридиния, и где одно из указанных связующих представляет собой антитело, которое связывается с SEQ ID No. 4, и где второе из указанных связующих представляет собой антитело, которое связывается с SEQ ID No. 7 (APRSKISPQGY-CO-NH2).

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретением одно из указанных связующих связывается с областью, содержащейся в следующей последовательности зрелого ADM:

CTVQKLAHQIYQ (SEQ ID No. 6)

и где указанное второе из данных связующих связывается с областью, содержащейся в следующей последовательности зрелого ADM:

APRSKISPQGY (SEQ ID No. 7)

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретением чувствительность анализа указанного анализа, которая способна быть количественно определенной ADM у здоровых субъектов, и составляет <10 пг/мл, предпочтительно <40 пг/мл и более предпочтительно <70 пг/мл.

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретением указанное связующее демонстрирует аффинность связывания с адромедуллином, по меньшей мере, 10⁷ Μ^-1, предпочтительно 10⁸ Μ^-1, предпочтительная константа аффинности составляет больше чем 10⁹ М^-1, наиболее предпочтительно - больше чем 10¹⁰ М^-1. Квалифицированный специалист в данной области с уровня техники знает, что может быть рассмотрено компенсирование более низкой аффинности путем применения более высокой дозы соединений и данное мероприятие не будет приводить к выходу за пределы объема изобретения. Аффинность связывания может быть определена, как описано выше.

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретением указанное связующее выбирают из группы, включающей анти-адромедуллиновое антитело или фрагмент анти-ADM антитела, которое связывается с ADM, или не-Ig матрицу, которая связывается с адромедуллином.

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретением такой анализ представляет собой сэндвич анализ, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ. Это может быть ELISA, полностью автоматизированный или выполняемый в ручную. Это может быть так называемый PCT-тест (диагностика на месте). Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые могут быть использованы для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®. Примеры форматов исследований приведены выше.

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретеним, по меньшей мере, один из указанных двух связующих является меченным, для того чтобы быть определенным. Примеры меток представлены выше.

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретением, по меньшей мере, один из указанных двух связующих является связанным с твердой фазой. Примеры твердых фаз представлены выше.

В одном варианте осуществления анализов для определения зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly в образце в соответствии с представленным изобретением указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку с радиоактивным йодом.

Следующим объектом представленного изобретения является набор, включающий анализ в соответствии с представленным изобретением, в котором компоненты указанного анализа могут содержаться в одном или больше контейнере.

Следующим объектом представленного изобретения является способ калибрования анализа в соответствии с представленным изобретением, в котором связующее, предпочтительно антитело, используют таким образом, что он связывается с областью, по меньшей мере, из 5 аминокислот в пределах аминокислот 1-16 (SEQ ID No. 8) зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly. Указанное связующее может быть антителом, или фрагментом антитела, или не-Ig матрицей, которая связывается с областью, по меньшей мере, из 5 аминокислот в пределах аминокислот 1-16 (SEQ ID No. 8) зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly.

В одном варианте осуществления способа калибрования анализа в соответствии с изобретением указанное N-терминальное антитело, или фрагмент, или матрица распознает и связывается с N-терминальным концом (aal) зрелого адромедуллина и/или адромедуллина-Gly. Данный способ в другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM-антитело или анти-адромедуллиновый фрагмент антитела или не-Ig матрица связывается только с областью в последовательности зрелого ADM, если N-терминальный конец ADM является свободным. В указанном варианте осуществления анти-ADM-антитело, или анти-адромедуллиновый фрагмент антитела, или не-Ig матрица не могли бы связываться с областью в последовательности зрелого ADM, если указанная последовательность является включенной в про-ADM.

Антитела, приемлемые для калибрования анализа в соответствии с изобретением, являются такими связующими, которые смягчают адсорбционные свойства ADM. Кроме того, такое связующее должно быть совместимым со связующими, используемыми в анализе детектирования, например, указанное связующее не должно препятствовать при связывании меченого связующего и твердофазного связующего в случае ELISA.

Представленные способы и анализы являются приемлемыми для рутинных применений. В большинстве случаев рутинные применения требуют того, что необходимый объем образца не должен превышать 50 мкл. Рутинное применение, кроме того, требует того, что предшествующая аналитическая обработка остается минимальной или является нулевой (использование рутинных образцов подобных ЭДТА плазме, цитратной плазме). Предварительные аналитические требования должны соответствовать клинической практике: минимальная стабильность анализируемого образца (>90% восстановление) должна быть при комнатной температуре, по меньшей мере, 2 часа.

Антитело в соответствии с представленным изобретением представляет собой белок, включающий один или больше полипептидов, в значительной степени кодированных иммуноглобулиновыми генами, которые специфически связывают антиген. Распознающие иммуноглобулиновые гены включают каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM) константные области генов, а также огромное количество вариабельных областей иммуноглобулиновых генов. Иммуноглобулиновые легкие цепи полной длины имеют, в основном, приблизительно 25 Кд или 214 аминокислот в длину. Иммуноглобулиновые тяжелые цепи полной длины имеют, в основном, приблизительно 50 Кд или 446 аминокислот в длину. Легкие цепи кодируются геном с вариабельной областью на NH₂-терминальном конце (приблизительно 110 аминокислот в длину) и каппа или лямбда ген с константной областью на COOH-терминальном конце. Тяжелые цепи кодируются, подобным образом, геном с вариабельной областью (приблизительно 116 аминокислот в длину) и одним из других генов с константной областью.

Основной структурной единицей антитела, как правило, является тетрамер, который состоит из двух идентичных пар иммуноглобулиновых цепей, где каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре, вариабельные области легкой и тяжелой цепи связываются с антигеном, и константные области являются посредниками эффекторных функций. Иммуноглобулины, кроме того, существуют в различных других формах, включая, например, Fv, Fab и (Fab')₂, а также бифункциональные гибридные антитела и единичные цепи ((27), (28), (29), (30), (31)). Вариабельная область иммуноглобулиновой легкой или тяжелой цепи включает структурную область, прерванную тремя гипервариабельными областями, также называемые области определения комплементарности (CDR) смотри (32). Как указано выше, CDR являются, прежде всего, ответственными за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело, или функциональный фрагмент антитела, специфически связанный с антигеном.

Химерные антитела представляют собой антитела, чьи гены с легкой и тяжелой цепью были сконструированными, как правило, путем генной инженерии, из иммуноглобулиновых генов с вариабельной и константной областями, которые принадлежат к различным видам. Например, вариабельные сегменты генов из мышиного моноклонального антитела могут быть связаны с человеческими константными сегментами, такими как каппа и гамма 1 или гамма 3. В одном примере, терапевтическое химерное антитело является, таким образом, гибридным белком, состоящим из вариабельного или антиген-связывающего домена из мышиного антитела и константного или эффекторного домена из человеческого антитела, хотя другие виды, относящиеся к млекопитающим, могут быть использованы, или вариабельная область может быть получена, путем использования молекулярных способов. Способы создания химерного антитела хорошо известны в данной области с уровня техники, например, смотри (33). "Гуманизированное" иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, который включает человеческую структурную область и один или больше CDR из нечеловеческого (такого как мышиного, крысиного или синтетического) иммуноглобулина. Нечеловеческий иммуноглобулин, обеспечивающий CDR, называется "донором" и человеческий иммуноглобулин, обеспечивающий структуру, называется "акцептором". В одном варианте осуществления, все CDR являются из донорного иммуноглобулина в гуманизированном иммуноглобулине. Не существует необходимости в присутствии константных областей, но если они присутствуют, они должны быть в значительной степени идентичными к константным областям человеческого иммуноглобулина, то есть, по меньшей мере, приблизительно 85-90%, такая как приблизительно 95% или больше идентичность. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением возможно CDR, являются в значительной степени идентичными соответствующим частям природных последовательностей человеческого иммуноглобулина. "Гуманизированное антитело" представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое обеспечивает CDR. Акцепторная структура гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество заместителей аминокислотами, взятыми из донорной структуры. Гуманизированные или другие моноклональные антитела может иметь дополнительные консервативные аминокислотные замещения, которые в значительной степени не оказывают влияния на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Иллюстративные консервативные замещения являются такими как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть сконструированы посредством генной инженерии (например, смотри (34)). Человеческое антитело представляет собой антитело, в котором гены с легкой и тяжелой цепью являются человеческого происхождения. Человеческие антитела могут быть сгенерированы, используя способы, используя способы, известные в данной области с уровня техники. Человеческие антитела могут быть получены путем иммортализации человеческой В клетки, секретирующей антитело, представляющей интерес. Иммортализации может быть осуществлена, например, путем EBV инфицирования или путем слияния человеческой В клетки с клеткой миеломы или гибридомы с получением триомной клетки. Человеческие антитела, кроме того, могут быть получены согласно способам фагового дисплея (смотри, например, (35), (36), (37), которые включены в данный документ в виде ссылки), или выбраны из комбинаторной библиотеки человеческого моноклонального антитела (смотри Morphosys website). Человеческие антитела, кроме того, могут быть получены путем использования трансгенных животных, несущих человеческий иммуноглобулиновый ген (например, смотри (38) и (39) которые включены в данный документ в виде ссылки).

Таким образом, ADM антитело может иметь форматы, известные в данной области с уровня техники. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела. В предпочтительном варианте осуществления антитела в соответствии с представленным изобретением представляют собой рекомбинантно полученные антитела как, например, IgG, типовый, полной длины иммуноглобулин или фрагмент антител, содержащий, по меньшей мере, F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи как, например, химически связанные антитела (связывание фрагмента антиг