Способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета

Способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета

Реферат

Изобретение относится к иммунологии, вирусологии, биотехнологии и лабораторной диагностике в медицине и может быть использовано для диагностики параметров врожденного иммунитета и при различных заболеваниях инфекционной (вирусной, бактериальной, грибковой) и неинфекционной (аллергической, аутоиммунной, онкологической) этиологии. Изобретение может быть также использовано для контроля активности и качества выпускаемых препаратов интерферона (ИФН), а также при скрининговых исследованиях индукторов образования ИФН различной химической природы.

Неспецифическая реактивность включает в себя систему интерферона (ИФН), состояние которой в основном характеризует врожденный иммунитет организма. В 60-80-х годах прошлого века был разработан микрометод, описанный как тестирование «интерферонового статуса» здоровых людей и пациентов с различными заболеваниями (Tilles J.G. 1968; Rubinstein S 1981; Kirchner H 1982; Doldi К 1985). Этот метод находится в постоянном усовершенствовании, т.к. актуальность в тестировании продукции ИФН клетками крови сохраняется до сегодняшних дней.

Внедрение в медицинскую практику иммуноактивных препаратов обуславливает изучение механизмов действия этих препаратов и предусматривает определение их влияния на процессы продукции ИФН. Углубленные исследования ИФН статуса с определением отвечаемости клеток крови на иммуноактивные препараты помогут определить тактику лечения при разных формах патологии и прогнозировать исход заболевания.

Методы количественного определения биологической активности иммуноактивных препаратов (препаратов ИФН и их индукторов, иммуномодуляторов, вакцин) и оценки ИФН статуса требуют дальнейшего поиска и усовершенствования этих методик, соответственно требованиям их стандартизации для возможности использования в оказании медико-лабораторных услуг населению.

В существующих методах постановки ИФН статуса используются дорогостоящие чувствительные к ИФН клеточные культуры фибробластов (ФЛЭЧ, ЛЭЧ, ФЭЧ, М-19, М-22 и др.). Запасы этих культур остались не во всех музеях клеток, а пассажи начинаются только с 20 или 30-го. К сожалению, пригодный рабочий потенциал культуры клеток фибробластов эмбриона человека составляет ограниченное (6-14) количество пассажей. Для введения этих культур требуются питательные среды с добавлением высококачественной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Так как качество ЭТС варьируется от партии к партии, существует постоянная потенциальная возможность контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями и др., что делает невозможным стандартизировать процесс введения клеточных культур.

Известно решение по патенту RU 2518295, опубл. 10.06.2014: IL-1бета-связывающие антитела и их фрагменты.

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено IL-1β-связывающее антитело или его IL-1β-связывающий фрагмент, включающее вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи. Указанное антитело связывается с IL-1β человека с константой диссоциации менее 1 пМ. Описаны варианты антитела. Раскрыты соответствующие кодирующие нуклеиновые кислоты (НК), а также: вектор для переноса НК в клетку-хозяина, клетка-хозяин для продуцирования кодируемого полипептида. Описано применение антитела для получения других форматов указанного антитела: «верблюдизированного», «VHH-содержащего антитела», «нанотела». Раскрыта фармацевтическая композиция для лечения или профилактики связанного с IL-1β заболевания или состояния у млекопитающего на основе антитела, а также способ лечения или профилактики связанного с IL-1β заболевания или состояния у млекопитающего. Использование изобретения обеспечивает новые антитела, специфичные к IL-1β, с повышенной аффинностью к IL-1β, что может найти применение в медицине для профилактитки, лечения заболеваний, опосредованных активностью к IL-1β.

Изобретение дополнительно относится к клетке (например, выделенной или очищенной клетке), содержащей нуклеиновую кислоту или вектор настоящего изобретения. Данная клетка может представлять собой клетку любого типа, способную трансформироваться нуклеиновой кислотой или вектором настоящего изобретения таким образом, чтобы она могла продуцировать кодируемый ими полипептид. Данная клетка предпочтительно является клеткой млекопитающего, такого как человек, и более предпочтительно является клеткой гибридомы, эмбриональной стволовой клеткой или оплодотворенной яйцеклеткой.

Сайт инициации репликации выбирают на основе типа клетки-хозяина, используемой для экспрессии. В качестве примера, сайт инициации репликации из плазмиды pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass) применим для большинства грамотрицательных бактерий, тогда как различные сайты инициации репликации из SV40, полиомавируса, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (VSV) или папилломавирусов (таких как HPV или BPV) могут быть использованы для клонирования векторов в клетках млекопитающих.

Наиболее близким аналогом является решение по патенту RU 2335535, C12N 1/21, опубл. 10.10.2008, бюл. №28, в котором описан способ приготовления композиций активного цитокина-интерферона-гамма, ускоряющим иммунную реакцию. В способе использовали клетки бычьей почки, инфицированные вирусом VSV. Клетки Pseudomonas использовали как биофабрику для производства IFN-γ, способную продуцировать до 40% или больше интерферона от общего клеточного белка. Технической проблемой прототипа и иных известных способов является использование дорогостоящей культуры клеток фибробластов эмбриона человека с ограниченной способностью к пассированию.

Задачей изобретения является замена культуры клеток и усовершенствование самой методики до возможности использования в массовых исследованиях.

Технический результат: полная замена прикрепляемой культуры клеток фибробластов эмбриона человека (ФЛЭЧ, ЛЭЧ, ФЭЧ, М-19, М-22 и др.), требующей обязательного присутствия эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), на адаптированную бессывороточную линию клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero). Техническим результатом использования заявленного способа также является возможность проверить состояние неспецифической реактивности организма до иммунокоррекции; проводить научно обоснованную тактику персонифицированного применения в клинической практике иммуноактивных препаратов, таких как индукторы интерферонов, иммуномодуляторы; контролировать состояние врожденного иммунитета в динамике иммунокоррекции.

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета, характеризующийся использованием культуры клеток млекопитающего, чувствительной к интерферону, инфицированной вирусом везикулярного стоматита VSV, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток млекопитающего используют культуру клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero), производят количественное определение продукции интерферонов I и II типов, основанное на оценке 50% защиты монослоя бессывороточной линии клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero) от индуцированного тест-вирусом везикулярного стоматита (VSV) цитодеструктивного эффекта, способ характеризуется введением проб индивидуума в лунки с чувствительной к ИФН клеточной культуре Vero и последующей обработкой тест-вирусом VSV.

Для определения ИФН-продуцирующей способности лейкоцитов асептически берут кровь из локтевой вены в стерильную пробирку с гепарином.

Для синтеза ИФН I и II типа в 160 мкл среды RPMI-1640 вносят 20 мкл NDV (в дозе 10⁸ EID₅₀ в 1 мл аллантоисной жидкости) и в 160 мкл среды RPMI-1640 вносят 20 мкл ФГА (в концентрации 100 мкг/мл) соответственно, затем во все лунки добавляют по 20 мкл цельной гепаринизированной крови, а содержимое каждой лунки перемешивают; планшеты инкубируют в термостате при 37°C 24-48 ч в атмосфере 5% CO₂; после инкубации супернатанты отбирают в стерильные планшеты, а оставшуюся кровь центрифугируют для получения сывороточного ИФН; отобранные супернатанты и сыворотку/плазму крови хранят в холодильнике до этапа титрования.

Определение функциональной активности ИФН проводят путем титрования в луночных плоскодонных планшетах на монослое клеток Vero, в первую лунку ряда вносят 100 мкл образца/супернатанта с последующими 2-кратными разведениями, для ИФН I типа первое разведение 1 к 10.

Условием теста определения ИФН статуса является постановка контроля дозы вируса (положительный контроль) и контроля клеток (отрицательный контроль).

В качестве индикаторного тест-вируса используют вирус VSV, который в день титрования проб 10-кратно титруется для подтверждения активности и выявления рабочего титра. Исходя из полученного результата титрования тест-вируса, готовят разведение вируса в требуемом объеме, содержащем 1-10 ЦПД (цитопатогенных доз), при этом по 100 мкл рабочего разведения вируса добавляют в каждую лунку планшета, кроме контроля клеток, и еще раз ставят контроль дозы вируса; на следующие сутки при положительном контроле дозы вируса проводят визуальный учет результатов по ЦПД тест-вируса, используя инвертированный микроскоп; за титр ИФН принимают его максимальное разведение, в котором наблюдается 50% защита клеток монослоя от цитопатогенного действия тест-вируса.

За средние показатели ИФН в норме у взрослых определяют значения для ИФН I типа от 640 Ед/мл, ИФН II типа - от 64 Ед/мл, сывороточного ИФН<2-8 Ед/мл, а у детей до 1 года повышенные значения уровня ИФН в сыворотке крови считают физиологической возрастной нормой, а также 2-кратно сниженные показатели продукции ИФН I/II типов по сравнению с показателями нормы взрослых.

Постановку реакции отвечаемости лейкоцитов к иммуноактивным препаратам проводят аналогично описанному способу определения продукции ИФН, только на этапе предобработки в 140 мкл RPMI-1640 дополнительно вносят 20 мкл препарата в концентрации, подобранной опытным путем; посредством эмпирического скрининга подбора разведений препаратов от 100 до 10000 раз определяют рабочий диапазон разведения каждого препарата; оценку действия препарата in vitro проводят в сравнении с величиной ИФН I или II типа, и по этому сравнению судят об отвечаемости лейкоцитов крови человека и проводят эффективный выбор для профилактики и лечения.

Осуществление изобретения

Для определения ИФН-продуцирующей способности лейкоцитов асептически берется кровь из локтевой вены в стерильную пробирку с гепарином.

Пробоподготовка проводится с использованием стерильных 96-луночных круглодонных планшетах.

Для синтеза ИФН I и II типа в 160 мкл среды RPMI-1640 вносится 20 мкл NDV (в дозе 10⁸ EID₅₀ в 1 мл аллантоисной жидкости) и в 160 мкл среды RPMI-1640 вносится 20 мкл ФГА (в концентрации 100 мкг/мл) соответственно. Затем во все лунки добавляется по 20 мкл цельной гепаринизированной крови. Содержимое каждой лунки хорошо перемешивается. Планшеты инкубируются в термостате при 37°C 24-48 ч в атмосфере 5% CO₂. После инкубации супернатанты отбираются в стерильные планшеты. Оставшаяся кровь центрифугируется для получения сывороточного ИФН. Отобранные супернатанты и сыворотка/плазма крови хранятся в холодильнике до этапа титрования.

Определение функциональной активности ИФН проводится путем титрования в 96-луночных плоскодонных планшетах на монослое клеток Vero. В первую лунку ряда вносят 100 мкл образца/супернатанта с последующими 2-кратными разведениями. Для ИФН I типа первое разведение 1 к 10.

Обязательным условием теста определения ИФН статуса является постановка контроля дозы вируса (положительный контроль) и контроля клеток (отрицательный контроль). В качестве индикаторного тест-вируса используется вирус VSV, который в день титрования проб 10-кратно титруется для подтверждения активности и выявления рабочего титра. Исходя из полученного результата титрования тест-вируса, готовится разведение вируса в требуемом объеме, содержащем 1-10 ЦПД (цитопатогенных доз). По 100 мкл рабочего разведения вируса добавляется в каждую лунку планшета, кроме контроля клеток, и еще раз ставится контроль дозы вируса. На следующие сутки при положительном контроле дозы вируса проводится визуальный учет результатов по ЦПД тест-вируса, используя инвертированный микроскоп. При проведении массовых исследований возможна спектрофотометрическая оценка результатов после окрашивания. За титр ИФН принимается его максимальное разведение, в котором наблюдается 50% защита клеток монослоя от цитопатогенного действия тест-вируса.

Показатели нормы продукции ИФН

За средние показатели ИФН в норме у взрослых определены значения для ИФН I типа от 640 Ед/мл, ИФН II типа - от 64 Ед/мл, сывороточного ИФН<2-8 Ед/мл. В отношении детей до 1 года следует отметить повышенные значения уровня ИФН в сыворотке крови, что является физиологической возрастной нормой, а также 2-кратно сниженные показатели продукции ИФН I/II типов по сравнению с показателями нормы взрослых.

Определение индивидуальной отвечаемости клеток к препаратам

Внедрение в медицинскую практику иммуноактивных препаратов обуславливает изучение механизмов действия этих препаратов и предусматривает определение их влияния на процессы продукции ИФН лейкоцитами крови человека.

Поэтому дополнением к определению продукции ИФН является разработанный метод определения индивидуальной отвечаемости клеток крови конкретного пациента к иммуноактивным препаратам. Отвечаемость клеток оценивают по нарастанию титров ИФН I или II типов после воздействия указанных препаратов на лейкоциты периферической крови in vitro. Клиническое наблюдение и лабораторное исследование продукции ИФН в динамике помогут оценить правильность тактики лечения и прогнозировать исход заболевания.

Постановка реакции отвечаемости лейкоцитов к иммуноактивным препаратам проводится аналогично описанному способу определения продукции ИФН, только на этапе предобработки в 140 мкл RPMI-1640 дополнительно вносится 20 мкл препарата в концентрации, подобранной опытным путем. Эмпирический скрининг подбора разведений препаратов, проведенный нами, от 100 до 10000 раз, позволил определить рабочий диапазон разведения каждого препарата. Оценка действия препарата in vitro проводится в сравнении с величиной ИФН I или II типа, что позволяет судить об отвечаемости лейкоцитов крови человека и проводить эффективный выбор для профилактики и лечения. К иммуноактивным препаратам относятся препараты интерферона: -альфа: Виферон, Гриппферон, Интрон, Реальдирон, Реаферон, Роферон и др.; -бета: Бетаферон, Генфаксон, Ребиф, Ронбетал, Синновекс и др.; -гамма: Ингарон. Все эти препараты ИФН используются для ограниченного количества показаний по описанным в инструкциях схемах: вирусные гепатиты, лимфомы, хронический грануломатоз, рассеянный склероз, саркома Калоши, генитальные кондиломы и др. Это все тяжелые хронические и рецидивирующие заболевания вирусной, онкогенной и аутоиммунной природы, при которых в больших клинических исследованиях доказана терапевтическая эффективность длительного поддержания уровня ИФН в организме. В отношении препаратов ИФН следует отметить, что в реакции in vitro с клетками крови человека на них всегда имеется высокая отвечаемость клеток, поэтому нет необходимости в постановке реакции отвечаемости на эти препараты и их назначение идет по клиническим показаниям.

Индукторы ИФН: аллокин-альфа, амиксин, кагоцел, неовир, ридостин, циклоферон и др. Иммуномодуляторы: арбидол, галавит, глутоксим, изопринозин, иммунал, иммуномакс, имунорикс, имунофан, ликопид, панавир, полиоксидоний, тактивин, тимоген и др.

Следует отметить, что к иммуноактивным препаратам (индукторам ИФН, иммуномодуляторам) имеется разная отвечаемость клеток периферической крови. Оценка выявленных изменений может служить ориентиром в диагностике, лечении и прогнозе заболеваний как вирусной, так и невирусной этиологии.

Показания, при которых необходимо исследование продукции ИФН:

- вирусные инфекции: острые и хронические формы;

- аллергические и аутоиммунные заболевания;

- рецидивирующие оппортунистические инфекции;

- часто болеющие дети;

- врожденные и приобретенные дефекты системы ИФН;

- клинические испытания препаратов ИФН, индукторов ИФН и иммуномодуляторов;

- клиническое применение вышеназванных препаратов и оценка эффективности терапии;

- разработка индивидуальных схем лечения препаратами ИФН, его индукторами и другими иммуноактивными препаратами.

Снижение продукции ИФН I и II типов, которое может быть и причиной, и следствием острых и хронических инфекционных (вирусных, бактериальных, грибковых) и неинфекционных (аллергических, аутоиммунных) заболеваний, свидетельствует о врожденном или приобретенном дефиците/недостаточности системы ИФН. Следует заметить, что результаты исследования продукции ИФН необходимо рассматривать в комплексе с остальными лабораторными и клинико-анамнестическими данными. Исследование параметров продукции ИФН используют для подбора и оценки эффективности терапии при использовании препаратов экзогенного ИФН, индукторов ИФН и иммуномодуляторов. По мнению Хаитова P.M. (2003), основным критерием для назначения препаратов иммуномодуляторов является клиническая картина заболевания, проявляющаяся хроническим инфекционно-воспалительным процессом, трудно поддающимся адекватному антиинфекционному лечению. Это положение можно отметить для всех иммуноактивных препаратов.

В результате многочисленных дублирований постановки ИФН статуса на разных культурах клеток нами было выявлено, что показатели продукции ИФН были одинаковыми как на культуре клеток фибробластов эмбриона человека, так и на культуре клеток почки зеленой мартышки Vero, культивируемой на сывороточных и бессывороточных питательных средах. Нами предложена эпителиальная культура клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, адаптированная к бессывороточной питательной среде. Преимущество использования этой культуры очевидно. Бессывороточные среды упрощают очистку и дальнейшую работу с клетками, позволяют точно оценивать клеточные функции (все процессы обусловлены свойствами клеток, а не побочными эффектами сыворотки), повышают воспроизводимость результатов. Это дает возможность стандартизировать процесс ведения клеточной культуры, снизить себестоимость. И так как Vero, в отличие от других клеточных культур, не продуцирует свой эндогенный ИФН, то в самой постановке не требуется этапа инактивации вируса NDV, что существенно сокращает время реакции.

Выявленная чувствительность клеток Vero, культивируемых на бессывороточных средах, к ИФН I и II типов, сохраняется при неограниченной способности к пассированию. Нами предложена замена дорогостоящей линии клеток фибробластов эмбриона человека на близкородственную культуру клеток Vero (почки зеленой африканской мартышки), адаптированной к бессывороточной питательной среде.

Благодаря использованию бессывороточной клеточной культуры с неограниченным количеством пассажей, становится возможным разрешить проблему стандартизации условий ведения культуры клеток, повысить воспроизводимость результатов. Так как клетки Vero не вырабатывают свой эндогенный ИФН, то это дает возможность существенного сокращения сроков проведения метода, за счет выпадения этапа инактивации вируса NDV.

Нами подобрана оптимально-адекватная доза индикаторного тест-вируса 1-10 ЦПД для выявления низких титров продукции ИФН лейкоцитами крови человека, в отличие от 100 ЦПД, заявленных в других методиках. Доза 100 ТЦД₅₀ обычно используется для выявления противовирусной активности высокодозных препаратов ИФН (более 1 млн МЕ/мл). Нами определены рабочие диапазоны дозы каждого препарата путем эмпирического скрининга подбора разведений.

Заявленный способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета является важным критерием состояния организма в норме и при различных заболеваниях инфекционной (вирусной, бактериальной, грибковой) и неинфекционной (аллергической, аутоиммунной, онкологической) этиологии; дает возможность использования в оказании медико-лабораторных услуг населению, сокращая сроки исследования.

К тому же, заявленное нами изобретение может быть использовано для контроля активности и качества выпускаемых препаратов ИФН, а также при скрининговых исследованиях индукторов образования ИФН различной химической природы. В отличие от предыдущих методов впервые предложена замена дорогостоящей культуры клеток фибробластов эмбриона человека на менее затратную, с неограниченной способностью к пассированию, культуру клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero), адаптированную к бессывороточной питательной среде. Это позволяет стандартизировать процесс ведения культуры и дает возможность применения метода в оказании массовых медико-лабораторных услуг населению.

Исследование продукции интерферона в комплексе с другими лабораторными и клинико-анамнестическими данными помогут оценить правильность тактики лечения и прогнозировать исход заболевания.

1. Способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета, характеризующийся использованием культуры клеток млекопитающего, чувствительной к ИФН, инфицированных вирусом VSV, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток млекопитающего используют культуру клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero), производят количественное определение продукции интерферонов I и II типов, характеризующийся введением проб индивидуума в лунки с чувствительной к ИФН клеточной культуре Vero и последующей обработкой тест-вирусом VSV, основанное на оценке 50% защиты монослоя бессывороточной линии клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero) от индуцированного тест-вирусом везикулярного стоматита (VSV) цитодеструктивного эффекта.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для определения ИФН-продуцирующей способности лейкоцитов асептически берут кровь из локтевой вены в стерильную пробирку с гепарином.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для синтеза ИФН I и II типа в 160 мкл среды RPM1-1640 вносят 20 мкл NDV (в дозе 10⁸ EID₅₀ в 1 мл аллантоисной жидкости) и в 160 мкл среды RPMI-1640 вносят 20 мкл ФГА (в концентрации 100 мкг/мл) соответственно, затем во все лунки добавляют по 20 мкл цельной гепаринизированной крови, а содержимое каждой лунки перемешивают; планшеты инкубируют в термостате при 37°С 24-48 ч в атмосфере 5% CO₂; после инкубации супернатанты отбирают в стерильные планшеты, а оставшуюся кровь центрифугируют для получения сывороточного ИФН; отобранные супернатанты и сыворотку/плазму крови хранят в холодильнике до этапа титрования.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение функциональной активности ИФН проводят путем титрования в луночных плоскодонных планшетах на монослое клеток Vero, в первую лунку ряда вносят 100 мкл образца/супернатанта с последующими 2-кратными разведениями, для ИФН I типа первое разведение 1 к 10.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что условием теста определения ИФН статуса является постановка контроля дозы вируса (положительный контроль) и контроля клеток (отрицательный контроль).

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве индикаторного тест-вируса используют вирус VSV, который в день титрования проб 10-кратно титруется для подтверждения активности и выявления рабочего титра; исходя из полученного результата титрования тест-вируса готовят разведение вируса в требуемом объеме, содержащем 1-10 ЦПД (цитопатогенных доз), при этом по 100 мкл рабочего разведения вируса добавляют в каждую лунку планшета, кроме контроля клеток, и еще раз ставят контроль дозы вируса; на следующие сутки при положительном контроле дозы вируса проводят визуальный учет результатов по ЦПД тест-вируса, используя инвертированный микроскоп; за титр ИФН принимают его максимальное разведение, в котором наблюдается 50% защита клеток монослоя от цитопатогенного действия тест-вируса.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что за средние показатели ИФН в норме у взрослых определяют значения для ИФН I типа от 640 Ед/мл, ИФН II типа - от 64 Ед/мл, сывороточного ИФН <2-8 Ед/мл, а у детей до 1 года повышенные значения уровня ИФН в сыворотке крови считают физиологической возрастной нормой, а также 2-кратно сниженные показатели продукции ИФН I/II типов по сравнению с показателями нормы взрослых.

8. Способ по п. 4, отличающийся тем, что постановку реакции отвечаемости лейкоцитов к иммуноактивным препаратам проводят на этапе предобработки в 140 мкл RPMI-1640 дополнительным внесением 20 мкл препарата в концентрации, подобранной опытным путем; посредством эмпирического скрининга подбора разведений препаратов от 100 до 10000 раз определяют рабочий диапазон разведения каждого препарата; оценку действия препарата in vitro проводят в сравнении с величиной ИФН I или II типа, и по этому сравнению судят об отвечаемости лейкоцитов крови человека и проводят эффективный выбор для профилактики и лечения.