Применение липохитоолигосахаридов и/или хитоолигосахаридов в комбинации с микроорганизмами, придающими растворимость фосфатам, для усиления роста растений

Применение липохитоолигосахаридов и/или хитоолигосахаридов в комбинации с микроорганизмами, придающими растворимость фосфатам, для усиления роста растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники в области изобретения

[0001] Симбиоз между грамотрицательными почвенными бактериями, Rhizobiaceae и Bradyrhizobiaceae, и бобовыми, такими как соя, хорошо документирован. Биохимическая основа для данных взаимосвязей включает обмен в молекулярной передаче сигнала, где сигнальные соединения в комбинации от растения к бактериям включают флавоны, изофлавоны и флаваноны, и сигнальные соединения в комбинации от бактерий к растению, которые, включают конечные продукты экспрессии Bradyrhizobial и Rhizobial nod-генов, известные как липохитоолигосахариды (LCOs). Симбиоз между данными бактериями и бобовыми предоставляет возможность бобовому растению фиксировать атмосферный азот для роста растения, таким образом устраняется потребность в азотных удобрениях. Так как азотные удобрения могут значительно повышать себестоимость сельскохозяйственных культур и связаны с рядом загрязняющих эффектов, сельское хозяйство продолжает свои попытки использовать данную биологическую взаимосвязь и разрабатывает новые средства и способы для повышения урожая растений без увеличения применения азотсодержащих удобрений.

[0002] Патент США 6979664 заявляет способ повышения прорастания семенного материала или появления всходов растительной сельскохозяйственной культуры, включающий стадию предоставления композиции, которая содержит эффективное количество по меньшей мере одного липохитоолигосахарида и носитель, подходящий для сельскохозяйственных целей, и стадию применения композиции в непосредственной близости от семенного материала или сеянца в эффективном количестве для повышения прорастания семенного материала или появления всходов в сравнении с необработанным семенем или сеянцем.

[0003] Дальнейшее развитие данной концепции заявлено в документе WО 2005/062899, направленном на комбинации из по меньшей мере одного индуктора растений, а именно LCO, в комбинации с фунгицидом, инсектицидом, или на их комбинацию, для повышения характеристик растения, таких как густота стояния растений, рост, мощность и/или урожай. Композиции и способы, как заявлено, предназначены для применения как для бобовых так и для не бобовых растений, и могут быть использованы для обработки семенного материала (непосредственно до посева), сеянца, корня или растения.

[0004] Аналогично, WO 2008/085958 заявляет композиции для повышения роста растений и урожая сельскохозяйственных культур, как бобовых так и не бобовых, которые содержат LCOs в комбинации с другим активным средством, таким как хитин или хитозан, флавоноидное соединение, или гербицид, и которые можно применять по отношению к семенам и/или растениям сопутствующим образом или последовательно. Как в случае с публикацией 899, публикация 958 заявляет обработку семян непосредственно перед посевом.

[0005] Совсем недавно, Halford, “Smoke Signals,” в Chem. Eng. News (April 12, 2019), at pages 37-38, сообщает, что каррикины или бутенолиды, которые содержатся в дыме, действуют как стимуляторы и содействуют прорастанию семян после лесного пожара и могут придавать силу семенам, таким как семена кукурузы, томатов, латука и видов лука, которые подлежали хранению. Данные молекулы представляют собой предмет патента США 7576213.

[0006] Для того чтобы сохранить здоровый рост, растения также должны экстрагировать множество элементов из почвы, на которой они растут. Данные элементы включают фосфор и так называемые питательные микроэлементы (например, медь, железо и цинк), но многие почвы лишены таких элементов или они содержат их только в формах, которые не могут легко поглощаться растениями (обычно считается, что важные элементы не могут легко поглощаться растениями, если только они не присутствуют в растворенной форме в почве).

[0007] Для преодоления таких недостатков обычно в почву вносят источники дефицитных элементов, чтобы повышать скорости роста и урожаи, получаемые от сельскохозяйственных растений. Например, фосфаты часто добавляют в почву для преодоления недостатка доступного фосфора. Фосфат, добавленный в почву в виде коммерческого удобрения (например, фосфат моноаммония или тройной суперфосфат), является легко доступным для растения, но быстро превращается в почве в относительно недоступные формы. Было показано, что только 10-30% фосфатного удобрения используется растением в год его применения, и от одной трети до половины примененного фосфатного удобрения никогда не могут быть использованы растением.

[0008] Патент США 5026417 описывает выделенный штамм Penicillium bilaiae, который способен повышать поглощение фосфора растениями при применении к почве.

[0009] Однако существует потребность в системах для повышения или усиления роста растений.

Краткая сущность изобретения

[0010] Первый аспект настоящего изобретения относится к упаковке, содержащей первый контейнер и второй контейнер, в которой первый контейнер содержит по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, и первый носитель, приемлемый для агрономических целей, и в которой второй контейнер содержит по меньшей мере один липохитоолигосахарид (LCO) и/или по меньшей мере один хитоолигосахарид (CO) и второй носитель, приемлемый для агрономических целей, где первый и второй носители, приемлемые для агрономических целей, могут быть одинаковыми или разными, и где по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, и по меньшей мере один LCO и/или по меньшей мере один CO, каждый из них, присутствуют в первом и втором контейнерах соответственно в количестве, эффективном для усиления роста растения при применении на растение или его семенной материал при сравнении с необработанным растением или его семенным материалом. Как он используется в настоящем описании, термин “необработанный” относится к семенам или растениям, которые не обработаны любым из активных компонентов (т.е., микроорганизмом, придающим растворимость фосфатам, а также посредством LCO или CO).

[0011] Другой аспект настоящего изобретения относится к упаковке, содержащей первый контейнер и второй контейнер, в которой первый контейнер содержит по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, при этом представляющий собой штамм грибка Penicillium, и первый носитель, приемлемый для агрономических целей, и в которой второй контейнер содержит по меньшей мере один липохитоолигосахарид (LCO) и/или по меньшей мере один хитоолигосахарид (CO) и второй носитель, приемлемый для агрономических целей, где первый и второй носители, приемлемые для агрономических целей, могут быть одинаковыми или разными, и где по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, и по меньшей мере один LCO и/или по меньшей мере один CO, каждый из них, присутствуют в первом и втором контейнерах соответственно в количестве, эффективном для усиления роста растения при применении на растение или его семенной материал при сравнении с необработанным растением или его семенным материалом.

[0012] Другой аспект настоящего изобретения относится к агрономической композиции для обработки растения или его семенного материала, содержащей (а) по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, и (b) по меньшей мере один липохитоолигосахарид (LCO) и/или по меньшей мере один хитоолигосахарид (CO), каждый из них, присутствуют в количестве, эффективном для усиления роста растения при применении на растение или его семенной материал при сравнении с необработанным растением или его семенным материалом.

[0013] Родственный аспект настоящего изобретения относится к агрономической композиции для обработки растения или его семенного материала, содержащей (а) по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, при этом представляющий собой штамм грибка Penicillium, и (b) по меньшей мере один LCO и/или по меньшей мере один CO, и (с) носитель, приемлемый для агрономических целей, в которой по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, и по меньшей мере один LCO и/или по меньшей мере один CO, каждый из них, присутствуют в количестве, эффективном для усиления роста растения при применении на растение или его семенной материал при сравнении с необработанным растением или его семенным материалом.

[0014] Другой родственный аспект настоящего изобретения относится к семенному материалу растения, обработанному с помощью (например, с покрытием или расположением на нем) (а) по меньшей мере одного микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, и (b) по меньшей мере одного LCO и/или по меньшей мере одного CO, каждого из них, в количестве, эффективном для усиления роста растения при применении на семенной материал при сравнении с необработанным семенным материалом. Микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, и LCO и/или CO могут применяться на семенном материале с помощью одинаковых или различных композиций. Также предложены упаковки, содержащие семенной материал растений.

[0015] Родственный аспект настоящего изобретения относится к семенному материалу растения, обработанному с помощью (например, с покрытием или расположением на нем) (а) по меньшей мере одного микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, при этом представляющего собой штамм грибка Penicillium, и (b) с помощью по меньшей мере одного LCO и/или по меньшей мере одного CO, каждого из них, в количестве, эффективном для усиления роста растения при применении на семенной материал при сравнении с необработанным семенным материалом. Микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, и LCO и/или CO могут применяться на семенном материале с помощью одинаковых или различных композиций. Также предложены упаковки, содержащие семенной материал растений.

[0016] Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу усиления роста растения, включающему а) обработку (например, нанесение на семя) семенного материала растения эффективным количеством по меньшей мере одного микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, и b) обработку семенного материала или обработку (например, нанесение на растение) растения, которое прорастает из семенного материала, эффективным количеством по меньшей мере одного LCO и/или по меньшей мере одного CO, где при уборке урожая растение проявляет по меньшей мере один из повышенных выходов растительного продукта, измеренный в терминах, таких как бушели/акр, повышенное число корней, повышенная длина корней, повышенная масса корней, повышенный объем корней, повышенная площадь листьев по сравнению с необработанными растениями или растениями, собранными как урожай от необработанного семенного материала.

[0017] Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу усиления роста растения, включающему а) обработку (например, нанесение на семенной материал) семенного материала растения эффективным количеством по меньшей мере одного микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, при этом представляющего собой штамм грибка Penicillium, и b) обработку семенного материала или обработку (например, нанесение на растение) растения, которое прорастает из семени, эффективным количеством по меньшей мере одного LCO и/или по меньшей мере одного CO, где при уборке урожая растение проявляет по меньшей мере один из повышенных выходов растительного продукта, измеренный в терминах, таких как бушель/акр, повышенное число корней, повышенная длина корней, повышенная масса корней, повышенный объем корней, повышенная площадь листьев по сравнению с необработанными растениями или растениями, собранными как урожай от необработанного семенного материала.

[0018] В некоторых вариантах осуществления, обработка семенного материала включает прямое нанесение по меньшей мере одного микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, и по меньшей мере одного LCO и/или по меньшей мере одного CO, (собирательно “активные компоненты”) на семенной материал, который затем можно сажать или можно хранить в течение периода времени перед посевом. Обработка семенного материала может также включать непрямую обработку, такую как через введение активных компонентов в почву (известное в данной области как внесение в борозды). Активные компоненты можно использовать вместе в одной композиции или можно готовить как препараты в отдельных композициях для сопутствующей или последовательной обработки. В еще других вариантах осуществления, по меньшей мере один LCO и/или по меньшей мере один CO, можно применять к растению, которое прорастает из семени, и по меньшей мере один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, применяют к семенному материалу, прямо или косвенно. В некоторых вариантах осуществления, семенной материал обрабатывают одним из активных компонентов и затем хранят, и другой активный компонент используют для обработки семенного материала во время посева. В еще других вариантах осуществления семя обрабатывают по меньшей мере одним микроорганизмом, придающим растворимость фосфатам, и затем хранят, и растение, которое прорастает из семени, обрабатывают по меньшей мере одним LCO и/или по меньшей мере одним CO. Композиции и способы могут еще включать применение других растительных сигнальных молекул и/или других средств, полезных для агрономических целей.

[0019] Способ настоящего изобретения применим к бобовым и также не бобовым растениям. В некоторых вариантах осуществления, семенной материал бобовых растений представляет собой семенной материал сои. В некоторых вариантах осуществления, семенной материал, который обрабатывают, является семенным материалом не бобового растения, а именно, семенным материалом полевой культуры, например, зерновой культуры, такой как кукуруза, или семенным материалом овощной культуры, такой как картофель.

Краткое описание чертежей

[0020] Фигуры 1 и 2 показывают химические структуры липохитоолигосахаридных соединений (LCO), примененных в практической реализации настоящего изобретения.

Подробное описание

[0021] Как он используется в настоящем описании, “микроорганизм, придающий растворимость фосфатам”, представляет собой микроорганизм, который способен повышать количество фосфора, доступного для растения. Микроорганизмы, придающие растворимость фосфатам, включают грибные и бактериальные штаммы. В варианте осуществления, микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, является спорообразующим микроорганизмом.

[0022] Неограничивающие примеры микроорганизмов, придающих растворимость фосфатам, включают виды рода, выбранного из группы, состоящей из Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida, Chryseomonas, Enterobacter, Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter и Xanthomonas.

[0023] Неограничивающие примеры микроорганизмов, придающих растворимость фосфатам, выбраны из группы, включающей Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter sp., Arthrobacter sp., Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter sp., Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, Exiguobacterium sp., Klebsiella sp., Kluyvera cryocrescens, Microbacterium sp., Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces sp., Streptosporangium sp., Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis и Xanthomonas campestris.

[0024] В конкретном варианте осуществления, микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, представляет собой штамм грибка Penicillium. Штаммы грибка Penicillium, которые могут быть применимыми при практической реализации настоящего изобретения, включают P. bilaiae (ранее известный как P. bilaii), P. albidum, P. aurantiogriseum, P. chrysogenum, P. citreonigrum, P. citrinum, P. digitatum, P. frequentas, P. fuscum, P. gaestrivorus, P. glabrum, P. griseofulvum, P. implicatum, P. janthinellum, P. lilacinum, P. minioluteum, P. montanense, P. nigricans, P. oxalicum, P. pinetorum, P. pinophilum, P. purpurogenum, P. radicans, P. radicum, P. raistrickii, P. rugulosum, P. simplicissimum, P. solitum, P. variabile, P. velutinum, P. viridicatum, P. glaucum, P. fussiporus и P. expansum.

[0025] В одном конкретном варианте осуществления, виды Penicillium представляют собой P. bilaiae. В другом конкретном варианте осуществления штаммы P. bilaiae выбраны из группы, состоящей из АТСС 20851, NRRL 50169, АТСС 22348, АТСС 18309, NRRL 50162 (Wakelin et al., 2004. Biol. Fertil. Soils 40:36-43). В другом конкретном варианте осуществления, виды Penicillium представляют собой P. gaestrivorus, например, NRRL 50170 (см. выше, Wakelin).

[0026] В некоторых вариантах осуществления, использован более чем один микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, а именно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере 6, включая любую комбинацию из Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida, Chryseomonas, Enterobacter, Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter и Xanthomonas, с включением одного из видов, выбранного из следующей группы: Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter sp., Arthrobacter sp., Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter sp., Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, Exiguobacterium sp., Klebsiella sp., Kluyvera cryocrescens, Microbacterium sp., Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces sp., Streptosporangium sp., Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis и Xanthomonas campestris.

[0027] В некоторых вариантах осуществления, два различных штамма одинаковых видов можно также объединять, например, используют по меньшей мере два различных штамма Penicillium. Применение комбинации по меньшей мере двух различных штаммов Penicillium имеет следующие преимущества. При применении к почве, уже содержащей нерастворимые (или умеренно растворимые) фосфаты, использование комбинированных грибковых штаммов приведет к повышению количества фосфора, доступного для поглощения растением, по сравнению с использованием только одного штамма Penicillium. Это в свою очередь может приводить к повышению поглощения фосфата и/или увеличению урожая растений, растущих на почве, по сравнению с применением одного из отдельных штаммов. Комбинация штаммов также предоставляет возможность нерастворимым рудным фосфатам для того, чтобы быть использованными в качестве эффективного удобрения для почв, которые имеют неадекватные количества доступного фосфора. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления использован один штамм P. bilaiae и P. gaestrivorus. В других вариантах осуществления, два штамма представляют собой NRRL 50169 и NRRL 50162. В дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере два штамма представляют собой NRRL 50169 и NRRL 50170. В еще дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере два штамма представляют собой NRRL 50162 и NRRL 50170.

[0028] Микроорганизмы, придающие растворимость фосфатам, могут быть приготовлены при использовании любого подходящего способа, известного специалистам в данной области, такого как ферментация в твердом состоянии или жидкостная ферментация с использованием подходящего источника углерода. Микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, предпочтительно готовят в виде устойчивых спор.

[0029] В варианте осуществления, микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, представляет собой грибок Penicillium. Грибок Penicillium согласно изобретению может быть выращен с использованием ферментации в твердом состоянии или жидкостной ферментации и подходящего источника углерода. Изоляты Penicillium могут быть выращены при использовании любого подходящего способа, известного специалистам в данной области. Например, грибок может быть культивирован на твердой ростовой среде, такой как картофельно-декстрозный агар или агар с солодовым экстрактом, или в колбах, содержащих подходящую жидкую среду, такую как среда Чапека-Докса или картофельно-декстрозный бульон. Данные способы выращивания могут быть использованы при приготовлении инокулята Penicillium spp. для обработки семян (например, покрытие) и/или для применения к носителю, приемлемому для агрономических целей, который предназначен для внесения в почву. Термин “инокулят”, как он используется в данном описании, предназначен для обозначения любой формы микроорганизма, придающего растворимость фосфатам (клетки грибка, мицелий или споры грибка, бактериальные клетки или бактериальные споры), который способен к размножению на почве или в почве, когда состояния температуры, влажности и так далее благоприятны для роста грибка.

[0030] Приготовление спор Penicillium в твердом состоянии может быть достигнуто, например, инокуляцией твердой среды, такой как торфяной субстрат или субстрат на основе вермикулита, или зерен, включающих, но без ограничения только ими, зерна видов овса, пшеницы, ячменя или риса. Стерильную среду (полученную после автоклавирования или облучения) засевают суспензией спор (1×10² - 1×10⁷) соответствующего грибка рода Penicillium spp. и регулируют влажность в интервале от 20 до 50% в зависимости от субстрата. Материал инкубируют в течение 2-8 недель при комнатной температуре. Споры также могут быть получены жидкостной ферментацией (Сunningham et al., 1990. Can. J. Bot. 68:2270-2274). Изготовление в жидком виде может быть осуществлено разведением грибка в любых подходящих средах, таких как среды типа картофельно-декстрозный бульон или сахарозный дрожжевой экстракт, при соответствующем рН и температурных условиях, которые могут быть определены по стандартным процедурам в данной области.

[0031] Образовавшийся материал может быть использован немедленно или споры могут быть собраны, концентрированы центрифугированием, сделаны как препарат и затем высушены с использованием методик воздушной сушки, сушки вымораживанием или сушки в псевдоожиженном слое (Friesen et al., 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:397-404) для получения смачивающегося порошка. Смачивающийся порошок затем суспендируют в воде, наносят на поверхность семян и предоставляют возможность для сушки перед посевом. Смачивающийся порошок может быть использован в сочетании с другими обработками семенного материала, такими как, но без ограничения только ими, химические обработки семенного материала, носителями (например, тальк, глина, каолин, силикагель, каолинит) или полимерами (например, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон). В альтернативном случае, суспензия соответствующего грибка рода Penicillium spp. может быть нанесена на подходящий носитель, совместимый с почвой (например, порошок или гранула на основе торфа), для того чтобы приобрести окончательное содержание влаги. Материал перед применением может быть инкубирован при комнатной температуре, обычно в течение приблизительно от 1 суток до приблизительно 8 недель.

[0032] Помимо ингредиентов, использованных для культивирования микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, т.е., ингредиентов, включающих, например, ингредиенты, указанные выше при культивировании Penicillium, микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, может быть приготовлен в виде препарата с применением других носителей, приемлемых для агрономических целей. Как оно используется в данном описании в сочетании с “носителем”, выражение “приемлемый для агрономических целей” относится к любому материалу, который может быть использован для доставки активных компонентов на семенной материал, почву или растение, и предпочтительно этот носитель может быть добавлен (на семенной материал, почву или растение) без нанесения вредного эффекта на рост растения, структуру почвы, дренаж почвы или тому подобное. Подходящие носители включают, но без ограничения только ими, пшеничную шелуху, размолотую солому пшеницы, порошки или гранулы на основе торфа, гранулы на основе гипса и глины (например, каолин, бентонит, монтмориллонит). Когда споры добавлены в почву, гранулированный препарат будет предпочтительным. Препараты в виде жидкости, на торфе или в виде смачивающегося порошка будут подходящими для покрытия семян. При применении для покрытия семян, материал может быть смешан с водой, применен к семенам и предоставлен для сушки. Примеры еще других носителей включают отруби, высушенные, просеянные и нанесенные на семена перед покрытием адгезивом, например, аравийской камедью. В вариантах осуществления, которые демонстрируют приготовление препарата из активных компонентов в одной композиции, носитель, приемлемый для агрономических целей, может быть водным.

[0033] Количество по меньшей мере одного микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, является эффективным для повышения роста, так что при уборке урожая растение проявляет по меньшей мере один из повышенных выходов растительного продукта, измеренный в терминах бушели/акр, повышенное число корней, повышенная длина корней, повышенная масса корней, повышенный объем корней, повышенная площадь листьев по сравнению с необработанными растениями или растениями, собранными как урожай от необработанных семян (любым активным компонентом). Подходящие дозы применения изменяются в зависимости от типа семенного материала или почвы, типа сельскохозяйственных культур, количеств источника фосфора и/или питательных микроэлементов, имеющихся в почве или добавленных в нее, и т.д. Подходящая доза может быть установлена простым опытом и экспериментами для установления ошибки по каждому конкретному случаю. Обычно, для Penicillium, например, доза применения находится в интервале 0,001-1,0 кг грибных спор и мицелия (сырая масса) на гектар, или 10²-10⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) на семенной материал (когда используют дражированные семена), или на гранулированном носителе с применением колониеобразующих единиц в интервале от 1×10⁶ до 1×10¹¹ на гектар. Грибные ячейки в форме, например, спор и носитель могут быть добавлены в рассадную грядку почвы на уровне корней или могут быть использованы для покрытия семян перед посевом, как описано подробнее ниже.

[0034] В вариантах осуществления, например, которые демонстрируют применение по меньшей мере двух штаммов микроорганизма, придающего растворимость фосфатам, таких как два штамма Penicillium, коммерческие удобрения могут быть добавлены в почву вместо (или даже также) природного рудного фосфата. Источник фосфора может содержать источник фосфора, естественный для почвы. В других вариантах осуществления, источник фосфора может быть добавлен в почву. В одном варианте осуществления источник представляет собой рудный фосфат. В другом варианте осуществления источник представляет собой производственное удобрение. Коммерчески доступные производственные фосфатные удобрения являются представителями многих типов. Некоторые обычные типы являются такими, которые содержат фосфат моноаммония фосфат (МАР), тройной суперфосфат (TSP), фосфат диаммония, простой суперфосфат и полифосфат аммония. Все данные удобрения получают химической обработкой нерастворимых природных рудных фосфатов на установках, производящих удобрение в широких масштабах, и данный продукт является дорогим. Посредством настоящего изобретения можно снижать количество данных удобрений, примененных к почве, с одновременным сохранением того же количества фосфора, поглощенного из почвы.

[0035] В следующем варианте осуществления, источник фосфора является органическим. Органическое удобрение относится к почвоулучшителю, полученному из природных источников, что гарантирует, по меньшей мере, минимальное содержание азота, фосфата и поташа. Примеры включают растительные и животные отходы, порошки скального грунта, морские водоросли, инокулянты и структурообразователи. Определенные репрезентативные примеры включают костную муку, муку из мясных отходов, навоз животных, компост, осадок сточных вод или гуано.

[0036] Другие удобрения, такие как источники азота, или другие почвоулучшители, конечно могут быть добавлены в почву приблизительно в тоже самое время, как и микроорганизм, придающий растворимость фосфатам, или в другие периоды, пока другие материалы являются нетоксичными для грибка.

[0037] Липохитоолигосахаридные соединения (LCO’s), также известные в данной области как симбиотические Nod-сигналы или Nod-факторы, состоят из олигосахаридной основы β-1,4-связанных N-ацетил-D-глюкозаминных (“GlcNAc”) остатков с N-связанной жирноацильной цепью, конденсированных по не восстановленному концу. LCO’s отличаются по числу остатков GlcNAc в основе, по длине и степени насыщения жирноацильной цепи и по замещениям восстановленных и невосстановленных остатков сахара. Пример LCO представлен ниже в виде формулы I:

в которой:

G представляет собой гексозамин, который может быть замещен, например, ацетильной группой на азоте, сульфатной группой, ацетильной группой и/или любой группой на кислороде,

R¹, R², R³, R⁵, R⁶ и R⁷, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют собой H, CH₃CO^--, C_xH_yCO^--, где х является целым числом от 0 до 17, и y является целым числом от 1 до 35, или любую другую ацильную группу, такую как, например, карбамил,

R⁴ представляет собой моно-, ди- или три-ненасыщенную алифатическую цепь, содержащую по меньшей мере 12 атомов углерода, и n является целым числом от 1 до 4.

[0038] LCOs могут быть получены (выделены и/или очищены) из бактерий, таких как Rhizobia, например, Rhizobium sp., Bradyrhizobium sp., Sinorhizobium sp. и Azorhizobium sp. Структура LCO является характерной для каждого вида из таких бактериальных видов, и каждый штамм может производить многие LCO’s с разными структурами. Например, специфические LCOs из S. meliloti также описаны в патенте США 5549718, как имеющие формулу II.

в которой:

R представляет собой H или СН₃С-- и n равно от 2 или 3.

[0039] Еще более cпецифические LCOs включают NodRM, NodRM-1, NodRM-3. При ацетилировании (R=CH₃CO--) они становятся АсNodRM-1 и АсNodRM-3, соответственно (патент США 5545718).

[0040] LCOs из Bradyrhizobium japonicum описаны в патентах США 5175149 и 5321011. В широком смысле, они являются пентасахаридными фитогормонами, содержащими метилфукозу. Ряд данных LCOs, полученных из В. japonicum, описан, а именно: BjNod-V (C_18:1); BjNod-V (Ac, C_18:1); BjNod-V (C_16:1); и BjNod-V (Ac, C_16:0), с “V”, указывающим на присутствие пяти N-ацетилглюкозаминов; с “Ac”, указывающим на ацетилирование; числом, сопровождающим “C” с указанием числа атомов углерода жирнокислотной боковой цепи; числом сопровождающим “:” с указанием числа двойных связей.

[0041] LCO’s, использованные в вариантах осуществления данного изобретения, могут быть получены (т.е., выделены и/или очищены) из бактериальных штаммов, которые производят LCO’s, таких как штаммы Azorhizobium, Bradyrhizobium (включая B. japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (включая R. leguminosarum), Sinorhizobium (включая S. meliloti) и генно-модифицированные бактериальные штаммы для производства LCO’s.

[0042] LCO’s являются первичными детерминантами специфичности паразитов в отношении хозяев в симбиозах бобовых (Diaz, et al., Mol. Plant-Microbe Interaction 13:268-276 (2000)). Таким образом, в пределах семейства бобовых определенные роды и виды клубеньковых бактерий развивают симбиотические азотфиксирующие взаимоотношения со специфическим бобовым хозяином. Данные комбинации растение-хозяин/бактерии описаны в публикации Hungria et al., Soil Biol. Biochem. 29:819-830 (1997). Примеры таких симбиотических партнерств бактерии/бобовые включают S. meliloti/люцерна и донник белый; R. leguminosarum biovar viciae/виды гороха и чечевицы; R. leguminosarum biovar phaseoli/виды бобов; Bradyrhizobium japonicum/виды сои; и R. leguminosarum biovar trifolii/красный клевер. Hungria также приводит список эффективных флавоноидных индукторов Nod-гена микоризных видов и специфические структуры LCO, которые производятся различными микоризными видами. Однако, специфичность LCO требуется только для того, чтобы установить образование клубеньков в бобовых. В практике данного изобретения применение данного LCO не ограничено обработкой семенного материала симбиотического бобового партнера, для того чтобы достигнуть повышенного выхода растительного продукта, измеренного в терминах бушели/акр, повышенное число корней, повышенная длина корней, повышенная масса корней, повышенный объем корней, повышенная площадь листьев по сравнению растениями, собранными как урожай от необработанного семенного материала или по сравнению с растениями, собранными как урожай от семенного материала, обработанного сигнальной молекулой непосредственно перед или в пределах недели или менее до посева. Таким образом, в качестве примера, LCO, полученный из B. japonicum, может быть использован для обработки бобового семенного материала, иного чем семенной материал сои, и не бобового семенного материала, такого как семенной материал кукурузы. В качестве другого примера, LCO гороха, полученный из R. leguminosarum и показанный на фиг.1 (созданный LCO-V (C18:1), SP104) может быть использован для обработки бобового семенного материала, иного чем семенной материал гороха, и также не бобового семенного материала.

[0043] Также охваченным настоящим изобретением является применение LCOs, полученных (то есть, выделенных и/или очищенных) из микоризных грибков, таких как грибки группы Glomerocycota, например, Glomus intraradicus. Структуры репрезентативных LCOs, полученных из данных грибков, описаны в WO 2010/049751 (LCOs, описанные там, также названы как “Myc-факторы”).

[0044] Кроме того, охваченным настоящим изобретением является применение синтетических LCO-соединений, таких как соединения, описанные в WO 2005/063784, и рекомбинантные LCO’s, полученные с помощью генной инженерии. Основная, находящаяся в природе структура LCO может содержать модификации или замещения, находящиеся в LCO’s природного происхождения, такие как описанные в публикациях Spaink, Crit. Rev. Plant Sci. 54:257-288 (2000) D’Haeze et al., Glycobiology 12:79R-105R (2002). Молекулы олигосахаридного предшественника (CОs, которые, как описано ниже, также применимы в качестве растительных сигнальных молекул в настоящем изобретении) для конструкции LCOs также могут быть синтезированы генетически модифицированными организмами, например, как показано в публикации Samain et al., Carb. Res. 302:35-42 (1997); Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999).

[0045] LCOs могут быть использованы в разных формах чистоты и могут применяться сами по себе или в виде культуры LCO-производящих бактерий или грибков. Например, OPTIMISE® (коммерчески доступный от фирмы Novozymes BioAg Limited) содержит культуру B. japonicum, которая производит LCO (LCO-V(C18:1, MeFuc), MOR116), что показано на фиг. 2. Способы предоставления по существу чистых LCO’s включают простое удаление микробных клеток из смеси LCOs и микроба, или продолжение выделения и очистки молекул LCO путем фазового разделения растворителей с LCO с последующей ВЭЖХ хроматографией, как описано, например, в патенте США 5549718. Очистка может быть усилена повторной ВЭЖХ, и очищенные молекулы LCO могут быть подвержены сушке вымораживанием для долгосрочного хранения.

[0046] Хитоолигосахариды (CОs), как описано выше, могут быть использованы в качестве исходных продуктов для получения синтетических LCОs. CОs известны в данной области как β-1,4-связанные N-ацетил-D-глюкозаминные структуры, идентифицированные как хитиновые олигомеры, также как N-ацетилхитоолигосахариды. CО’s имеют уникальные и разные боковые цепочечные надстройки, которые делают их отличными от хитиновых молекул [(C₈H₁₃NO₅)n, CAS No. 1398-61-4] и хитозановых молекул [(C₅H₁₁NO₄)n, CAS No. 9012-76-4]. Репрезентативная литература, описывающая структуру и образование CОs, представляет собой следующие ссылки: Van der Holst et al., Current Opinion in Strucrural Biology, 11:608-616 (2001); Robina, et al., Tetrahedron 58:521-530 (2002); Hanel et al., Planta 232:787-806 (2010); Rouge et al., Chapter 27, “The Molecular immunology of Complex Carbohydrates” in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science; Wan et al., Plant Cell 21:1053-69 (2009); PCT/F100/00803 (9/21/2000); и Demont-Caulet et al., Plant Physiol. 120(1):83-92 (1999). Два СОs, подходящие для применения в настоящем изобретении, могут быть легко произведены из LCOs, показанных на фиг. 1 и 2 (минус жирнокислотные цепи). CОs могут быть синтетическими или рекомбинантными. Способы получения рекомбинантных CОs известны в данной области. См., например, Samain et al., (выше); Сottaz et al., Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) и Samain et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999).

[0047] LCO и CO мог