Направленная модификация малатдегидрогеназы

Направленная модификация малатдегидрогеназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США №61/641776, поданной 2 мая 2012 г., и временной заявки на патент США №61/780512, поданной 13 марта 2013 г., описания которых включены таким образом посредством ссылки в их полном объеме.

ЗАЯВЛЕНИЕ ПРАВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ, СДЕЛАННЫЕ В ПРОЦЕССЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, ФИНАНСИРУЕМОГО ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА

Не применимо.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее описание относится к области геномной инженерии, в частности, измененной экспрессии и/или направленной модификации эндогенного гена малатдегидрогеназы (MDH) растений.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биотехнология возникла, как важное средство, в попытках решить проблему увеличивающейся мировой потребности в производстве пищевых продуктов. Традиционные подходы к увеличению продуктивности сельского хозяйства, например, увеличению урожая или генно-инженерной устойчивости к вредителям, основаны или на мутационной селекции, или на введении новых генов в геномы видов культур с помощью трансформации. Оба процесса по своему существу являются неспецифическими и относительно неэффективными. Например, с помощью традиционных способов трансформации растений доставляется экзогенная ДНК, которая интегрируется в геном в произвольных положениях. Таким образом, для идентификации и изоляции трансгенных линий с желаемыми свойствами необходимо создание тысяч уникальных событий произвольной интеграции и последующий скрининг на предмет желаемого события. В результате, традиционная инженерия особенности растения является трудным, трудоемким и непредсказуемым предприятием. Кроме того, неспецифическая природа этих интеграций затрудняет предсказание того, возникли ли плейотропные эффекты вследствие непреднамеренного разрушения генома. В результате, создание, изоляция или определение характеристик линий растений с конструированными трансгенами или генно-инженерными свойствами было очень трудным и затратным процессом с низкой вероятностью успеха.

Направленная модификация генов позволяет преодолеть логистические проблемы традиционных технологических приемов в случае растительных систем и как таковая была многолетней, но труднодостижимой целью и в основном биологическом исследовании растений, и сельскохозяйственной биотехнологии. Однако, за исключением «направленного воздействия на ген» через позитивно-негативную селекцию с использованием лекарственных средств в случае риса или использование заранее сконструированных рестрикционных сайтов, направленная модификация генома во всех видах растений, и модельных растениях, и культурных растениях, оказывалась до недавнего времени очень трудной. Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1030; Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2):846; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1):93.

Недавно были описаны способы и композиции для направленного расщепления геномной ДНК. Такие события направленного расщепления могут использоваться, например, для индукции направленного мутагенеза, для индукции направленных мутаций (например, делеций, заменен и/или вставок) клеточных последовательностей ДНК и содействия направленной рекомбинации и интеграции в заданный локус хромосомы. См., например, Urnov et al. (2010) Nature 435(7042):646-51; публикации заявок на патенты США №20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073; 2011089775 и публикацию международной заявки WO 2007/014275, описания которых включены посредством ссылки в их полном объеме для всех целей. Расщепление может происходить благодаря использованию специфических нуклеаз, таких как сконструированные нуклеазы с доменами «цинковые пальцы» (ZFN), активатора транскрипции вроде эффекторных нуклеаз (TALEN), хоминг-эндонуклеаз, или используя систему CRISPR/Cas вместе со сконструированной CRISPR РНК (РНК в виде коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами)/трансактивирующей CRISPR РНК («единой направляющей РНК») для проведения специфического расщепления. В публикации заявки на патент США №20080182332 описывается использование нуклеаз с доменами «неканонические цинковые пальцы» (ZFN) для направленной модификации геномов растений; в публикации заявки на патент США №20090205083 описывается ZFN-опосредованная направленная модификация локуса EPSPS у растений; в публикации заявки на патент США №20100199389 описывается направленная модификация локуса Zp15 у растений, а в публикации заявки на патент США №20110167521 описывается направленная модификация генов, участвующих в биосинтезе жирных кислот. Кроме того, в Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9):3055-3060 описывается использование сконструированных ZFN для направленного добавления гена в конкретный локус.

Ассимиляция углерода является основной в метаболическом функционировании всех живых организмов. Способность синтезировать АТФ и использовать его энергию для гомеостаза, роста и размножения сохраняется во всех царствах и оказывает влияние на большинство известных биологических процессов. Основным компонентом синтеза АТФ у эукариот является цикл трикарбоновых кислот (ТКК), также известный как цикл лимонной кислоты или цикл Кребса, в ходе которого электроны с органических кислот переходят к окисленным редокс-кофакторам НАД+ и ФАД, образуя НАДН, ФАДН2 и углекислый газ. Цикл ТКК протекает в митохондриях; в растениях промежуточные продукты, образуемые в ходе его реакций, служат в качестве субстратов для многочисленных путей биосинтеза; основные поставки для образования аспартата, глютамата, нуклеиновых кислот, порфиринов и жирных кислот идут из цикла ТКК. Кроме того, промежуточные продукты цикла ТКК играют ключевую роль в энергетических процессах фотодыхания и фотосинтеза. По этой причине полагают, что цикл ТКК действуют в качестве связующего звена между окислительно-восстановительными функциями хлоропластов, митохондрий и цитозоля.

Малат является одним из промежуточных продуктов цикла ТКК и функционирует в качестве субстрата и для декарбоксилирующей малатдегидрогеназы, которая порождает пируват, и для малатдегидрогеназы (MDH). MDH катализирует обратимое восстановление оксалоацетата (OAA) до малата через НАДН и включена в малат-аспартатную челночную систему. Большинство растений содержат множество изоформ MDH, в том числе митохондриальные и цитозольные ферменты, которые кодируются ядерными генами. Митохондриальная MDH (mMDH) растений участвует в 3 типах реакций: превращении малата в OAA, восстановлении OAA до малата и восстановлении OAA в С4-пути фотосинтеза. У кукурузы (C4 злаковой травы) существует 5 различных локусов MDH в 5 независимых хромосомах, 2 из которых кодируют цитозольные изоформы, в то время как другие 3 кодируют митохондриальные ферменты. Используя классические анализы мутаций, было показано, что полная утрата функции 2 цитозольных форм MDH не оказывала вредное влияние на рост и размножение растений - функция в цитозоле, по-видимому, была несущественной. Напротив, полная утрата 3 митохондриальных ферментов приводила к летальности - растениям нужен был по крайней мере один функциональнй аллель, чтобы быть жизнеспособными (Goodman et al. (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:1783-1785). Так же данные наблюдений встречающихся в природе, самопроизвольных молчащих аллелей митохондриальной MDH-1 (Mdh1-n) у сои показали, что не было заметного изменения фенотипа растения до тех пор, пока ген митохондриальной Mdh2 оставался стабильным (Imsande et al. (2001) J. Heredity 92:333-338).

Несмотря на основную роль малата в метаболизме растений, его функции в цикле ТКК все еще не полностью поняты. Мутантные по MDH растения демонстрируют более медленные скорости роста и измененные характеристики фотодыхания. См., например, Tomaz et al. (2010) Plant Physiol. 154(3):1143-1157. Исследования антисмысловых олигонуклеотидов и РНК-интерференции в целых растениях или плоде дали противоречивые результаты, включающие растения с увеличенным весом сухого (не сырого) плода, а также растения с более высокими уровнями аскорбата в их листьях, чем в контролях дикого типа, но при выращивании в световых условиях короткого дня (которые способствуют фотодыханию) растения продемонстрировали фенотип карликовости и имели уменьшенную биомассу листьев, стеблей и корней. Nunes-Nesi et al. (2005) Plant Physiol. 137:611-622; Nunes-Nesi et al. (2007) Physiol. Plant. 129:45-56; Nunes-Nesi (2008) J. Exp. Bot. 59:1675-1684; Finkmeier and Sweetlove (2009) F1000 Biology Reports I:47; doi: 10.3410/B1-47. Кроме того, подвергнутые воздействию антисмысловых олигонуклеотидов для гена mMDH линии с уменьшенной экспрессией mMDH продемонстрировали уменьшенную активность (39% от таковой дикого типа) этого фермента, приведшую к уменьшению корневой зоны и остановке роста корней. Van der Merwe et al. (2009) Plant Physiol. 149:653-669; Van Der Merwe et al. (2010) Plant Physiol. 153:611-621. Кроме того, подвергнутые воздействию антисмысловых олигонуклеотидов для гена mMDH линии продемонстрировали увеличение высыхания плода (большую потерю H₂О) и увеличенную подверженность заражения грибами. Centeno et al. (2011) Plant Cell 23:162-184. В публикации заявки на патент США №20090123626 описывается использование РНК-интерференции для MDH для уменьшения уровня аспарагина, что в свою очередь приводит к снижению уровня акриламида, который накапливается в результате связанного с обработкой нагревания растений и растительных продуктов.

Таким образом, остаются потребности в композициях и способах для изменения экспрессии генов MDH, например, с помощью направленной геномной модификации генов MDH, в растениях для создания стабильных, наследуемых генетических модификаций в растении и его потомстве.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании представлены способы и композиции для направленной модификации гена(ов) MDH, а также клетки (например, семена), линии клеток, организмы (например, растения) и т.д., включающие одну или более направленных мутаций в MDH. Геном MDH может быть, например, ген митохондриальной MDH (mMDH). Как отмечено выше, исследования, демонстрирующие уменьшение ферментативной функции MDH с помощью технологии антисмысловых олигонуклеотидов и РНК-интерференции, дают противоречивые результаты, касающиеся эффекта(ов) ингибирования MDH, например, на урожай плодов. Основываясь на этих исследованиях можно было ожидать, что ингибирование протекания реакций цикла ТКК будет оказывать отрицательный эффект на фотосинтез. Таким образом, является внезапным и неожиданным, что авторы настоящего изобретения показали, что растения (и клетки растений), включающие направленные мутации в MDH, которые уменьшают функцию (активность) MDH, приводят к увеличенной урожайности от растений, включающих MDH-модифицированные клетки. Увеличенный урожай может включать, например, увеличенную величину урожая плодов, увеличенную биомассу растения (или плода растения), большее содержание мякоти плода, растения большего размера, увеличенный сухой вес, увеличенное твердое содержимое, более высокий общий вес при сборе урожая, увеличенную интенсивность и/или однородность цвета культуры, измененные химические характеристики (например, имеющие отношение к маслам, жирным кислотам, углеводам, белкам) и т.д.

Таким образом, в одном аспекте, здесь описываются растения, включающие клетки растений, в которых экспрессия эндогенного гена MDH модифицирована так, что экспрессия MDH является уменьшенной, и которые демонстрируют увеличенную урожайность. В некоторых вариантах осуществления экспрессию эндогенного гена MDH изменяют, используя составной белок, включающий ДНК-связывающий белок (например, белок с цинковыми пальцами, эффекторный домен TAL) и функциональный домен. В некоторых вариантах осуществления клетки растений содержат направленную модификацию гена MDH (например, mMDH), причем направленную модификацию, которая уменьшает экспрессию MDH, индуцирует нуклеазу, например, составной белок, включающий ДНК-связывающий домен и функциональный домен (например, нуклеаза с доменами «цинковые пальцы»), которая расщепляет эндогенный ген и уменьшает его экспрессию. Модификация (например, делеция, замена и/или вставка) может быть, например, модификацией одной или более аминокислот в НАДН-связывающем участке гена MDH (например, первом и/или втором НАДН-связывающем участке гена). В некоторых вариантах осуществления модификация включает изменение одной или более аминокислот в первом и/или втором НАДН-связывающем участке эндогенного гена MDH в клетке растения, например, одной или более аминокислот в положениях 104-136 и/или 171-220, пронумерованных относительно аминокислотной последовательности MDH дикого типа (например, SEQ ID NO: 1 (последовательности MDH помидора дикого типа), SEQ ID NO: 126 (последовательности MDH кукурузы дикого типа) и/или SEQ ID NO: 125 (последовательности MDH сои дикого типа)) и совмещенных с ней (например, фиг. 10).

Белок с цинковыми пальцами может включать распознающие спиральные участки, продемонстрированные в одном ряду таблицы 1A, и/или связываться с последовательностью-мишенью, продемонстрированной в таблице 1B. В других вариантах осуществления нуклеаза включает эффекторный домен TAL, хоминг-нуклеазу и/или Crispr/Cas единую направляющую РНК. Направленное изменение экспрессии MDH (например, направленная геномная модификация) может увеличить или уменьшить активность MDH, например, уменьшение активности MDH может быть в результате создания мутации, которая приводит к аберрантной транскрипции продукта гена (например, через сдвиг рамки считывания, новый стоп-кодон или другую мутацию). В некоторых вариантах осуществления направленная модификация, используя нуклеазу, включает небольшую вставку и/или делецию, также известную как вставка или делеция, например, вставка или делеция, продемонстрированная в таблице 4. Модификация в клетке может быть модификацией одного или более аллелей (например, в гомозиготах, гетерозиготах, в паралогичных генах). Любая из клеток растений, описываемых здесь, может находиться в растении или части растения (например, семенах, цветке, плоде), например, любого сорта: помидора (например, M82 или Moneymaker), сои, кукурузы, картофеля, люцерны или т.п.

В другом аспекте здесь описывается ДНК-связывающий домен (например, белок с цинковыми пальцами (ZFP)), который специфически связывается с геном MDH. Белок с цинковыми пальцами может включать один или более цинковых пальцев (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более цинковых пальцев), и может быть сконструирован белок с цинковыми пальцами, который связывается с любой последовательностью в любом гене MDH. Любой из белков с цинковыми пальцами, описываемый здесь, может связываться с сайтом-мишенью в кодирующей последовательности MDH или в примыкающих последовательностях (например, промоторе или других контролирующих экспрессию элементах) при условии, что достигается модификация экспрессии MDH. В некоторых вариантах осуществления белок с цинковыми пальцами связывается с сайтом-мишенью в гене mMDH, например, являющейся мишенью последовательности, продемонстрированной в таблице 1B. В других вариантах осуществления распознающие спиральные участки компонентных цинковых пальцев расположены в порядке от пальца 1 к пальцу 5 (от F1 к F5) или от пальца 1 к пальцу 6 (от F1 к F6), как продемонстрировано в одном ряду таблицы 1A. Один или более компонентных связывающих доменов «цинковые пальцы» белка с цинковыми пальцами может быть каноническим (C2H2) цинковым пальцем или неканоническим (например, C3H) цинковым пальцем (например, N-концевой и/или C-концевой цинковый палец может быть неканоническим пальцем).

В другом аспекте здесь описываются составные белки, при этом каждый составной белок включает ДНК-связывающий домен (например, белок с цинковыми пальцами), который специфически связывается с одним или более генов MDH. В некоторых вариантах осуществления белками являются составные белки, включающие белок с MDH-связывающимися цинковыми пальцами и функциональный домен, например, активирующий транскрипцию домен, подавляющий транскрипцию домен и/или расщепляющий домен (или полдомена для расщепления). В некоторых вариантах осуществления составным белком является нуклеаза с доменами «цинковые пальцы» (ZFN). Расщепляющие домены и половины доменов для расщепления можно получить, например, из различных эндонуклеаз рестрикции и/или хоминг-эндонуклеаз. В одном варианте осуществления половины доменов для расщепления происходят из эндонуклеазы рестрикции типа IIS (например, Fok I).

В других аспектах здесь обеспечиваются полинуклеотиды, кодирующие любой из ДНК-связывающих доменов (например, белки с цинковыми пальцами) и/или составных белков, описываемых здесь. В некоторых вариантах осуществления здесь описывается вектор для экспрессии ZFP, включающий полинуклеотид, кодирующий один или более ZFP, описываемых здесь, функционально связанный с промотором. В одном варианте осуществления одним или более ZFP являются ZFN.

ZFP и составные белки, включающие эти ZFP, могут связывать и/или расщеплять один или более генов MDH (например, ген mMDH) в кодирующей области гена или в некодирующей последовательности в гене или рядом с ним, такой как, например, лидерная последовательность, трейлерная последовательность или интрон, или промоторная последовательность, или в нетранскрибируемой области, или 5', или 3' от кодирующей области. В некоторых вариантах осуществления ZFP или ZFN связываются с кодирующей последовательностью или регуляторной последовательностью гена MDH и/или расщепляют ее.

В другом аспекте здесь описываются композиции, включающие один или более белков, составных белков и/или полинуклеотидов, описываемых здесь. Клетки растений могут содержать один уникальный ген MDH-мишень или множество паралогичных генов MDH-мишеней. Таким образом, описываемые здесь композиции могут включать один или более ZFP-содержащих белков (и полинуклеотидов, кодирующих их), мишенью которых является один или более генов MDH в клетке растения. Мишенями ZFP могут быть любые паралогичные или гомологичные гены и избранные конкретные паралогичные или гомологичные гены в клетке растения или комбинация некоторых паралогичных и некоторых гомологичных генов.

В другом аспекте здесь обеспечивается способ изменения экспрессии одного или более генов MDH (например, эндогенного гена mMDH) в клетке растения, при этом способ включает экспрессию одного или более содержащих ДНК-связывающий домен белков (например, белков с цинковыми пальцами) в клетке из условия, чтобы экспрессия MDH изменялась. В некоторых вариантах осуществления способы включают использование пары нуклеаз с доменами «цинковые пальцы» (белков и/или полинуклеотидов, кодирующих эти белки) для создания небольшой вставки и/или делеции («вставки или делеции»), которая нарушает экспрессию MDH. В других вариантах осуществления способы включают использование пары нуклеаз с доменами «цинковые пальцы» для увеличения экспрессии MDH, например, посредством направленной вставки трансгена или увеличивающего экспрессию элемента. В других вариантах осуществления способы изменения экспрессии MDH включают использование одного или более факторов транскрипции с доменами «цинковые пальцы» (составных белков, включающих белки с MDH-связывающимися цинковыми пальцами и функциональный домен, который является регулирующим транскрипцию доменом, таким как домен активации или репрессии). В некоторых вариантах осуществления измененная экспрессия/функция MDH приводит к увеличению фотосинтеза в клетках растений. В некоторых вариантах осуществления измененная экспрессия/функция MDH приводит к модификациям в цикле лимонной кислоты в клетках растений. В некоторых вариантах осуществления измененная экспрессия/функция MDH приводит к более высоким уровням малата в клетке растения. В других вариантах осуществления измененная экспрессия/функция MDH приводит к снижению уровней OAA в клетке. В одном варианте осуществления измененная экспрессия/функция MDH в клетках растений имеет следствием растения с повышенной урожайностью. В некоторых вариантах осуществления увеличение урожайности приводит к большему сырому весу полученного плода и общему сырому весу всех плодов, собранных с первой кисти мутантных растений.

В другом аспекте здесь обеспечиваются нуклеиновые кислоты и антитела, и способы их применения для обнаружения и/или измерения измененной экспрессии генов MDH и их модификаций.

В другом аспекте здесь описывается способ модификации одного или более генов MDH в клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает: (a) введение в клетку растения одной или более нуклеаз в форме белка и/или одного или более экспрессионных векторов, кодирующих одну или более нуклеаз (например, ZFN), которые связываются с сайтом-мишенью в одном или более генов MDH, в условиях, чтобы нуклеазы (например, ZFN) экспрессировались и один или более генов MDH расщеплялись, в силу чего осуществляется модификация одного или более генов MDH. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере один сайт-мишень находится в гене mMDH. В других вариантах осуществления расщепляется более чем один ген MDH. Более того, в любом из описываемых здесь способах расщепление одного или более генов может приводить к делеции, добавлению и/или замене нуклеотидов в расщепленном участке, например, так, что активность MDH изменяется (например, увеличивается или уменьшается).

Тем не менее, в другом аспекте здесь описывается способ введения экзогенной последовательности (трансгена) в геном клетки растения из условия, чтобы активность MDH в клетке растения изменялась, при этом способ включает стадии: (a) приведения клетки в контакт с экзогенной последовательностью (вектором-донором); и (b) экспрессии одной или более нуклеаз (например, нуклеаз с доменами «цинковые пальцы»), описываемых здесь, в клетке, причем одна или боле нуклеаз расщепляет хромосомную ДНК; так что расщепление хромосомной ДНК на стадии (b) стимулирует включение вектора-донора в геном в результате гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления экзогенная последовательность встраивается в ген MDH. В других вариантах осуществления экзогенная последовательность встраивается близко от гена MDH. Активность MDH может увеличиваться или уменьшаться. В любом из описываемых здесь способов одна или более нуклеаз могут представлять собой объединения расщепляющего домена эндонуклеазы рестрикции типа IIs с сконструированным связывающим доменом «цинковые пальцы». В других вариантах осуществления нуклеаза включает хоминг-нуклеазу, например, хоминг-нуклеазу с модифицированным ДНК-связывающим доменом. В любом из описываемых здесь способов экзогенная последовательность может кодировать белковый продукт.

Тем не менее, в дальнейшем аспекте также обеспечивается клетка растения, полученная в соответствии с любым из способов, описываемых здесь.

В другом аспекте здесь обеспечивается растение, включающее клетку растения, описываемую здесь.

В другом аспекте здесь обеспечивается семя растения, включающего клетку растения, которая получена как описывается здесь.

В другом аспекте здесь обеспечивается плод, полученный от растения, включающего клетку растения, полученную как описывается здесь.

В любой из композиций (клеток или растений) или способов, описываемых здесь, клетка растения может включать клетку однодольного или двудольного растения. В некоторых вариантах осуществления клеткой растения является таковая культурного растения, например, помидора (или другой плодовой культуры), картофеля, кукурузы, сои, люцерны и т.д.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представляет собой схему, на которой изображены различные структурные элементы гена митохондриальной MDH (mMDH) из Solanum lyocpersicum (v. M82).

На фиг. 2, панели A и B, изображена геномная организация и последовательность гена митохондриальной малатдегидрогеназы (mMDH) помидора. На фиг. 2A продемонстрированы сайты-мишени для ZFN (короткие указывающие налево и направо стрелки над экзонами) в экзонах 1, 3, 4 и 6. Обозначенный на фиг. 2А номер связывающей последовательности ZFN соответствует номеру ZFN, описанному в таблице 1; 107830L в таблице 1 описан на фиг. 2A как 830L, 107830R в таблице 1 описан на фиг. 2A как 830R, 107832L в таблице 1 описан на фиг. 2A как 832L, 107832R в таблице 1 описан на фиг. 2A как 832R, 107833L в таблице 1 описан на фиг. 2A как 833L, 107833R в таблице 1 описан на фиг. 2A как 833R, 107835L в таблице 1 описан на фиг. 2A как 835L, 107835R в таблице 1 описан на фиг. 2A как 835R. На фиг. 2B (SEQ ID NO: 2) представлена последовательность локуса mMDH; экзоны подчеркнуты, и сайты-мишени ZFN указаны жирным шрифтом.

Фиг. 3 представляет собой схему, на которой представлена карта плазмиды pKG7479.

Фиг. 4 представляет собой схему, на которой представлена карта плазмиды pKG7480.

Фиг. 5 представляет собой схему, на которой представлена карта плазмиды pKG7481.

Фиг. 6 представляет собой схему, на которой представлена карта плазмиды pKG7482.

На фиг. 7 изображен анализ последовательностей небольших вставок или делеций («вставок или делеций»), индуцированных в гене mMDH помидора в результате активности ZFN в протопластах. ZFN были транзиторно экспрессированы в протопластах клеток помидора, и вставки или делеции детектировали, используя анализ HRM. Сайты-мишени в mMDH для каждой ZFN представлены вместе с подчеркнутыми сайтами связывания. Амплифицированные продукты, содержащие делеции (представленные как -) или вставки (жирный шрифт), представлены под каждой последовательностью-мишенью.

Фиг. 8, панели A и B, представляет собой графики, на которых представлена активность mMDH в растениях F2. Фиг. 8A представляет собой график, на котором представлено определение активности mMDH в растениях F2, происходящих от линии 107832_9-6 (с делецией -3 п.о.). «126 9-6 WT» обозначает результаты биохимического анализа растения F2, в котором отсутствует мутация в виде вставки или делеции, «115 9-6 M» обозначает растения F2, гомозиготные по мутации в виде вставки или делеции, и «132 9-6 H» обозначает растение F2, гетерозиготное по мутации в виде вставки или делеции. Фиг. 8В представляет собой график, на котором представлено определение активности mMDH в растениях F2, происходящих от линии 107832_10-2 (с делецией -2 п.о.). WT48 обозначает растения F2, в которых отсутствует мутация в виде вставки или делеции, «M60» обозначает растения F2, гомозиготные по мутации в виде вставки или делеции, и «H32» обозначает растение F2, гетерозиготное по мутации в виде вставки или делеции.

Фиг. 9 представляет собой диаграмму, на которой представлен урожай плодов помидора линии 107832 9-6. Средний вес помидора (г) представлен по оси Y для 3 классов растений F2, выделяющихся по мутации в виде делеции -3 п.о. в локусе mMDH. «WT» означает растения F2, в которых отсутствует делеция, «Het» означает растения F2, гетерозиготные по делеции, и «Homo» означает растения F2, гомозиготные по делеции.

Фиг. 10 представляет собой совмещение последовательностей ферментов mMDH сои (SEQ ID NO: 125), кукурузы (SEQ ID NO: 126) и помидора (SEQ ID NO: 1).

Фиг. 11 представляет собой совмещение последовательностей мутаций mMDH, возникающих в геноме помидора.

Фиг. 12 представляет собой схему, на которой представлена биохимическая реакция, катализируемая ферментом mMDH.

Фиг. 13 представляет собой таблицу, в которой представлены специфические активности mMDH помидора дикого типа и двух мутантных ферментов mMDH помидора, которые определяли, спектрофотометрически следя за окислением НАДН. Мутация «mMDH del 3» сохраняет приблизительно 23% активности фермента дикого типа, а активность фермента с мутацией «mMDH del3 NADH BS1» является значительно уменьшенной на уровне приблизительно 1,5% от активности фермента дикого типа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее описание относится к способам и композициям для измененной экспрессии одного или более генов малатдегидрогеназы (MDH) в клетке растения или растении, например, направленной геномной модификации гена MDH, такого как ген митохондриальной малатдегидрогеназы (mMDH), в клетке растения (например, кукурузы, помидора, сои и т.д.). В частности, экспрессию MDH изменяют посредством использования составных белков, включающих ДНК-связывающий домен (например, белок с цинковыми пальцами) и функциональный домен (например, регулирующий транскрипцию домен и/или нуклеазу). В некоторых вариантах осуществления направленная модификация достигается при расщеплении гена MDH, используя одну или более нуклеаз (например, ZFN) для создания модификаций (например, мутаций) в локусе MDH. Расщепление является направленным благодаря использованию составных белков, включающих ДНК-связывающий домен, такой как ДНК-связывающий домен мегануклеазы, ДНК-связывающий домен «лейциновая молния», ДНК-связывающий домен TAL, белок с цинковыми пальцами (ZFP), Crispr/Cas систему или химерные комбинации вышеупомянутых доменов. В некоторых вариантах осуществления модификация включает мутацию (замены, делеции и/или вставки) гена MDH из условия, чтобы была изменена одна или более аминокислот в первом и/или втором НАДН-связывающем участке эндогенного гена MDH, например, одна или более аминокислот в положениях 104-136 и/или 171-220, пронумерованных относительно SEQ ID NO: 1 (последовательности MDH помидора дикого типа), SEQ ID NO: 125 (последовательности MDH кукурузы дикого типа) и/или SEQ ID NO: 126 (последовательности MDH сои дикого типа) и совмещенных с ней.

В некоторых вариантах осуществления нуклеазы(а) включают одну или более ZFN. ZFN типично включают расщепляющий домен (или полдомена для расщепления) и связывающий домен «цинковые пальцы», который связывается с сайтом-мишенью в эндогенном гене MDH. ZFN могут быть введены в виде белков, в виде полинуклеотидов, кодирующих эти белки, и/или в виде комбинаций полипептидов и кодирующих полипептиды полинуклеотидов. Нуклеазы с доменами «цинковые пальцы» типично функционируют в виде димерных белков после димеризации половин доменов для расщепления и могут образовывать гомодимеры и/или гетеродимеры. Были описаны облигатные гетеродимерные ZFN, в случае которых мономеры ZFN, связывающиеся с «левым» и «правым» доменами распознавания, могут объединяться с образованием активной нуклеазы. См., например, публикацию заявки на патент США №2008/0131962. Таким образом, если имеются соответствующие сайты-мишени, «левый» мономер мог бы образовывать активную ZFN с любым «правым» мономером. Это значительно увеличивает число пригодных для нуклеаз сайтов на основе опробованных «левых» и «правых» доменов, которые могут использоваться в различных комбинациях. Например, рекомбинирование связывающих центров 4 гомодимерных ZFN даст дополнительно 12 гетеродимерных ZFN. Что еще более важно, оно делает возможным системный подход к разработке трансгенов так, чтобы каждая новая введенная экзогенная последовательность (трансген) становилась фланкированной уникальным сайтом для ZFN, который может использоваться для обратного вырезания гена или для направления дополнительных генов рядом с ним. Кроме того, этот способ может упростить стратегии установки в один локус, которая обусловлена ZFN-зависимыми двухцепочечными разрывами.

Связывающий домен «цинковые пальцы» может быть каноническим (C2H2) цинковым пальцем или неканоническим (например, C3H) цинковым пальцем. Кроме того, связывающий домен «цинковые пальцы» может включать один или более цинковых пальцев (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более цинковых пальцев), и можно сконструировать такой домен, который связывается с любой последовательностью в любом гене MDH. Распознающие спиральные участки приводимых в качестве примера белков с MDH-связывающими цинковыми пальцами для применения для связывания с геном MDH продемонстрированы в таблице 1A, а приводимые в качестве примера сайты-мишени в гене MDH продемонстрированы в таблице 1B. Присутствие такого составного белка (или белков, и/или полинуклеотидов, кодирующих эти составные белки) в клетке приводит к связыванию составного белка(ов) со своим сайтом(ами) связывания и расщеплению в гене(ах) MDH.

Общие сведения

Для осуществления на практике способов, а также приготовления и применения композиций, описываемых здесь, используются, кроме особо оговоренных способов, традиционные методы в молекулярной биологии, биохимии, исследовании структуры хроматина, вычислительной химии, методы культивирования клеток, рекомбинантных ДНК и в связанных областях, которые находятся в пределах компетентности в данной области техники. Эти методы в полной мере объяснены в литературе. См., например, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 и третье издание, 2001; Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 и периодические обновления; выпуски METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, «Chromatin» (P.M. Wassarman and A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; и METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, «Chromatin Protocols» (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Определения

Термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, в линейной или замкнутой в круг конформации, и в или одноцепочечной, или двухцепочечной форме. Применительно к целям настоящего описания, эти термины не должны рассматриваться как ограничение по длине полимера. Эти термины могут охватывать известные аналоги природных нуклеотидов, а также нуклеотиды с подвергнутыми модификациям основаниями, сахарными и/или фосфатными составляющими (например, фосфоротиоатными связями). Как правило, аналог конкретного нуклеотида обладает такой же специфичностью спаривания оснований; т.е. аналог A будет подвергаться спариванию с основанием T.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру аминокислотных остатков. Термин также применяется в отношении полимеров аминокислот, в которых одна или более аминокислот являются химическими аналогами или модифицированными производными соответствующих встречающихся в природе аминокислот.

«Связывание» относится к специфическому в отношении последовательности, нековалентному взаимодействию между макромолекулами (например, между белком и нуклеиновой кислотой). Не требуется, чтобы все компоненты взаимодействия-связывания были специфическими в отношении последовательности (например, контакты с фосфатными остатками в остове ДНК) при условии, что взаимодействие в целом является специфическим в отношении последовательности. Такие взаимодействия, как правило, характеризуются константой диссоциации (K_d), составляющей 10^-6 M^-1 или меньше. «Сродство» относится к силе связывания: при этом увеличенное сродство связывания коррелирует с меньшей K_d.

«Связывающий белок» является белком, который способен к связыванию с другой молекулой. Связывающий белок может связываться, например, с молекулой ДНК (ДНК-связывающий белок), молекулой РНК (РНК-связывающий белок) и/или молекулой белка (белок-связывающий белок). В случае белок-связывающего белка он может связываться с самим собой (с образованием гомодимеров, гомотримеров и т.д.), и/или он может связываться с одной или более молекулами отличного белка или белков. Связывающий белок может обладать более чем одним типом активности связывания. Например, белки с цинковыми пальцами обладают ДНК-связывающей, РНК-связывающей и белок-связывающей активностью.

«ДНК-связывающий белок с цинковыми пальцами» (или связывающий домен) является белком, или доменом в более большом белке, который связывается с ДНК специфическим в отношении последовательности образом благодаря одному или более цинковым пальцам, которые представляют собой участки аминокислотной последовательности внутри связывающего домена, структура которых стабилизирована благодаря координации иона цинка. Термин «ДНК-связывающий белок с цинковыми пальцами» часто сокращенно называют белком с цинковыми пальцами или ZFP.

Можно сконструировать связывающие домены «цинковые пальцы», которые связываются с заданной нуклеотидной последовательностью. Неограничивающими примерами способов конструирования белков с цинковыми пальцами являются разработка и отбор. Сконструированный белок с цинковыми пальцами представляет собой не встречающийся в природе белок, разработка/состав которого вытекают в основном из критериев рациональности. Критерии рациональности для разработки включают применение правил замещений и компьютерных алгоритмов для обработки информации в базе данных, хранящей информацию о существующих разработках ZFP и данные о связывании. См., например, патенты США №№6140081, 6453242 и 6534261; см. также WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 и WO 03/016496.

«Отобранный» белок с цинковыми пальцами представляет собой не обнаруживаемый в п