Химерное терапевтическое антитело нн1 против cd-37

Химерное терапевтическое антитело нн1 против cd-37

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммунотерапии и радиоиммунотерапии гемабластозов химерным или гуманизированным антителом с неожиданно высокой цитотоксичностью, а также к различным применениям антител.

Уровень техники

Настоящее изобретение относится к химерным и гуманизированным антителам против CD37, а также к их получению и применению.

Настоящее изобретение также относится к иммунотерапии и радиоиммунотерапии, которые основаны на элиминации B-клеток.

В частности, настоящее изобретение относится к молекулам антител против CD-37 для применения в таком лечении, например, лечении B-клеточных злокачественных образований и аутоиммунных состояний.

Иммунотерапия с применением моноклональных антител (mAbs) зародилась как безопасный и избирательный способ лечения рака и других заболеваний.

В частности, роль моноклональных антител в терапии, которая основана на элиминации B-клеток, например, при лечении B-клеточных злокачественных новообразований, расширилась после введения ритуксимаба, антитела, которое направлено против антигена CD20 на поверхности B-клеток.

Антиген CD37 - это антиген клеточной поверхности, который не рассматривался в качестве мишени при B-клеточных злокачественных новообразованиях в той же степени, как антиген B-клеток CD20.

CD37, член суперсемейства тетраспанинов, является в значительной степени гликозилированной молекулой клеточной поверхности с четырьмя трансмембранными доменами и двумя внеклеточными петлями.

Экспрессия CD37 наблюдается в нормальных B-клетках, при неходжкинской лимфоме (NHL), в том числе при лимфоме из клеток мантийной зоны (MCL), лимфоме Беркитта (BL), лимфоме малых лимфоцитов (SLL) и фолликулярной лимфоме (FL), лимфоме из клеток маргинальной зоны (MZL), диффузной B-клеточной лимфоме (DLBCL), лимфоплазмоцитарной лимфомы (LL) и хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL).

Такой паттерн экспрессии делает CD37 привлекательной мишенью для терапии рака, опосредованной антителом.

CD37 был впервые описан в 1986 году и характеризуется моноклональным антителом мыши MB-1 (Link et al., 1986).

Физиологическая роль CD37 неизвестна.

Связывание специфичного к CD37 моноклонального анттела (mAb) с раковыми клетками может запускать различные механизмы: Во-первых, после связывания антитела с внеклеточным доменом антигена CD37 может активироваться каскад реакций комплемента и лизис клетки-мишени.

Во-вторых, антитело против CD37 может опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в клетке-мишени, которая происходит после того, как Fc часть связанного антитела распознается соответствующими рецепторами на цитотоксических клетках иммунной системы.

B-третьих, антитело может изменить способность B-клеток реагировать на антиген или другие стимулы.

Наконец, антитело против CD37 может инициировать запрограммированную гибель клеток (апоптоз).

mAb против CD37 MB-1 оценивали в двух радиоиммунотерапевтических испытаниях на больных B-NHL (B-клеточная неходжкинская лимфома;. Press et al., 1989; Kaminski et al., 1992).

В других работах также раскрыты моноклональные антитела против CD37, которые демонстрируют потенциал (например, WO 2009/019312 Heider et al., и WO 2011/092295 авторов настоящего изобретения), но необходимо пройти еще долгий путь, прежде чем будет доказано, что CD37 является идеальной альтернативой CD20 для лечения B-клеточных злокачественных новообразований.

В заключение было показано, что антиген CD37 часто экспрессируется на опухолевых клетках при нескольких B-клеточных злокачественных новообразованиях человека и на нормальных зрелых B-лимфоцитах и, таким образом, терапия на основе антитела против CD37 может быть перспективным подходом для лечения B-клеточных злокачественных новообразований.

Хотя антитела против CD37 или подобные антителам молекулы, как описано выше (например, MB-1), показали противоопухолевую эффективность на B-клеточных злокачественных новообразованиях и способность поражать CD37, существует потребность в альтернативных антителах против CD37 для улучшения лекарственных средств, основанных на элиминации B-клеток.

Таким образом, улучшенное антитело против CD37 было бы полезно для создания новых способов лечения B-клеточных злокачественных новообразований

Краткое описание изобретения

Объект настоящего изобретения относится к химерному или гуманизированному антителу, полученному из моноклонального антитела мыши HH1.

В частности, объектом настоящего изобретения является обеспечение химерного или гуманизированного антитела.

Один аспект настоящего изобретения относится к молекуле антитела, которое связывается с CD37 человека и которое является производным от a) моноклонального антитела мыши, которое определяется i) вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; и ii) вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или от б) антитела, не являющегося антителом человека, распознающим тот же эпитоп CD37 человека, что и антитело, определенное в а) или распознающим эпитоп, который близок или перекрывается с указанным эпитопом; причем указанная молекула антитела представляет собой химерное или гуманизированное антитело.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к молекуле ДНК, кодирующей антитела согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, несущей одну или более молекул ДНК, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения антитела согласно настоящему изобретению, включающему трансфекцию клетки-хозяина млекопитающего одним или более векторами, кодирующими антитела согласно настоящему изобретению, культивирование клетки-хозяина и выделение и очистку молекулы антитела.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента одно или несколько антител согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для применения при лечении B-клеточных злокачественных новообразований.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего от B-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни, включающему введение указанному пациенту эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к радиоиммуноконъюгату, который связывает CD37 человека, содержащему: а) антитело согласно настоящему изобретению, б) линкер, в) радионуклид, выбранный из группы, состоящей из ²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc и ¹⁷⁷Lu.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей радиоиммуноконъюгат, описанный выше.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, описанной выше, для применения при лечении B-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу лечения B-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни, включающему введение эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к набору для получения радиоиммуноконъюгата согласно настоящему изобретению, содержащему два или более флаконов, где один флакон содержит конъюгат, содержащий хелатирующий агент, связанный с антителом согласно настоящему изобретению; а второй флакон содержит радионуклид.

Кроме того аспектом изобретения является применение химерных антител для блокирования антигена CD37 в нормальных тканях перед применением меченного радиоактивным изотопом антитела мыши или химерного HH1 для терапии.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана точечная диаграмма проточной цитометрии при пропускании клеток Daudi и гистограмма для связывания chHH1.1 (изотип IgG1) против CD37 и отсутствия связывания антитела против NIP (отрицательный контроль). Фигура 1 демонстрирует значительное связывание chHH1 с антигеном.

На фигуре 2 показано связывание chHH1.1 с клетками лимфомы линии Daudi. Она демонстрирует быстрое и эффективное связывание с мишенью.

Фигура 3 показывает, что chHH1 имеет аналогичную ADCC, что и ритуксимаб, несмотря на меньшее количество антигенов, и значительную интернализацию CD37 целевыми клетками лимфомы линии Daudi.

Фигура 4 иллюстрирует ADCC на РВМС, стимулированных IL-2, в качестве эффекторных клеток, и клетках Rec-1 в качестве клеток-мишеней в трех различных соотношениях эффектора и клеток-мишеней. Средние и SD для трех индивидуумов.

На фигуре 5 показана CDC с 10% сывороткой на трех индивидуумах для клеток Rec-1, меченных HH1 мыши, ритуксимабом, chHH1.1 или комбинацией ритуксимаба и chHH1.1.

Фигура 6 показывает биораспределение (% I.D./г) ¹²⁵I-chHH1.3 в женских особях голых мышей через 24 и 48 часов после инъекции.

Фигура 7 показывает процент специфического лизиса из-за ADCC в клетках Daudi с NK-клетками в качестве эффекторных. Кровь брали у двух индивидуумов, и один эксперимент проводили с соотношением NK-клеток на 1 клетку Daudi, а другой эксперимент с соотношением 15:1.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к гуманизированным или химерным антителам, полученным из моноклонального антитела мыши HH1.

Гуманизированные или химерные антитела представляют собой антитела из видов, отличных от человека, чьи аминокислотные последовательности были изменены, чтобы увеличить их сходство с вариантами антител, естественно образующимися в организме человека.

Процесс «гуманизации» обычно применяют к моноклональным антителам, разработанным для введения человеку.

Гуманизация может быть необходима, когда процесс разработки специфических антител включает их образование в нечеловеческой иммунной системе (например, в организме мыши).

Белковые последовательности антител, полученных таким образом, частично отличаются от гомологичных антител, естественно образующихся в организме человека, и поэтому являются потенциально иммуногенными при введении человеку.

Не все моноклональные антитела, предназначенные для введения человеку, нужно гуманизировать, так как многие способы лечения являются краткосрочными.

Гуманизация, как правило, рассматривается отдельно от создания химерных антител мышь-человек.

Таким образом, хотя химерное антитело обычно создают для получения антител, более подобных антителам человека (путем замены Fc области антитела мыши, на такую же область из антитела человека) простые химеры такого типа обычно не упоминаются как гуманизированные.

До некоторой степени белковая последовательность гуманизированного антитела, по существу, идентична человеческому варианту, несмотря на нечеловеческое происхождение некоторых из ее участков определяющих комплементарность (CDR), ответственных за способность антитела связываться с его антигеном-мишенью.

Тем не менее, в настоящем контексте термин химерное антитело и гуманизированное антитело используются взаимозаменяемо, как относящиеся к антителу, которое было создано с помощью генной инженерии и получено из моноклонального антитела мыши HH1.

Химерные или гуманизированные антитела, полученные из моноклонального антитела HH1

Тяжелой цепью иммуноглобулина (IgH) является большая полипептидная субъединица антитела (иммуноглобулина).

Типичное антитело состоит из двух тяжелых цепей иммуноглобулина (Ig) и двух легких цепей Ig.

Существует несколько различных типов тяжелой цепи, которые определяют класс или изотип антитела.

Эти типы тяжелой цепи варьируют у различных животных.

Легкая цепь иммуноглобулина является малой полипептидной субъединицей антитела (иммуноглобулина).

У человека есть два типа легких цепей (как и у других млекопитающих), каппа (κ) цепь, кодируемая в каппа-локусе иммуноглобулина на хромосоме 2, и лямбда (λ) цепь, кодируемая в лямбда локусе иммуноглобулина на хромосоме 22.

Антитела производят B-лимфоциты, каждый из которых экспрессирует только один класс легкой цепи.

Будучи полученным однажды, класс легкой цепи остается фиксированным в течение всего срока жизни B-лимфоцита.

У здоровых индивидуумов общее соотношение каппа к лямбда составляет примерно 2:1 в сыворотке крови (измерение общих интактных антител) или 1:1,5, если измерять свободные легкие цепи, сильно отличающееся соотношение свидетельствует о новообразовании.

Точное нормальное соотношение каппа к лямбда находится в диапазоне от 0,26 до 1,65.

Количество и каппа, и лямбда цепей может увеличиваться пропорционально, поддерживая нормальное соотношение.

И вариабельные, и константные цепи химерного или гуманизированного антитела, полученного из моноклонального антитела мыши HH1, могут отличаться от известных последовательностей.

Примеры таких отличий ясны из настоящего изобретения и включают выбор константных цепей, генетические вариации вариабельных цепей и вариации Fc домена, для модулирования эффекторных функций.

Авторы настоящего изобретения используют генноинженерные химерные, гуманизированные антитела, полученные из моноклонального антитела мыши HH1.

Эти антитела демонстрируют перспективный эффект для поиска оптимального лечения связанных с B-клетками злокачественных новообразований.

Эти эффекты проявляются в экспериментах настоящего изобретения.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к молекуле антитела, которое связывается с CD37 человека и которое является производным от а) моноклонального антитела мыши, которое определяется i) вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; и ii) вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или от б) антитела, не являющегося антителом человека, распознающим тот же эпитоп CD37 человека, что и антитело, определенное в а) или распознающим эпитоп, который близок или перекрывается с указанным эпитопом; причем указанная молекула антитела представляет собой химерное или гуманизированное антитело.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является химерное антитело, характеризующееся i) вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; ii) вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, iii) константными тяжелыми и легкими цепями, которые имеют человеческое происхождение.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является химерное антитело, характеризующееся i) константной областью тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из цепей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и ii) константной областью легкой цепи, представляющей собой каппа или лямбда цепь.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является константная область тяжелой цепи, которая определяется как i) содержащая аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7, и в которой константная область легкой цепи ii) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является константная область тяжелой цепи, которая определяется как i) содержащая аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11 и/или SEQ ID NO: 14, и где константная область легкой цепи ii) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13.

Последовательность ДНК полноразмерной тяжелой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 10.

Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи Fc chHH1.3 представлена в SEQ ID NO: 11.

Последовательность ДНК полноразмерной тяжелой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 12.

Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 13.

Последовательность Fc chHH1.3 без мутации (константная область) представлена в SEQ ID NO: 14.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению

Процесс гуманизации основан на том, что получение моноклональных антител может быть осуществлено с применением рекомбинантной ДНК, чтобы создать конструкции, способные к экспрессии в культуре клеток млекопитающих.

То есть, участки генов, способные продуцировать антитела, выделяют и клонируют в клетки, которые могут быть выращены в резервуаре так, что антитела, образованные на основе ДНК клонированных генов, могут быть собраны en masse.

Этап с участием рекомбинантной ДНК обеспечивает удобный момент, который может быть легко использован для изменения аминокислотной последовательности экспрессируемого антитела.

Поэтому изменения в структуре антитела, полученные в процессе гуманизации, осуществляются с помощью методик на уровне ДНК.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к молекуле ДНК, кодирующей гуманизированные или химерные антитела согласно настоящему изобретению.

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является молекула ДНК, кодирующая кодирующую область вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного или химерного антитела согласно настоящему изобретению.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является кодирующая область вариабельной области тяжелой цепи, слитая с областью, кодирующей константную область тяжелой цепи человеческого происхождения.

Такая константная область тяжелой цепи человека может быть выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является IgG1, кодируемый последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является тяжелая цепь IgG3, кодируемая последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является легкая цепь IgG3, кодируемая последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является IgG3 с мутационной заменой H435, кодируемый последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение включает константные области тяжелой цепи человека с одной или несколькими заменами в Fc области.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к молекуле ДНК, содержащей участок, кодирующий вариабельную область легкой цепи химерного или гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению.

Такой участок, кодирующий вариабельную область легкой цепи, может быть слит с областью, кодирующей константную область легкой цепи человеческого происхождения.

Константная область легкой цепи может быть каппа или лямбда цепью.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь каппа кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9.

Молекулы ДНК могут быть сконструированы и оптимизированы для экспрессии в клетке-мишени.

Экспрессионный вектор, также известный как экспрессионная конструкция, в общем, является плазмидой, которая используется для введения определенного гена (в данном контексте молекулы ДНК согласно изобретению) в клетку-мишень.

После того, как экспрессионный вектор оказывается внутри клетки, белок, который кодируется геном, образуется с помощью клеточной транскрипции и трансляционного аппарата рибосомных комплексов.

Плазмида часто бывает создана таким образом, чтобы содержать регуляторные последовательности, которые действуют как энхансерные и промоторные области и приводят к эффективной транскрипции гена, который несет экспрессионный вектор.

Целью применения хорошо разработанного экспрессионного вектора является производство больших количеств стабильной матричной РНК, и, следовательно, белка.

Экспрессионные векторы являются основными инструментами для биотехнологии и производства белков, таких как инсулин, которые важны для медицинского лечения конкретных заболеваний, например, диабета.

После экспрессии генного продукта, требуется очистка белка; а так как вектор вводят в клетку-хозяина, белок интереса должен быть очищен от белков клетки-хозяина.

Поэтому, чтобы сделать процесс очистки более простым, клонированный ген должен иметь метку. Эта метка может быть гистидиновой (His) меткой или любым другим маркерным пептидом.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к экспрессионным векторам, содержащим молекулу ДНК, описанную выше.

Клетки, содержащие и экспрессирующие антитела согласно настоящему изобретению

Описанные выше молекулы ДНК или экспрессионные векторы могут быть введены в клетку-хозяина.

Такие клетки могут, с помощью гибридомной технологии, становиться иммортализованными клетками, которые продуцируют химерные или гуманизированные антитела.

Гибридомная технология является технологией формирования гибридных клеточных линий (называемых гибридомы) путем слияния специфических продуцирующих антитело B-клеток с клеткой миеломы (рак B-клеток), выбранной за ее способность расти в культуре ткани и за отсутствие синтеза цепей антител.

Все антитела, продуцируемые гибридомой, обладают единственной специфичностью и поэтому являются моноклональными антителами (в отличие от поликлональных антител).

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, несущей один или более векторов или молекул ДНК согласно настоящему изобретению.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, несущей экспрессионный вектор, содержащий молекулу ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи HH1, и второй экспрессионный вектор, содержащий молекулу ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи согласно настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин является клеткой млекопитающего.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения клетка является клеткой гибридомы.

Способы получения антител согласно настоящему изобретению

Химерные или гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены несколькими способами.

Один способ получения таких антител включает трансфекцию клетки-хозяина млекопитающего одним или более векторами согласно настоящему изобретению, культивирование клетки-хозяина и выделение и очистку молекулы антитела.

Другой способ получения таких антител включает создание гибридомных клеток, которые продуцируют химерные или гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению.

Идентичность последовательности

Согласно общепринятому определению «идентичность» здесь определяется как идентичность между последовательностями генов или белков на нуклеотидном или аминокислотном уровне, соответственно.

Таким образом, в данном контексте «идентичность последовательности» является мерой идентичности между белками на уровне аминокислот и мерой идентичности между нуклеиновыми кислотами на уровне нуклеотидов.

Идентичность последовательности белка может быть определена путем сравнения аминокислотной последовательности в заданном положении в каждой последовательности, когда последовательности выровнены.

Кроме того, идентичность последовательности нуклеиновой кислоты может быть определена путем сравнения нуклеотидной последовательности в заданном положении в каждой последовательности, когда последовательности выровнены.

Для определения процента идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот или двух аминокислот, последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, в первую аминокислотную или нуклеотидную последовательности могут быть введены разрывы для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравниваются аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях.

Когда позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в данном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных положений/общее число положений (например, перекрывающихся позиций) × 100). В одном варианте осуществления эти две последовательности имеют одинаковую длину.

Можно выровнять последовательности вручную и посчитать количество идентичных нуклеотидов или аминокислот. Альтернативно, выравнивание двух последовательностей для определения процента идентичности может быть осуществлено с использованием математических алгоритмов. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST. Поиск нуклеиновых кислот BLAST может быть осуществлен с помощью программы NBLAST, баллы = 100, длина слова = 12, чтобы получить нуклеотидную последовательность, гомологичную молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Поиск белков BLAST может быть осуществлен с помощью программы XBLAST, баллы = 50, длина слова = 3, чтобы получить аминокислотную последовательность, гомологичную молекуле белка согласно изобретению.

Для получения выравнивания с разрывами для сравнения можно применять Gapped BLAST. Кроме того, для выполнения повторяющегося поиска может быть применен PSI-Blast, который выявляет отдаленные отношения между молекулами. При применении программ NBLAST, XBLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ. См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Кроме того, идентичность последовательности может быть рассчитана после выравнивания последовательностей, например, программой BLAST в базе данных EMBL (www.ncbi.nlm.gov/CGI-BIN/BLAST).

Как правило, для выравнивания могут быть использованы настройки по умолчанию в отношении, например, «матрицы похожести» и «штраф за разрыв». В контексте настоящего изобретения могут быть предпочтительными настройки по умолчанию BLASTN и PSI BLAST.

Процент идентичности между двумя последовательностями может быть определен с применением методик, аналогичных описанным выше, с учетом или без учета разрывов. При расчете процента идентичности учитываются только точные совпадения.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, имеющую 80% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 2) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 4) антитела HH1.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность VH (SEQ ID NO: 2) и/или VL (SEQ ID NO: 4) антитела HH1.

В другом варианте осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 2) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 4) антитела HH1, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности.

Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность, имеющую 80% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 3) антитела HH1.

Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательность VL (SEQ ID NO: 3) антитела HH1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 3) антитела HH1, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эти антитела являются химерными или гуманизированными антителами, полученными из моноклонального антитела HH1.

Генетические изменения

Генетические изменения вызваны изменением порядка оснований в нуклеотидах в генах. Эти изменения вызывают мутации в генах, а затем в белках, которые такие гены кодируют.

Эти мутации могут быть либо смысловыми, либо миссенс-мутациями, либо заменами.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит по меньшей мере 50, например, 20, например, 10, например, 5, например, 4, например, 3, например, 2, например, 1 смысловую мутацию.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит 0-50, например, 1-50, например, 0-20, например, 1-20, например, 0-10, например, 1-10, например, 0-5, например, 1-5, например, 3, например, 1 смысловую мутацию.

Миссенс-мутация (тип несинонимичной мутации) представляет собой точечную мутацию, в которой изменен один нуклеотид, в результате чего образуется кодон, который кодирует другую аминокислоту (мутации, которые изменяют аминокислоту на стоп-кодон называются нонсенс-мутациями, а не миссенс-мутациями). Миссенс-мутация может сделать полученный белок нефункциональным.

Однако не все миссенс-мутации приводят к заметным изменениям белка. Аминокислота может быть заменена аминокислотой с очень сходными химическими свойствами, и в этом случае белок может функционировать нормально; это называется нейтральной, «тихой» или консервативной мутацией.

Альтернативно, замена аминокислоты может произойти в области белка, которая существенно не влияет на вторичную структуру белка или функции. Когда аминокислота может кодироваться более чем одним ко доном (так называемое «вырожденное кодирование») мутация в ко доне может не вызвать никаких изменений при трансляции; это называется синонимичной мутацией (форма молчащей мутации), а не миссенс-мутацией.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит по меньшей мере 50, например, 20, например, 10, например, 5, например, 4, например, 3, например, 2, например, 1 миссенс-мутацию.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит 0-50, например, 1-50, например, 0-20, например, 1-20, например, 0-10, например, 1-10, например, 0-5, например, 1-5, например, 3, например, 1 миссенс-мутацию.

Консервативная замена является заменой одной аминокислоты на другую с примерно аналогичными свойствами так, что общему функционированию, скорее всего, не будет нанесен серьезный ущерб.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения миссенс-мутации являются консервативными мутациями или заменами.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности или полипептидной последовательности с 80% идентичности с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 3) последовательности HH1, где вариантами последовательности являются консервативные замены.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является последовательность, идентичная на 80%, имеющая, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности, где вариантами последовательности являются консервативные замены.

Для того чтобы улучшить этап радиоактивного мечения, может быть выгодно вводить дополнительный лизин в, например, Fc часть химерного или гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению.

Это может уменьшить вероятность присоединения связывающих лизин хелатирующих агентов к антигенсвязывающим сайтам антитела, тем самым снижая риск аномальной иммунореактивности в ходе радиоактивного мечения.

Способы введения лизина в, например, Fc часть HH1 известны в данной области техники, например, в Hemminki et al., 1995.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к радиоиммуноконъюгату согласно настоящему изобретению, который был модифицирован 10 Lys в Fc части HH1, например, 8 Lys, например, 6 Lys, например, 5 Lys, например, 4 Lys, например, 3 Lys, например, 2 Lys, например, 1 Lys.

Могут быть выбраны другие варианты Fc части антител согласно настоящему изобретению с целью оптимизации или модулирования одной или нескольких эффекторных функций.

Эти модуляции эффекторных функций делают, например, чтобы увеличить антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

Такие вариации Fc части известны в данной области.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к антителу согласно настоящему изобретению, которое имеет одну или более мутаций в Fc области, которые модулируют одну или несколько эффекторных функций.

Иммуноконъюгаты

Иммуноконъюгаты являются антителами, конъюгированными (соединенными) со второй молекулой, обычно токсином, радиоизотопом или меткой.

Такие иммуноконъюгаты химерного и гуманизированного HH1 являются всеми аспектами настоящего изобретения.

Один тип является химерным и гуманизированным HH1 согласно настоящему изобретению, соединенным с или связанным с хелатирующим линкером.

Хелатирующие линкеры описаны в приведенном ниже разделе в отношении радиоиммуноконъюгатов, и поэтому хелатирующие линкеры, описанные в нем, считаются удобными для иммуноконъюгатов, содержащих химерное и гуманизированное HH1 согласно настоящему изобретению, соединенное с или связанное с хелатирующим линкером.

Радиоиммуноконъюгаты

Аспект настоящего изобретения относится к радиоиммуноконъюгату, который связывает CD37 человека, содержащему химерное или гуманизированное антитело, полученное из моноклонального антитела HH1 в соответствии с настоящим изобретением, линкер и радионуклид, выбранный из группы, состоящей из

²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc и ¹⁷⁷Lu.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер представляет собой хелатирующий линкер.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения радионуклид является радионуклидом, выбранным из группы, состоящей из ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²²⁷Th и ⁹⁰Y.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения радионуклид является ¹⁷⁷Lu.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения радионуклид является ²¹²Pb.

В еще одном варианте радионуклид является другим бета-излучателем или альфа-излучателем.

Радионуклид может быть присоедин