Мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса и вакцины для иммунизации птиц

Мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса и вакцины для иммунизации птиц

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение, в целом, относится к области получения вакцин. Настоящее изобретение, в особенности, относится к мультивалентным рекомбинантным вирусам герпеса, в которые были вставлены, по меньшей мере, два чужеродных гена, и их применениям для одновременной индукции защитного иммунитета против множества болезней птиц.

Уровень техники

Мясо птицы и яйца служат важными источниками питания, потребление которого непрерывно возрастает в связи с ростом численности населения и их выгодного соотношение цены и качества. Недавняя эпидемия птичьего гриппа сосредоточила общественное внимание на здоровье домашней птицы, а также на безопасности пищевых продуктов и ее обеспечении. Проблемой технологии производства вакцин для птиц озабочены во всем мире.

В качестве птичьей вакцины против целевых патогенов обычно используют вирусные векторы, экспрессирующие патогенные белки. Вакцины, включающие такие вирусные векторы, индуцируют экспрессию чужеродных патогенных белков в инфицированных клетках, и, таким образом, индуцируют соответствующий Т-клеточный иммунитет.

Хорошо известно, что все вирусы герпеса, включая вирус герпеса индейки (HVT) и вирус болезни Марека (MDV), могут постоянно жить в теле зараженного животного в состоянии латентной или хронической инфекции. Следовательно, рекомбинантные вирусы герпеса, в которые включили чужеродный ген, полученный из патогена, были разработаны для применения в качестве вакцин на основе вирусных векторов, увеличивающих продолжительность иммунитета для привитого животного.

Геномная структура HVT, его широкое применение в качестве вакцины против MDV и его способность оставаться неизменным у кур, делают этот вирус привлекательным вектором для получения рекомбинантной птичьей вакцины.

Препараты вакцин были разработаны для достижения эффективной вакцинации птиц с помощью рекомбинантного вируса герпеса, который включает ген, кодирующий чужеродный антиген. Такие вакцинные препараты позволяют проводить вакцинацию как против MDV (вектор), так и против другого заболевания птиц, посредством встроенной последовательности чужеродной ДНК.

Несмотря на то, что такие вакцинные препараты обеспечивают эффективные результаты при вакцинации птиц против многих смертельных заболеваний, между патогенами может существовать конкуренция и иммуносупрессия, если птицам вводят инъекцию с двумя или несколькими рекомбинантными вирусами герпеса, каждый из которых несет отличный ген чужеродного антигена.

Следовательно, в особенности, будут изучены мультивалентные рекомбинантные вирусы герпеса (т.е. несущие, по меньшей мере, два различных гена антигенов) для иммунизации одновременно против различных заболеваний. Однако до сих пор рекомбинантные HVT (rHVT), экспрессирующие множественные чужеродные гены оказывались нестабильными, и все гены или часть чужеродных генов удалялись во время повторяющихся пассажей в культуре клеток. Соответственно, такие нестабильные мультивалентные вирусные векторы не могут быть применены в качестве эффективных вакцин.

Соответственно, существует необходимость в стабильных мультивалентных рекомбинантных вирусных векторах, позволяющих осуществлять совместную экспрессию чужеродных генов в инфицированных клетках.

Раскрытие изобретения

Работа, выполненная заявителем, привела к удивительной находке. Оказалось, что набор определенных сайтов встраивания в геноме вируса герпеса может быть применен для стабильного встраивания и экспрессии двух или нескольких генов антигена, тем самым обеспечивая эффективные мультивалентные вирусные векторы для вакцинации птиц. В частности, заявитель обнаружил, что некоторое число сайтов встраивания может быть одновременно применено для включения разных генов антигена, обеспечивая стабильные мультивалентные рекомбинантные вирусные векторы.

Следовательно, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу птичьего герпеса, который включает, по меньшей мере, две рекомбинантные нуклеотидные последовательности, каждая рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая и экспрессирующая в клетках птиц антигенный пептид, в котором указанные, по меньшей мере, две рекомбинантные нуклеотидные последовательности встроены в отдельные некодирующие области вирусного генома, которые выбирают из области, расположенной между UL44 и UL45, области, расположенной между UL45 и UL46, области, расположенной между US 10 и SORF3, и области, расположенной между SORF3 и US2.

В предпочтительном воплощении, одну рекомбинантную нуклеотидную последовательность встраивают в область, расположенную между UL45 и UL46, и одну рекомбинантную нуклеотидную последовательность встраивают в область, расположенную между UL44 и UL45, между US 10 и SORF3 или между SORF3 и US2. Как проиллюстрировано в заявке, такие рекомбинантные конструкции вируса птичьего герпеса обеспечивают особенно стабильную и эффективную экспрессию двух соответствующих антигенных пептидов в инфицированных клетках птиц.

В особенности, преимущественно, две или несколько рекомбинантных нуклеотидных последовательностей совместно экспрессируются в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF), даже после 10-ти или более пассажей, и преимущественно даже после 15-ти пассажей.

В соответствии с изобретением, рекомбинантные нуклеотидные последовательности преимущественно находятся под контролем определенных промоторов. Промоторы преимущественно выбирают из промотора бета-актина цыпленка (Вас), промотора Рес, предраннего (ie)1 промотора мышиного цитомегаловируса (Mcmv), промотора цитомегаловируса человека (Hcmv), промотора обезьяньего вируса (SV)40 и промотора саркомы Рауса (RSV) или из любых их фрагментов, которые сохраняют активность промотора. Преимущественно, каждая рекомбинантная нуклеотидная последовательность находится под контролем отдельного промотора.

В соответствии с изобретением, чужеродные гены преимущественно выбирают из антигенного пептида птичьего парамиксовируса типа 1, и преимущественно, из белка F вируса болезни Ньюкасла (NDV), антигенного пептида вируса болезни Гамборо, преимущественно, из белка VP2 вируса инфекционного бурсита (IBDV), антигенного пептида вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), преимущественно, из белка gB, антигенного пептида Mycoplasma galisepticum, преимущественно, из белка 40K, и антигенного пептида вируса птичьего гриппа, преимущественно, из поверхностного белка гемагглютинина (НА).

В предпочтительном воплощении, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает первую рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую первый антигенный пептид, встроенную в некодирующую область, расположенную между UL44 и UL45, и вторую рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую второй антигенный пептид, встроенную в некодирующую область, расположенную между UL45 и UL46, между US 10 и SORF3 или между SORF3 и US2.

Еще в одном предпочтительном воплощении, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает первую рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую первый антигенный пептид, встроенную в некодирующую область, расположенную между UL45 и UL46, и вторую рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую второй антигенный пептид, встроенную в некодирующую область, расположенную между US 10 и SORF3, или между SORF3 и US2.

В еще более предпочтительном воплощении, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает первую рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую первый антигенный пептид, встроенную в некодирующую область, расположенную между US 10 и SORF3, и вторую рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую второй антигенный пептид, встроенную в некодирующую область, расположенную между SORF3 и US2.

Дополнительная цель изобретения относится к мультивалютной вакцине для иммунизации таких птиц, как домашняя птица, которая включает эффективное иммунизирующее количество рекомбинантного вируса птичьего герпеса изобретения. Данная вакцина может быть применена для иммунизации таких птиц, как домашняя птица.

Дополнительная цель изобретения относится к антисыворотке, направленной против вируса птичьего герпеса, полученной путем иммунизации птиц эффективным количеством рекомбинантного вируса птичьего герпеса изобретения и извлечения антисыворотки после забора крови у птицы.

Изобретение дополнительно относится к способу иммунизации птицы, включающему введение указанной птице эффективного иммунизирующего количества вакцины в соответствии с изобретением.

Изобретение дополнительно обеспечивает набор для вакцинации для иммунизации птиц, который включает эффективное количество вакцины изобретения, и средства для введения указанных компонентов указанным видам.

Изобретение может быть применено у любой птицы для вакцинации против любого патогена птиц.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 иллюстрирует схему генома HVT. Выделено местоположение уникальной длинной области (Unique Long (UL)) 44, UL45 и UL46 и местоположение уникальной короткой области (Unique Short (US)) 10, SORF3 и US2. Рекомбинантные нуклеотидные последовательности могут быть вставлены в созданные с помощью ПЦР сайты SfiI между UL44 и UL45, и/или между UL45 и UL46, и/или между US 10 и SORF3, и/или между S0RF3 и US2.

Фигуры 2А и 2В иллюстрируют схему генома HVT, суммирующую различные кластеры нуклеотидных последовательностей и промоторов, в соответствии с конкретными воплощениями изобретения.

Фигура 3 показывает иммунофлуоресцентное окрашивание клеток CEF, инфицированных двойным рекомбинантным HVT в соответствии с воплощениями изобретения (FW129 и FW141), совместно экспрессирующим NDV-F и IBDV-VP2 (клетки, инфицированные rHVT/ND/IBD). Экспрессию белка VP2 детектировали с помощью антител к VP2 Mab (R63) и Alexa Flour 546. Экспрессию белка F детектировали с помощью анти-F #35 кроличьей сыворотки и Alexa Flour 488. Результаты показали, что обе клетки, инфицированные FW129 или FW141, экспрессируют как встроенный белок NDV-F, так и встроенный белок EBDV-VP2.

Фигуры 4А и 4В представляют результаты анализа по методу вестерн-блоттинга, показывающие экспрессию белка VP2 и/или белка F в клетках CEF, инфицированных rHVT изобретения. Как показано на фигуре 4А, полосу белка с массой 60 килодальтон (кДа) наблюдали только на дорожке с клетками, инфицированными rHVT/ND/IBD, что представляет собой ожидаемый размер белка F . На дорожке rHVT/44-45BacVP2 (FW123) полосы не было. Как показано на фигуре 4 В, белок VP2 наблюдали в районе 38-ми килодальтон (kd) на дорожках каждого rHVT/NEVIBD . Напротив, на дорожке rHVT/45-46 PecF (FW029) полосы не было. Белок с молекулярной массой 38-kd представляет собой зрелый белок VP2 (A.A. Azad et al., 1987, Virol. 161: 145-152, K.J., Fahey et al., 1985 J. Gen. Virol. 66: 1479-1488). Двойные rHVT изобретения экспрессировали как NDV-F, так и IBDV-VP2.

Фигуры от 5А до 5D показывают результаты анализа по методу саузерн-блоттинга для проверки структуры генома очищенного FW129 (rHVT/45-46 pecF/44-45 Rsv VP2), видно то, что двойной рекомбинантный HVT/ND/IBD изобретения имел ожидаемую геномную структуру. Конкретнее, результаты саузерн-блоттинга показали, что

- 2077-п.о. фрагмент гибридизовался с зондом VP2 в ДНК каждого двойного рекомбинантного HVT FW129 (колонки 1,2 и 3 фигура 5А). Напротив, никакой полосы не обнаружили в р45/46Рес F (фигура 5А);

- 2744-п.о. фрагмент гибридизовался с зондом F в ДНК каждого двойного рекомбинантного HVT FW129 (колонки 1, 2 и 3 фигура 5С). В р45/46 SfiI никакой полосы не обнаружили;

- 2077-п.о. и 1228-п.о. фрагменты гибридизовались с зондом IS44/45 в ДНК каждого двойного рекомбинантного HVT FW129 (колонки 1, 2 и 3 на фигуре 5В). Для маркера молекулярных масс, HindIII гидролизата фага лямда, никакой полосы не обнаружили (колонка М на фигуре 5В);

- 2744-п.о. и 770-п.о. фрагменты гибридизовались с зондом IS45/46 в ДНК каждого двойного рекомбинантного HVT FW129 (колонки 1,2 и 3 на фигуре 5D).

Фигуры 6А и 6В показывают результаты анализа по методу вестерн-блоттинга для проверки стабильности рекомбинантного HVT FW129 в последовательных пассажах, указывающие на то, что после 15-ти пассажей белок F и белок VP2 стабильно экспрессируются в CEF, инфицированных rHVT FW129 изобретения.

Фигуры от 7А до 7D показывают результаты анализа по методу саузерн-блоттинга для проверки стабильности рекомбинантного HVT после 15-ти пассажей (фигура 7А). Результаты саузерн-блоттинга показали, что 2077-п.о. фрагмент гибридизовался с зондом VP2 в ДНК из FW129. 2334-п.о. фрагмент гибридизовался с зондом VP2 в ДНК из FW130. Напротив, никакой полосы не детектировали с р45/46Рес F (фигура 7С). Результаты саузерн-блоттинга показали, что 2744-п.о. фрагмент гибридизовался с F-зондом в ДНК каждого двойного рекомбинантного HVT FW129 и FW130. В р45/46 SfiI никакой полосы не обнаружили (фигура 7В). Результаты саузерн-блоттинга показали, что 2077-п.о. и 1228-п.о. фрагменты гибридизовались с зондом IS44/45 в ДНК из FW129, и что 2334-п.о. и 1022-п.о. фрагменты гибридизовались с зондом IS44/45 в ДНК из FW130. 1350-п.о. фрагмент гибридизовался с зондом IS44/45 в р45/46 PecF, который не содержал ген в сайте IS44/45 (фигура 7D). Результаты саузерн-блоттинга показали, что фрагменты 2744-п.о. и 770-п.о. гибридизовались с зондом IS45/46 в ДНК каждого двойного рекомбинантного HVT FW129 и FW130. Саузерн-блот с зондом 44/45 и зондом 45/46 показал, что ген VP2 или ген F стабильно сохраняется в сайте встраивания 44/45 или 45/46, соответственно в FW129 и FW130. Данные результаты показывают, что после 15-ти пассажей белок F и белок VP2 стабильно экспрессируются в CEF, инфицированных rHVT FW129 изобретения.

Фигуры 8А и 8В показывают сравнительные результаты для анти-NDV титров (фигура 8А) и анти-IBDV титров (фигура 8В), полученных от цыплят, зараженных двойным рекомбинантным HVT (FW122, FW137, FW129, FW130, FW135), по сравнению с титрами, полученными из цыплят, зараженных одиночным рекомбинантным HVT (FW029 и FW023, соответственно).

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение, в целом, относится к мультивалентным рекомбинантным вирусам герпеса и их применению для одновременной иммунизации птиц против, по меньшей мере, двух заболеваний. В соответствии с изобретением, последовательности чужеродной ДНК, в основном, встраивают в сайты встраивания внутри генома rHV, обеспечивая стабильные и эффективные конструкции, подходящие для применения в композициях или способах для вакцинации.

Настоящее изобретение будет более понятно при отсылке к следующим определениям:

Определения

В контексте изобретения, термин «реконструированные» или «рекомбинантные» по отношению к последовательности, обозначает последовательность, нуклеиновую кислоту или единицу, которая не существуют в природе и/или которая была разработана с помощью технологии рекомбинантной ДНК (также называемой генным клонированием или молекулярным клонированием).

Термин «рекомбинантный» по отношению к вирусу герпеса относится к вирусу герпеса, геном которого был модифицирован вставкой, по меньшей мере, одной гетерологичной нуклеиновой кислоты, т.е. нуклеиновой кислоты (например, ДНК), которая не обнаружена в природе в геноме вируса герпеса, или которая обнаружена в природе в указанном геноме, но в другой форме или в другом положении. Следует понимать, что рекомбинантный вирус герпеса может быть произведен с помощью различных способов, и, будучи однажды создан, может быть воспроизведен без применения дополнительных технологии рекомбинантной ДНК. Следовательно, структура «рекомбинантного вируса герпеса» описывается в терминах ДНК-вставки.

В настоящем описании, термины «нуклеиновая кислота», «последовательность нуклеотидов» и «нуклеотидная последовательность» применяют взаимозаменяемо, и они относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей определенную последовательность, которая может представлять собой дезоксирибонуклеотиды и/или рибонуклеотиды. Исходно, нуклеотидная последовательность может быть получена, например, с помощью рекомбинантных, энзиматических и/или химических технологий, и в дальнейшем реплицирована в клетке-хозяине или в системе in vitro. Нуклеотидная последовательность преимущественно включает открытую рамку считывания, кодирующую пептид. Нуклеотидная последовательность может содержать дополнительные последовательности, такие как терминатор транскрипции, сигнальный пептид, IRES, интрон и т.п. Предпочтительно, открытая рамка считывание в рекомбинантной нуклеиновой кислоте не содержит интрон.

Термин «нетранслируемая область», как применен в настоящем документе, относится к области нуклеотидов, которая не имеет ORF и не определяет аминокислотную последовательность белка, которую следует экспрессировать путем трансляции, или к области нуклеотидов, в которой ORF не принимает участия ни в транскрипции, ни в трансляции или ни в экспрессии белка.

Термин «птицы» предназначен для обозначения всех птиц, таких как птицы класса Aves, т.е. позвоночных животных, которые представляют собой пернатых, крылатых, двуногих, эндотермических и яйцекладущих животных. В контексте изобретения, термин птицы (avians) или птицы (avian species) относится, в частности, к птицам, представляющими экономический и/или агрономический интерес, таким как домашняя птица (такие как куры и индейки), водоплавающие птицы (такие как утки и гуси) и декоративные птицы (такие как лебеди и попугаи).

Термин «вакцина», как применен в настоящем документе, обозначает средство, которое может быть применено для того, чтобы вызывать, стимулировать, или усиливать иммунный ответ в организме.

Вирусы

Вирусы, для применения в настоящем изобретении, представляют собой такие вирусы, которые относятся, в основном, к роду вирусов птичьего герпеса.

Например, вирусы птичьего герпеса для применения в настоящем изобретении включают без ограничений вирусы герпеса индейки (HVT), вирус болезни Марека, серотип 2, предпочтительно, штамм SB1 вируса болезни Марека, серотип 2, или вирус болезни Марека, серотип 1, предпочтительно штамм CVI988/Rispens вируса болезни Марека, серотип 1. Предпочтительные вирусы герпеса изобретения получают из серотипов или штаммов, которые непатогенны для целевых птиц.

Мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса

Цель изобретения относится к рекомбинантным вирусам птичьего герпеса, подходящим для иммунизации птиц против, по меньшей мере, двух заболеваний, с усовершенствованной стабильностью при многократных пассажах. Авторами изобретения были установлены конкретные сайты встраивания, которые, в комбинациях, обеспечивают усовершенствованную стабильность для генов чужеродного антигена.

Цель изобретения, следовательно, относится к рекомбинантному вирусу птичьего герпеса, который включает, по меньшей мере, две рекомбинантные нуклеотидные последовательности, каждая рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая отдельный антигенный пептид, в котором указанные, по меньшей мере, две рекомбинантные нуклеотидные последовательности встраивают в отдельные некодирующие области вирусного генома, выбираемые из области, расположенной между UL44 и UL45, области, расположенной между UL45 и UL46, области, расположенной между US 10 и SORF3, и области, расположенной между SORF3 и US2.

Местоположение указанных некодирующих областей известно в этой области техники и может быть найдено, например, в работе Kingham et al. («The genome of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek's disease viruses)} - Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135).

Например, путем отсылки к полному геному FC126 (код доступа в Банке генов: AF291866,1), область, расположенная между UL44 и UL45, соответствует нуклеоидам 94243-94683 генома HVT, область, расположенная между UL45 и UL46 соответствует нуклеоидам 95323-95443 генома HVT, область, расположенная между US 10 и SORF3 соответствует нуклеоидам 138688-138825 генома HVT, и область, расположенная между SORF3 и US2, соответствует нуклеоидам 139867-140064 генома HVT.

Нуклеиновая кислота, представляющая интерес для вставки в геном вируса герпеса, может быть гомологичной или гетерологичной по отношению к вирусу герпеса. Нуклеиновая кислота обычно кодирует антиген из патогена и может быть извлечена или получена из любого патогенного организма, способного вызывать инфекцию у птиц. Обычно, клонированные нуклеиновые кислоты получают из патогенов, которые вызывают заболевания, имеющие экономическое влияние на птицеводство. Примеры патогенов, вызывающих инфекцию у птиц, включают вирусы, бактерии, грибы, простейшие и т.п.

Таким образом, гомологичная или гетерологичная нуклеотидная последовательность для вставки в вирусный геном может представлять собой любую последовательность, кодирующую антигенный пептид птичьего возбудителя заболевания. Последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением может быть получена из любого источника, например, вирусного, прокариотического, эукариотического или путем синтеза. Обычно, нуклеотидные последовательности кодируют иммуногенный пептид патогена, и, предпочтительно, представляющий собой поверхностные белки, секретируемые белки или структурные белки указанного патогена или их фрагменты.

Нуклеотидная последовательность может кодировать, например, антигенный пептид, полученный из вируса птичьего гриппа, птичьего парамиксовируса типа 1, также называемого вирусом болезни Ньюкасла (NDV), птичьего метапневмовируса, вируса болезни Марека, вируса болезни Гамборо, также называемого вирусом инфекционного бурсита (IBDV), вируса инфекционного ларинготрахеита (ILVT), вируса инфекционного бронхита (IBV), Escherichia coli, видов Salmonella, Pasteurella multocida, Riemerella anatipestifer, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, микроорганизмов, относящихся к Mycoplasmas, заражающих птиц, или кокцидиев.

Преимущественно, нуклеотидные последовательности, встроенные в вирусный геном, выбирают из белка F из NDV, белка VP2 из IBDV, белка gB из ILTV, белка 40K из Mycoplasma galisepticum, и поверхностного бежа гемагглютинин (НА) вируса птичьего гриппа.

Различные комбинации антигенных пептидов могут представлять большой интерес, в зависимости от нескольких факторов, таких как вид птицы, страна выращивания, условия выращивания и т.п.

Например, в воплощении, мультивалентный рекомбинантный вирус птичьего герпеса изобретения включает в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV.

В соответствии с особым воплощением, в вирусный геном могут быть встроены три или более нуклеотидные последовательности.

Рекомбинантный вирус герпеса изобретения может экспрессировать два или более антигена из одного и того же патогена.

Гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности, которые кодируют представляющие интерес антигены, могут быть функционально связаны с промотором и в дальнейшем встроены в вирусный геном. Применяемый промотор может представлять собой как синтетический, так и природный, эндогенный или гетерологичный промотор.

Промотор не ограничивают, до тех пор, пока он может эффективно функционировать в клетках птиц, инфицированных rHVT. Следовательно, выбор промотора распространяется на любой эукариотический, прокариотический или вирусный промотор, способный направлять транскрипцию гена в клетках птиц, зараженных rHVT.

Преимущественно, промоторы выбирают из промотора бета-актина цыпленка (Вас), промотора Рес, промотора мышиного цитомегаловируса (Mcmv) ie1, промотора цитомегаловируса человека (Hcmv), промотора обезьяньего вируса (SV)40 и промотора саркомы Рауса (RSV), или любых их фрагментов, которые сохраняют активность промотора.

Последовательность нуклеиновой кислоты куриного Вас-промотора приведена в SEQ ID NO: 1, последовательность промотора Рес приведена в SEQ ID NO: 2, последовательность промотора Mcmv ie1 приведена в SEQ ID NO: 3, последовательность промотора Hcmv приведена в SEQ ID NO: 4, последовательность промотора SV40 приведена в SEQ ID NO: 5, и последовательность промотора RSV приведена в SEQ ID NO: 6.

Следует отметить, что варианты таких последовательностей, кодирующих функциональные промоторы, известны и/или могут быть

сконструированы/протестированы специалистом, для применения в настоящем изобретении.

В предпочтительном рекомбинантном вирусе герпеса изобретения, по меньшей мере, одна из нуклеиновых кислот включает промотор Рес или Вас для управления экспрессией антигенного пептида.

Мультивалентная конструкция

Клонирование генов и конструирование плазмид хорошо известны специалисту в этой области техники и могут быть по существу выполнены с помощью стандартных методов молекулярной биологии (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, N.Y. 2001).

Для того чтобы конструировать мультивалентный рекомбинантный вирус герпеса настоящего изобретения, первоначально вирус герпеса размножают в подходящей клетке-хозяине и затем получают геномную ДНК. Хозяин и условия для размножения вируса выбирают в зависимости от обстоятельств. В качестве клеток-хозяев, предпочтительны клетки, полученные из кур, и могут быть применены клетки CEF (фибробласты куриного эмбриона), клетки куриных почек и т.п.Их можно культивировать в такой культуральной среде, как MEM Игла, культуральная среда Лейбовица-Е-15/МакКоя 5А (смесь 1:1), при примерно 37°С в течение от 3-х до 4-х дней.

ДНК экстрагируют из инфицированных вирусом клеток, культивированных, как описано выше, в соответствии с традиционным способом. После денатурации в буфере для лизиса и удаления бежа, ДНК экстрагируют фенолом и этанолом.

Обычно, рекомбинантные вирусы могут быть получены путем гомологичной рекомбинации между вирусным геномом и конструкцией (например, плазмидой), включающей нуклеиновую кислоту, которую предполагается вставить, фланкированную нуклеотидами из сайта встраивания, чтобы позволить рекомбинацию.

Плазмида с последовательностью сайта встраивания

Одной из возможностей для вставки чужеродного гена в одну из нетранслируемых областей вирусного генома в соответствии с изобретением может быть исходное клонирование последовательности, содержащей целевую нетранслируемую область, в плазмиду, или в другой подходящий вектор. В соответствии с изобретением, такую последовательность выбирают из последовательности области, расположенной между UL44 и UL45, последовательности области, расположенной между UL45 и UL46, последовательности области, расположенной между US 10 и SORF3, и последовательности области, расположенной между SORF3 и US2.

Примеры плазмид включают pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 и pUC9, примеры фагов включают фаг лямбда и фаг М13, и пример космид включает рНС79.

Последовательность нетранслируемой области встраивают в плазмиду в соответствии с традиционным способом клонирования. Последовательности области вставки предпочтительно имеют достаточную длину, так что после вставки нуклеиновой кислоты, последовательности, которые фланкируют нуклеиновую кислоту, имеют соответствующую длину, такую, чтобы обеспечить гомологичную рекомбинацию с вирусным геном in vivo. Предпочтительно, фланкирующие последовательности должны иметь, по меньшей мере, приблизительно 50 нуклеотидов в длину.

Для того чтобы вставить одну чужеродную последовательность или несколько чужеродных последовательностей в нетранслируемую область, в определенном сайте может быть выполнена мутация нетранслируемой области с получением нового сайта расщепления для ферментов рестрикции. Способ осуществления мутации может представлять собой традиционный способ, и может быть применен способ, обычно применяемый специалистом в этой области техники, такой как in vitro мутагенез и ПЦР. Так, в способе ПЦР, осуществляют такую мутацию, как делеция, замещение или присоединение 1-2 нуклеотидов в ПЦР праймер, и затем этот праймер применяют для создания мутации.

Плазмида, дополнительно содержащая целевую чужеродную нуклеотидную последовательность (целевые чужеродные нуклеотидные последовательности)

Нуклеотидные и промоторные последовательности, для вставки в вирус, далее встраивают в область вставки вирусного генома в плазмиде.

Более конкретно, нуклеотидные и промоторные последовательности вводят во фрагмент геномной ДНК вируса герпеса, содержащий последовательности области вставки, субклонированные в плазмиде.

При необходимости, может быть получена плазмида, которая содержит две или более последовательности чужеродной нуклеиновой кислоты, например, полученные от одного и того же или от различных патогенов, указанные последовательности фланкированы последовательностями области вставки, как описаны в настоящем документе.

Вирусный геном, включающий чужеродную нуклеотидную последовательность в сайте встраивания

Плазмиды, в которых, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность встроена в нетранслируемую область, полученную как описано выше, могут быть введены в HVT-инфицированную клетку или в клетки, транфицированные геном НУТ, с помощью электропорации, фосфата кальция, способа с применением липофектина или подобных способов. Если количество плазмиды, предназначенной для введения, находится в диапазоне от 0,1 до 1000 мкг, то в клетках эффективность образования рекомбинантных вирусов в результате рекомбинации между гомологичными областями HVT-ДНК и плазмидой становится высокой.

Получение мультивалентных рекомбинантных вирусов герпеса

Мультивалент изобретения может быть получен путем совместной трансфекции в той же клеточной культуре плазмиды, содержащей, как описано выше, последовательность сайта встраивания, в которую встраивают чужеродную нуклеотидную последовательность, и рекомбинантный вирус герпеса, содержащий, как описано выше, тот же сайт встраивания, свободный от чужеродной нуклеотидной последовательности, и второй сайт встраивания, в который встраивают отличную чужеродную нуклеотидную последовательность. Данная совместная трансфекция приводит к рекомбинации плазмидной ДНК в вирусный геном.

Другим способом, мультивалент изобретения может быть получен путем совместной трансфекции той же клеточной культуре двух плазмид, каждая из которых содержит отличную последовательность сайта встраивания, в которую встраивают отличную чужеродную нуклеотидную последовательность, и вирус герпеса, содержащий, как описано выше, те же сайты встраивания, свободные от чужеродной нуклеотидной последовательности. Совместная трансфекция приводит к рекомбинации обеих плазмидных ДНК в вирусный геном.

Полученный мультивалентный рекомбинантный вирус может быть выбран генотипически или фенотипически с помощью известных методик отбора, например, путем гибридизации, определения ферментативной активности, кодируемой геном, совместно интегрированным вместе с последовательностями рекомбинантных нуклеиновых кислот, или детектированием антигенного пептида, экспрессированного рекомбинантным вирусом герпеса иммунологически. Выбранный рекомбинантный вирус герпеса может быть культивирован в большом масштабе в клеточной культуре, после чего рекомбинантный вирус герпеса, содержащий пептиды, может быть собран.

Предпочтительные мультивалентные конструкции

Задача изобретения заключается в предложении мультивалентных рекомбинантных вирусов герпеса, в которых присутствуют, по меньшей мере, две чужеродные нуклеотидные последовательности, каждая из которых подходящим способом встроена в конкретный сайт встраивания, для кодирования и экспрессии соответствующих антигенных пептидов в клетках птиц.

Среди множества возможных воплощений, основанных на комбинации целевых сайтов встраивания и предпочтительных рекомбинантных нуклеотидных последовательностях, и, необязательно, на предпочтительных промоторах, заявитель неожиданно обнаружил, что конкретные комбинации демонстрируют высокий уровень стабильности, позволяющий применять их для получения усовершенствованных мультивалентных вакцин.

Основанная на этом замечании, цель изобретения заключается в предложении специфических мультивалентных рекомбинантных вирусов птичьего герпеса с высоким уровнем стабильности.

Предпочтительные мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса изобретения включают две рекомбинантные нуклеотидные последовательности, каждая рекомбинантная нуклеотидная последовательность, кодирующая отдельный антигенный пептид и встроенная в отдельную некодирующую область вирусного генома, выбираемую из области, расположенной между UL44 и UL45, области, расположенной между UL45 и UL46, области, расположенной между US 10 и SORF3, и области, расположенной между SORF3 и US2.

Предпочтительные антигенные пептиды изобретения выбирают из белка F из NDV, белка VP2 из IBDV, белка gB из ILTV, белка 40K из Mycoplasma galisepticum и поверхностного бежа НА вируса птичьего гриппа.

Преимущественно, промоторы, применяемые с нуклеотидными последовательностями, встроенными в сайт встраивания между UL44 и UL45, выбирают из промотора Рес, промотора Mcmv ie1, промотора Hcmv, промотора SV40 и промотора RSV, или из любых их фрагментов, которые сохраняют активность промотора. Действительно, заявитель неожиданно обнаружил, что Вас-промотор, встроенный между UL44 и UL45, не дает стабильной экспрессии чужеродного гена. Однако Вас-промотор, встроенный в область между UL45 и UL46, действительно обеспечивает стабильную экспрессию.

В соответствии с первым воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает встроенную между UL45 и UL46 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Рес, и, встроенную между UL44 и UL45 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора SV40 (FW130).

В соответствии со вторым воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает в сайте встраивания между UL45 и UL46 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Рес, и в сайте встраивания между UL44 и UL45 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора RSV (FW129).

В соответствии с третьим воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает в сайте встраивания между UL45 и UL46 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Рес, и в сайте встраивания между UL44 и UL45 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Mcmv ie1 (FW141).

В соответствии с четвертым воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает в сайте встраивания между UL45 и UL46 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Рес, и в сайте встраивания между SORF3 и US2 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Mcmv ie1 (FW144).

В соответствии с пятым воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает в сайте встраивания между UL45 и UL46 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Рес, и в сайте встраивания между SORF3 и US2 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Вас (FW146).

В соответствии с шестым воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает в сайте встраивания между UL44 и UL45 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Рес, и в сайте встраивания между UL45 и UL46 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Mcmv ie1 (FW143).

В соответствии с седьмым воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает в сайте встраивания между UL44 и UL45 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F из NDV, или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Mcmv ie1, и в сайте встраивания между UL45 и UL46 рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 из IBDV или его фрагмент, преимущественно под контролем промотора Вас (FW142).

В соответствии с восьмым воплощением, рекомбинантный вирус птичьего герпеса включает в сайте встраивания ме