Получение вирусного вектора

Получение вирусного вектора

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Эта заявка является родственной, и по ней испрашивается приоритет австралийской патентной заявки № 2013904242, поданной 1-го ноября 2013 года, и австралийской патентной заявке № 2014900370, поданной 7-го февраля 2014 года, причем полное содержание каждой из этих заявок включено в настоящее описание путем ссылки.

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Настоящее изобретение относится к получению клеток и клеточных линий, пригодных для размножения и, следовательно, получения лекарственных средств на основе поксвирусов (вирусов оспы). В частности, описание относится к рекомбинантным модифицированным клеточным субстратам для размножения таких поксвирусов для получения терапевтических или профилактических средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Библиографические данные ссылок в описании изобретения приведены в конце описания.

[0004] Ссылка в этом описании на какую-либо предшествующую публикацию (или информацию, полученную из нее) или на любые известные данные не является и не должна приниматься в качестве подтверждения или принятия или в какой-либо форме предположения о том, что предшествующая публикация (или информация, полученная из нее) или известные данные образуют часть общих сведений в области деятельности, к которой относится это описание.

[0005] Все публикации, указанные в этом описании, полностью включены в него путем ссылки.

[0006] Семейство поксвирусов включает два подсемейства, Chordopoxvirinae и Entomopaxvirnae. Подсемейство Chordopoxvirinae включает восемь родов, в том числе род Orthopoxviridae, включающий виды, которые инфицируют человека (например, вирус натуральной оспы, являющийся возбудителем оспы, вирус коровьей оспы (который являлся основой первой осповакцины, созданной Дженнером в 1796 году), вирус осповакцины (используемый в качестве вакцины второго поколения против оспы) и вирус оспы обезьян), и вирусы рода Avipoxviridae, включающего виды, которые инфицируют птиц, такие как вирусы оспы домашней птицы и оспы птиц. В дополнение к их использованию в качестве антигенов в осповакцине большой интерес проявляется к использованию рекомбинантных вирусов на основе осповакцины и вирусов оспы птиц в качестве «каркасных» векторов. В качестве цитоплазматических векторов вирусы Orihopoxviridae, в частности, способны доставлять чужеродные антигены в цитоплазму хозяина и к путям процессинга антигенов, которые процессируют антигены до пептидов для представления на поверхности клетки. Такие векторы, экспрессирующие чужеродные антигены, используются в создании вакцин против таких болезней, как СПИД, туберкулез, малярия и рак, которые, как показала практика, трудно поддаются лечению с помощью других стратегий вакцинации.

[0007] Подсемейство Chordopoxvirinae имеет двухцепочечные ДНК-геномы с размером в диапазоне от 130 т.п.о. у парапоксвирусов до более чем 300 т.п.о. у авипоксивирусов, и их жизненный цикл в хозяине полностью проходит в цитоплазме клетки-хозяина. Поксвирусы существуют по существу независимо от их клетки-хозяина и молекул клетки-хозяина, особенно, в отношении процессов, участвующих в синтезе ранних мРНК. Однако молекулы клетки-хозяина, по-видимому, используются в инициации или терминации промежуточной и поздней вирусной транскрипции. Поксвирусы продуцируют структурно разнообразные «факторы видоспецифичности (определяющие диапазон хозяев)», которые специально направлены на сигнальные пути хозяина и манипулируют ими, обеспечивая условия в клетке, позволяющие репликацию вируса. Большинство поксвирусов может связываться и заражать клетки млекопитающих, но является ли инфекция пермиссивной (способной к продукции инфекционных вирионов) или непермиссивной (по существу не в состоянии продуцировать инфекционные вирионы) зависит от конкретных поксвируса и типа клеток. В настоящее время существует относительно мало информации о взаимодействии на молекулярном уровне между вирусами оспы и клеткой-хозяином, в частности, о генах видоспецифичности и о том, какие факторы необходимы для регуляции взаимодействий, чтобы облегчить размножение и вируса и клеток. Обзор видоспецифичных генов приведен в статье Werden et al. 2008, полностью включенной в это описание.

[0008] Данные о штаммах осповакцины, важные в отношении применения в качестве противооспенных вакцин и впоследствии в качестве вирусных векторов, публикуются с начала 1960 гг. до наших дней. Некоторые штаммы вируса осповакцины, включая штаммы, используемые в качестве противооспенных вакцин, способны размножаться в клетках человека и поэтому представляют опасность для здоровья, например, вследствие развития вирусного энцефалита. С целью разработки более безопасной вакцины штамм осповакцины из Анкары (названный «CVA») был перепассирован более 500 раз в клетках, не принадлежащих человеку. В ходе этого процесса геном вируса осповакцины существенно изменился, включая возникновение по меньшей мере шести крупных делеций по сравнению с первоначальным геномом CVA. Модифицированный вирус стал менее патогенным для человека, но все еще в состоянии индуцировать защитный иммунный ответ. Этот аттенуированный вирус осповакцины указывается как MVA (модифицированный вирус осповакцины Анкара) и также классифицируются по количеству пассажей, поскольку было установлено, что вирусы с различным числом пассажей генетически и фенотипически отличаются. Однако, к 515-му пассажу стало понятно, что MVA515 является генетически стабильным. В начале 1990-х годов было отмечено, что штаммы MVA, такие MVA572 и его производное, MVA F6, могли экспрессировать белки вируса осповакцины и гетерологичные (рекомбинантные) белки на высоком уровне в непермиссивных клетках (в которых вирус не будет размножаться), позволяя разрабатывать MVA в качестве вектора для гетерологичных молекул, представляющих интерес, таких, как молекулы, кодирующие антигены для вакцин или для терапевтической доставки.

[0009] Позднее были предприняты попытки получения модифицированного вируса осповакцины с характеристиками MVA путем введения шести больших известных делеций MVA в CVA. Следует отметить, что они не дали вируса с аттенуированными свойствами MVA. Было высказано предположение, что отсутствие видоспецифичных генов может отвечать за наблюдаемую аттенуацию, однако это не было обосновано (см., например, Meyer et al., Journal of General Virology (1991) 72:1031-1038).

[0010] Поксвирусы составляют большое семейство вирусов, характеризующееся большим линейным дцДНК-геномом, размножением в цитоплазме и сложной морфологией вириона. Вирус осповакцины является типичным представителем этой группы вирусов и наиболее изученным с точки зрения вирусного морфогенеза. Вирионы вируса осповакцины появляются в виде «прямоугольных» или «овальных» мембраносвязанных частиц со сложной внутренней структурой, включающей окруженное стенкой двояковыпуклое ядро, с расположенными по бокам «боковыми тельцами». Путь сборки вирионов включает образование мембраносодержащих полумесяцев, из которых развиваются незрелые вирионы (IV), а затем превращаются в зрелые вирионы (MV). Более 70 уникальных генных продуктов содержатся в вирионе вируса осповакцины, для которых теперь описаны действие на сборку вируса осповакцины мутаций более чем в 50 генах.

[0011] Вирус осповакцины проникает в клетки путем слияния своих поверхностных мембран с плазматической мембраной клетки-хозяина, высвобождая ядро (и боковые тельца) в цитоплазму, и активируя транскрипционную программу вируса. Ядра вирионов содержат полный набор кодируемых вирусом ферментов, необходимых для синтеза и модификации ранней мРНК. Ранние гены кодируют ферменты, необходимые для размножения ДНК, и поэтому, по мере достижения максимума экспрессии ранних генов начинается размножение вирусной ДНК в цитоплазматических сайтах, называемых «фабриками». Ранние гены также кодируют промежуточные факторы транскрипции, а промежуточные гены, в свою очередь, кодируют поздние факторы транскрипции, так что промежуточные и поздние гены экспрессируются последовательно после уже начавшегося размножения вирусной ДНК. Таким образом, полный набор вирусных генов транскрибируются по определенной схеме, в которой ранние, промежуточные и поздние классы генов отличаются класс-специфичными промоторами и кодируемыми вирусом факторами транскрипции. Кроме того, только размножающиеся геномы является подходящими матрицами для событий промежуточной и поздней транскрипции. Эти два класса генов совместно кодируют структурные белки вириона, ферменты вириона, а также факторы, участвующие в сборке частиц и необходимые для сборки новых вирусных частиц.

[0012] Вскоре после поглощения клеткой вируса и ранней экспрессии внутри клетки образуются специфичные для инфекции цитоплазматические домены, имеющие однородную плотность и иногда окруженные цистернами, образуемыми эндоплазматическим ретикулумом (ER), которые со временем увеличиваются в размерах. Эти домены представляют собой участки размножения вирусной ДНК и часто называются «вирусными фабриками».

[0013] Сборка вируса начинается с образования жестких серповидных структур (чашеобразных) в вирусных фабриках. На электронных микрофотографиях с высоким разрешением видно, что внешний слой этих серповидных структур состоит из регулярно расположенных выступов, называемых «спикулами». Полумесяцы, по-видимому, увеличиваются в длину, сохраняя ту же степень кривизны, пока они не станут замкнутыми кольцами (сферами в пространстве), называемыми незрелыми вирионами (IV). IV заполнены «вироплазматическим» веществом, которое является однородным по плотности, но ощутимо более электроноплотным по сравнению с окружающей фабрикой. По мере образования IV также происходит поглощение инкапсулированной ДНК: она видна на электронных микрофотографиях как электронноплотный круглый или яйцевидный субдомен в IV, называемый «нуклеоидом». IV, которые содержат нуклеоиды из конденсированной ДНК часто называются «IVN». Для морфогенеза IVN в созревшие вирионы (MV) требуется созревание нескольких предшественников вирионных белков посредством протеолитического расщепления. Большинство зрелых вирионов находятся вне фабрик и могут существовать в кластерах либо на периферии фабрики либо, по-видимому, на значительном расстоянии от ближайшей фабрики.

[0014] Поксвирусные вирионы существуют в трех инфекционных формах: созревшие вирионы (MV), вирионы в оболочке (WV) и внеклеточные вирионы (EV). MV, самая простая форма вируса, представляют собой окруженные мембраной частицы, содержащие двояковыпуклое ядро, с расположенными по бокам «боковыми тельцами», которые заполняют впадины ядра. В норме MV находятся исключительно внутри клеток и высвобождаются только в результате лизиса клеток. WV состоят из MV, которые окружены двумя дополнительными липидными бислоями, образующимися из транс-Гольджи цистерн. WV, чьи внешние мембраны содержат характеристические вирусные белки, являются предшественниками EV и также находятся внутри клетки. EV состоят из WV, которые выделяются из клетки путем экзоцитоза посредством слияния внешней мембраны WV с плазматической мембраной, оставляя MV, заключенные в еще одну дополнительную мембрану. Часть EV прикреплена к клеточной поверхности, тогда как некоторые из них обнаруживаются свободными во внеклеточной среде. Полагают, что EV важны для распространения вируса в организме.

[0015] Удаление из вирусов необходимых генов и компенсация их в клетках-хозяевах известны в данной области техники в качестве предлагаемой общей стратегии создания безопасных и эффективных вирусных векторов для лечения и терапии. Существует потребность в улучшенных аттенуированных ортопоксвирусных векторах с усиленными безопасностью, экспрессией и/или иммуногенностью и равная потребность в безопасных и экономичных способах размножения и производства таких ортопоксвирусных векторов.

[0016] Ряд линий клеток млекопитающих используется для производства рекомбинантных белков в исследовательских целях. К ним относятся линии клеток кролика, хомяка, приматов и человека, такие как, без ограничения, известные в данной области клетки HEK293, 293T, 143B, CHO, HeLa, Vero и ВНК, HepG2 и 3Т3. Однако следует отметить, что GMP-производство большинства рекомбинантных терапевтических белков было осуществлено в клетках СНО, что делает эту клеточную линию наиболее хорошо изученной и одобренной для терапии человека клеточной линией. Клетки СНО могут вырастать до очень высокой плотности в суспензионных культурах, а последующие способы очистки продуктов очень хорошо разработаны. Следует отметить, что никакой вирус осповакцины, такой как вирус осповакцины-СОР или вирус осповакцины-WR, ни его производные, такие как MVA и NYVAC не будут размножаться в клетках СНО.

[0017] Экспрессия генов видоспецифичности вируса в вирусе оспы под контролем локальных вирусных промоторов и с использованием РНК-полимеразы вируса оспы известна в данной области техники.

[0018] Контролируемая во времени экспрессия определенных видоспецифичных генов вируса с генома клетки млекопитающего, чтобы восстановить или разрешить репликацию вируса и разрешить выживаемость клеток-хозяев, не была описана ранее.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0019] В настоящем описании описаны in vitro культивируемые клетки млекопитающих, трансформированные для экспрессии фактора видоспецифичности поксвируса, и способ размножения вирусных векторов, включающий культивирование таких клеток.

[0020] В первом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке млекопитающего, в которой геном клетки, модифицирован для включения последовательности, кодирующей CP77 под контролем промотора такого, что модифицированная клеточная линия поддерживает размножение поксвируса, который способен в меньшей степени или не способен размножаться в немодифицированной клетке.

[0021] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу размножения ортопоксвируса, который не размножается в клетках CHO, причем способ включает размножение поксвируса in vitro в линии клеток млекопитающего, где клеточную линию модифицируют, чтобы она кодировала и экспрессировала CP77 под контролем промотора.

[0022] В различных альтернативных вариантах осуществления модифицированные клетки дополнительно модифицируют, чтобы они содержали последовательности, кодирующие D13L под контролем промотора, и/или они содержали последовательность, кодирующую K1L под контролем промотора.

[0023] Ссылка в настоящем описании на «CP77», «K1L» и «D13L» включает функциональные ортологи и функциональные варианты.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0024] Настоящее изобретение не ограничивается конкретными процедурами или агентами, определенными составами агентов и различными медицинскими методиками, поскольку они могут варьировать. Используемая в настоящем описании терминология предназначена для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такие же значения, которые обычно понятны среднему специалисту в области, к которой принадлежит данное изобретение.

[0025] Любые материалы и способы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем описании, могут быть использованы при практическом применении или тестировании настоящего изобретения. Использующим изобретение на практике особенно рекомендуются: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.; Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York; Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87, Mahy Brian WJ and Kangro O Hillar (Eds): Virology Methods Manual 1996, Academic Press; и Davison AJ and Elliott RM (Eds): Molecular Virology, A practical Approach 1993, IRL Press at Oxford University Press; Perkus et al., Virology (1990) 179(1):276-86 или определения и термины в данной области и другие способы, известные специалистам в данной области техники.

[0026] Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем описании, могут быть использованы при практическом применении или тестировании настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. Применительно к целям настоящего изобретения ниже приведено определение следующих терминов.

[0027] В этом описании, если контекст не требует иного, слова «содержать», «содержит» и «содержащий» следует понимать как подразумевающие включение указанной стадии или элемента или группы стадий или элементов, но не исключение любой другой стадии или элемента или группы стадий или элементов. Таким образом, использование термина «содержащий» и аналогичных терминов указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательными, но другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать. В контексте аттенуированных ортопоксвирусных векторов, указанные векторы модифицируются для аттенуации (ослабления) путем включения делеции необходимого для созревания или сборки гена, однако охвачена дополнительная модификация, например, векторного антигена или другого белка.

[0028] Под «состоящим из» подразумевается включение и ограничение тем, что следует за фразой «состоящий из». Таким образом, фраза «состоящий из» указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательны, и что никакие другие элементы не могут присутствовать. «По существу состоящий из» означает включение любых элементов, перечисленных после фразы, и ограниченное другими элементами, которые не мешают или способствуют активности или действию, указанным в описании для перечисленных элементов. Таким образом, фраза «по существу состоящий из» указывает на то, что, перечисленные элементы необходимы или обязательны, но другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать в зависимости от того, влияют ли они на активность или действие перечисленных элементов.

[0029] Используемые в настоящем описании формы единственного числа включают множественное число, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например, ссылка на «клетку» включает одну клетку, а также две или несколько клеток; ссылка на «организм» включает в себя один организм, а также два или несколько организмов; и т.п. В некоторых вариантах осуществления единственное число означает «один или более одного».

[0030] В рамках изобретения «и/или» относится к и охватывает любые и все возможные комбинации одного или нескольких из связанных перечисленных пунктов, а также отсутствие комбинаций при интерпретации как чередование (или).

[0031] «Аттенуация» или «аттенуированный» в контексте данного изобретения означает снижение вирулентности вирусного вектора. Вирулентность определяется как способность вируса вызывать болезнь у конкретного хозяина. Поксвирусный вектор, который неспособен продуцировать инфекционные вирусы, первоначально может инфицировать клетки, но не способен по существу полностью реплицироваться или размножаться в хозяине или вызвать заболевание. Это является желательным, поскольку вектор доставляет свой белок или нуклеиновую кислоту в цитоплазму клетки-хозяина, но не наносит вреда.

[0032] Под «регуляторным элементом» или «регуляторной последовательностью» подразумеваются последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК), которые необходимы для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретных поксвирусе, векторе, плазмиде или клетке. Регуляторные последовательности, которые подходят для эукариотических клеток, включают транскрипционные регуляторные последовательности, такие как промоторы, сигналы полиаденилирования, энхансеры транскрипции, трансляционные регуляторные последовательности, такие как энхансеры трансляции и внутренние сайты связывания рибосомы (IRES), нуклеотидные последовательности, которые модулируют стабильность мРНК, а также сигнальные последовательности, которые направляют продукт, кодируемый транскрибируемым полинуклеотидом, в внутриклеточный компартмент в клетке или во внеклеточную среду.

[0033] Если предусмотрены последовательности, то охвачены соответствующие последовательности. Под «соответствует», «соответствующий» или «соответствующий чему-либо» подразумевается последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет значительную идентичность по последовательности с эталонной нуклеотидной последовательностью (например, по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или даже 100% идентичности по последовательности со всей или с участком эталонной нуклеотидной последовательности), или аминокислотная последовательность, которая имеет значительные сходство или идентичность по последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью (например, по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63. 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86, 97. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или даже 100% сходства или идентичности по последовательности со всей или участком эталонной аминокислотной последовательности).

[0034] Под «эффективным количеством» в контексте лечения или профилактики заболевания или в контексте модуляции иммунного ответа на антиген-мишень или организм понимается введение количества агента (например, аттенуированного ортопоксвирусного вектора, описанного в настоящем описании) или содержащей его композиции индивидууму, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, либо в виде однократной дозы или в виде части из серии доз, которое является эффективным для предупреждения проявления симптома, контроля таких симптомов и/или для лечения существующих симптомов заболевания или для модуляции иммунного ответа на антиген-мишень или организм. Эффективное количество будет варьировать в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы подлежащего лечению индивидуума, состава композиции, оценки медико-санитарной обстановки и других значимых факторов. Ожидается, что количество будет иметь относительно широкий диапазон, который может быть определен с помощью обычных испытаний.

[0035] Используемые в рамках изобретения термины «кодировать», «кодирующий» и т.п. относятся к способности нуклеиновой кислоты обеспечивать синтез другой нуклеиновой кислоты или полипептида. Например, говорят, что нуклеотидная последовательность «кодирует» полипептид, если она может транскрибироваться и/или транслироваться с получением полипептида, или если она может быть переведена в форму, которая может транскрибироваться и/или транслироваться с получением полипептида. Такая нуклеотидная последовательность может включать в себя кодирующую последовательность или обе кодирующую и некодирующую последовательности. Таким образом, термины «кодировать», «кодирующий» и т.п. включают РНК-продукт, возникающий в результате транскрипции молекулы ДНК, белок, возникающий в результате трансляции РНК-молекулы, белок, возникающий в результате транскрипции ДНК-молекулы с образованием РНК-продукта и последующей трансляции РНК-продукта, или белок, возникающий в результате транскрипции ДНК-молекулы с получением РНК-продукта, процессинга РНК-продукта с получением процессированного РНК-продукта (например, мРНК) и последующей трансляции процессированного РНК-продукта.

[0036] Термин «эндогенный» относится к гену или последовательности нуклеиновой кислоты или фрагменту, которые обычно присутствуют в организме-хозяине.

[0037] Термины «способный экспрессироваться», «экспрессированный» и их вариации относятся к способности клетки транскрибировать нуклеотидную последовательность в РНК и, необязательно, транслировать мРНК для синтеза пептида или полипептида, который обеспечивает биологическую или биохимическую функцию.

[0038] Используемый в рамках изобретения термин «ген» включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая может быть использована для получения мРНК, необязательно, с добавлением элементов, которые помогают в этом процессе. Гены подходят или не подходят для использования для получения функционального белка. Гены могут включать как кодирующие, так и некодирующие области (например, интролы, регуляторные элементы, промоторы, энхансеры, последовательности терминации и 5'- и 3'-нетранслируемые области).

[0039] Термины «гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты», «гетерологичная нуклеотидная последовательность», «гетерологичный полинуклеотид», «чужеродный полинуклеотид», «экзогенный полинуклеотид» и т.п. используются взаимозаменяемо для обозначения любой нуклеиновой кислоты {например, нуклеотидной последовательности, содержащей IRES), которую вводят в геном организм с помощью экспериментальных манипуляций, и которая может включать в себя последовательности генов, найденные в этом организме, при условии что вводимый ген содержит некоторые модификации (например, точечную мутацию, делецию, замену или добавление по меньшей мере одного нуклеотида, присутствие сайта расщепления эндонуклеазой, присутствие сайта loxP и т.д.) относительно вирусной геномной последовательности до модификации.

[0040] Термины «гетерологичный полипептид», «чужеродный полипептид» и «экзогенный полипептид» используются взаимозаменяемо для обозначения любого пептида или полипептида, который кодируется «гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты», «гетерологичный нуклеотидной последовательностью», «гетерологичным полинуклеотидом», «чужеродным полинуклеотидом» и «экзогенным полинуклеотидом», определение которых приведено выше.

[0041] Термин «клетка млекопитающего» означает клетку, в которую вектор, включая аттенуированный ортопоксвирусный вектор по изобретению, может быть введен с целью размножения поксвирусного вектора. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой непрерывную линию клеток. Менее необходимо, чтобы модифицированная клеточная линия была способна непрерывно делиться. Клетки млекопитающих или высших эукариот могут быть модифицированы по настоящему изобретению, и впоследствии трансформированы или иммортализованы, чтобы стать непрерывно делящейся клеточной линией. Однако было бы удобно, чтобы клетки до модификации представляли собой хорошо охарактеризованную и биотехнологически совместимую непрерывную клеточную линию, известную в данной области. Такие клетки обычно доступны в депозитариях, таких, как Американская коллекция типовых культур (АТСС) или Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАСС).

[0042] Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, RK18, BHK, VERO, HBOC-143B, HaCat, HepG2, HeLa, HT1080, HEK-293, RD, COS-7, CHO, Jurkat, HUT, SUPT, C8166, MOLT4/клон 8, MT-2, MT-4, H9, PM1, CEM, клетки миеломы (например, клетки SB20) и CEMX174, доступные, например, от АТСС.

[0043] Для получения модифицированных клеточных линий, экспрессирующих гетерологичные гены, может быть использован любой признанный в данной области способ инженерии геномов. Приведена ссылка на использование транспозонной технологии для вставки генов в клеточный геном с использованием векторов piggyBac. Однако для введения гена в клетки известно множество способов, включая, без ограничения, трансдукцию ретровирусами (например, MoMLV и т.д.), трансдукцию лентивирусами, трансфекцию и интеграцию плазмид, другие вирусные системы для трансдукции клеточных линий, такие как, аденовирусная, AAV (аденовирус-ассоциированный вирус), EBV и методы редактирования генома для сайт-специфичного встраивания путем гомологичной рекомбинации с линейной ДНК с использованием сконструированных мегануклеаз, эффекторных нуклеаз, подобных транскрипционным активаторам (TAL-нуклеаз), содержащих цинковые-пальцы нуклеаз (ZFN) и CRISPR.

[0044] В одном варианте осуществления клеткой млекопитающего является клетка СНО. Известные клеточные линии СНО, которые не кодируют гены видоспецифичности вируса, не поддерживают производство вируса осповакцины или его производных, которые по существу не могут размножаться в клетках человека. Как известно специалистам в данной области, клетки яичника китайского хомячка (CHO), полученные из яичника хомячка Cricetulus griseus, являются наиболее часто используемыми клетками млекопитающих для биопромышленного и GMP-производства рекомбинантных белковых терапевтических препаратов, включая антитела. Популярность клеток CHO в этой области обусловлена отчасти их быстрым ростом и высоким уровнем продукции белка. В результате, клеточные линии CHO хорошо охарактеризованы. Подходящие клеточные линии CHO включают, без ограничения, линии A2, A2H, XrS6, CHO-K1, CHO/dhfr, RR-CHO-K1, UT-I, P22, CHO-1C6, Lec1, Lec2, Lec8, Pro-5 и CDKXB1. Часто используется клеточная линия CHO-K1, депонированная в АТСС под номерами ATCC CLL-61 или ATCC CRL-9618. Линия клеток СНО-K1 была получена как субклон из родительской клеточной линии СНО, выведенной из образца биопсии яичника взрослого китайского хомячка ученым Puck Т. (1957). В настоящей спецификации описаны модифицированные клетки помимо модифицированных клеток СНО.

[0045] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетка млекопитающего представляет собой клетку человека, клетку примата, клетку хомячка или клетку кролика.

[0046] Клетки могут представлять собой одиночные клетки или могут быть выращены в культуре в виде жидких культур, монослоев и т.п. Клетки-хозяева могут быть также получены напрямую или непрямым образом из тканей или могут существовать в организме, включая животных.

[0047] Следует понимать, что «индукция» иммунного ответа, предусмотренная в настоящем изобретении, включает инициацию или стимуляцию иммунного ответа и/или усиление ранее существующего иммунного ответа.

[0048] Используемый в рамках изобретения термин «внутренний сайт связывания рибосомы» или «IRES» относится к вирусной, клеточной или синтетической (например, рекомбинантной) нуклеотидной последовательности, которая позволяет инициацию трансляции мРНК на внутреннем сайте в кодирующей области в пределах той же мРНК или на сайте, расположенном после 5'-конца мРНК, обеспечивая трансляцию функционально связанной кодирующей области, расположенной после (то есть, в 3'-направлении от) внутреннего сайта связывания рибосомы. Это делает трансляцию независимой от структуры 5'-кэпа и от 5'-конца мРНК. Последовательность IRES обеспечивает необходимые cis-действующие последовательности, необходимые для инициации трансляции функционально связанной кодирующей области.

[0049] Используемый в рамках изобретения термин «выделенный» предназначен для описания клетки, представляющего интерес соединения (например, рекомбинантного поксвируса, молекулы нуклеиновой кислоты, такой как геном, полипептида и т.д.), которые находятся в окружении, отличающемся от того, в котором соединение находится в природе. «Выделенный» подразумевает включение соединений, находящихся в образцах, которые по существу обогащены по представляющему интерес соединению, и/или, в которых представляющее интерес соединение является частично или по существу очищенным.

[0050] Термин «функционально связанный» или «функционально соединенный», используемый в рамках изобретения, относится к соединению, в котором компоненты, описанные таким образом, связаны друг с другом, что позволяет им функционировать предназначенным образом. Например, «транскрипционная регуляторная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью» относится к позиционированию и/или ориентации транскрипционный регулирующей последовательности относительно кодирующей последовательности, которые позволяют экспрессию кодирующей последовательности в условиях, совместимых с транскрипционной регуляторной последовательностью. В другом примере «IRES функционально связан с ортопоксвирусной кодирующей последовательностью» относится к позиционированию и/или ориентации IRES относительно ортопоксвирусной кодирующей последовательности, позволяющим кэп-независимую трансляцию ортопоксвирусной кодирующей последовательности.

[0051] Используемый в настоящем описании термины «открытая рамка считывания» и «ORF» используются взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения аминокислотной последовательности, кодируемой между кодонами инициации и терминации трансляции в кодирующей последовательности. Термины «кодон инициации» (например, ATG) и «кодон терминации» (например, TGA, ТАА, TAG) относятся к единице из трех непрерывных нуклеотидов («кодону») в кодирующей последовательности, которая определяет инициацию и терминацию цепи, соответственно, при синтезе белка (трансляции мРНК).

[0052] Используемый в рамках изобретения термин «родительский вирус» следует понимать, как ссылку на вирус, который был модифицирован для включения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты с образованием рекомбинантного вируса по настоящему изобретению.

[0053] Термины «полинуклеотид», «полинуклеотидная последовательность», «нуклеотидная последовательность», «нуклеиновая кислота» или «последовательность нуклеиновой кислоты», используемые в данном описании, обозначают мРНК, РНК, кРНК, кДНК или ДНК. Термины, как правило, относятся к полимерной форме нуклеотидов, имеющей в длину по меньшей мере 10 оснований, из рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов или из модифицированной формы любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы РНК или ДНК.

[0054] «Полипептид», «пептид», «белок» и «белковая молекула» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения молекул, содержащих или состоящих из полимера из аминокислотных остатков и из их вариантов и синтетических аналогов. Таким образом, эти термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой синтетические аминокислоты, не встречающиеся в природе, такие как химический аналог соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам.

[0055] В рамках изобретения под термином «рекомбинантный» применительно к «молекулам нуклеиновых кислот», «полинуклеотидам» и т.п. понимаются искусственные структуры нуклеиновых кислот (т.е., не реплицирующиеся кДНК или РНК, или репликоны, самореплицирующиеся кДНК или РНК), которые могут транскрибироваться и/или транслироваться в клетках-хозяевах или бесклеточных системах, описанных в настоящем описании. Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот или полинуклеотиды могут быть вставлены в вектор. Могут использоваться невирусные векторы, такие как плазмидные экспрессионные векторы, или вирусные векторы. Тип векторов и методика вставки конструкции нуклеиновой кислоты по данному изобретению известны специалисту в данной области. Молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотид по настоящему изобретению не встречаются в природе в конструкции, описанной в настоящем изобретении. Другими словами, гетерологичная нуклеотидная последовательность в природе не объединена с элементами генома родительского вируса (например, промотором, ОRF, сигналом полиаденилирования, рибозимом).

[0056] Используемый в рамках изобретения термин «рекомбинантный вирус» следует понимать, как ссылку на «родительский вирус», содержащий по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты.

[0057] Термин «идентичность последовательностей», используемый в рамках изобретения, относится к степени, в которой последовательности идентичны по нуклеотидной или аминокислотной основе на протяжении окна сравнения. Таким образом, «процент идентичности последовательностей» рассчитывают путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определения количества положений, в которых присутствуют идентичные нуклеотидные основания (например, А, Т, С G, I) или идентичные аминокислотные остатки (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) в обеих последовательностях, получая число совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Для целей настоящего изобретения «идентичность последовательнос