Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков или пептидов

Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков или пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к искусственным молекулам нуклеиновой кислоты, включающим 5'UTR элемент, полученный из 5'UTR гена TOP, открытую рамку считывания и, необязательно, стебель-петлю гистона, 3'UTR элемент, поли(A)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования. Изобретение также относится к вектору, включающему 5'UTR элемент, полученный из 5'UTR гена TOP, к фармацевтической композиции, включающей искусственную молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, и к набору, включающему искусственную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или фармацевтическую композицию, предпочтительно для применения в области генотерапии и/или генетической вакцинации.

Генотерапия и генетическая вакцинация относятся к наиболее многообещающим и быстро развивающимся методам современной медицины. Они могут обеспечивать очень точные и индивидуальные варианты для лечения целого ряда заболеваний. В частности, предметом таких способов лечения могут быть наследственные генетические заболевания, а также аутоиммунные заболевания, злокачественные или связанные с опухолями заболевания и воспалительные заболевания. Кроме того, с помощью указанных способов предполагается предотвращать (раннее) начало таких заболеваний.

Главная принципиальная идея, лежащая в основе генотерапии, заключается в соответствующей модуляции нарушенной экспрессии гена, связанной с патологическими процессами при некоторых заболеваниях. Патологически измененная экспрессия гена может приводить к недостаточному или избыточному синтезу продуктов существенных генов, например, сигнальных факторов, таких как гормоны, вспомогательных факторов, метаболических ферментов, структурных белков или подобного. Измененная экспрессия генов может быть обусловлена не только нарушением транскрипции и/или трансляции, но также и мутацией в ORF, кодирующей конкретный белок. Патологические мутации могут быть вызваны, например, хромосомной аберрацией или более специфическими мутациями, такими как точковые мутации или мутации со сдвигом рамки считывания, при этом все они приводят к ограничению функциональности и, потенциально, полной потере функции продукта гена. Впрочем, нарушение транскрипции или трансляции также может происходить, если мутации затрагивают гены, кодирующие белки, которые задействованы в транскрипционном или трансляционном аппарате клетки. Такие мутации могут приводить к патологической ап- или даунрегуляции генов, которые также являются функциональными. Гены, кодирующие продукты генов, проявляющих такие регуляторные функции, могут быть, например, факторами транскрипции, сигнальными рецепторами, белками-посредниками или подобным. Однако потеря функции таких генов, кодирующих регуляторные белки, в некоторых обстоятельствах может быть устранена при искусственном введении других факторов, действующих ниже по каскаду после нарушенного продукта гена. Такие нарушения генов можно также компенсировать с помощью генотерапии путем непосредственной замены дефектного гена.

Генетическая вакцинация позволяет вызывать требуемый иммунный ответ против выбранных антигенов, таких как характерные поверхностные компоненты бактерий, вирусные частицы, опухолевые антигены или подобное. В целом вакцинация является одним из основных достижений современной медицины. Однако эффективные вакцины в настоящее время существуют только для малого числа заболеваний. Таким образом, инфекции, которые не удается предотвратить с помощью вакцинации, все еще поражают миллионы людей ежегодно.

Обычно вакцины могут быть подразделены на вакцины «первого», «второго» и «третьего» поколений. Вакцины «первого поколения», как правило, являются вакцинами, которые получены из цельного организма. Они основаны на живых и ослабленных или на убитых патогенах, например вирусах, бактериях или подобном. Главным недостатком живых и ослабленных вакцин является риск реверсии к опасным для жизни вариантам. Таким образом, несмотря на аттенуацию, такие патогены все еще могут представлять непредсказуемый риск. Убитые патогены могут не быть достаточно эффективными, чтобы вызвать специфичный иммунный ответ. Для минимизации таких рисков были созданы вакцины «второго поколения». Как правило, они являются субъединичными вакцинами, состоящими из определенных антигенов или компонентов рекомбинантных белков, которые получены из патогенов.

Под вакцинами «третьего поколения» обычно понимаются генетические вакцины, то есть вакцины для генетической вакцинации. Они обычно состоят из генно-инженерных молекул нуклеиновых кислот, которые обеспечивают экспрессию пептидных или белковых (антигенных) фрагментов, характерных для патогена или опухолевого антигена in vivo. Генетические вакцины экспрессируются при введении пациенту и захватываются компетентными клетками. Экспрессия введенных нуклеиновых кислот приводит к продукции кодируемых белков. В случае, если эти белки распознаются как чужеродные иммунной системой пациента, вызывается иммунный ответ.

Как можно заметить из указанного выше, оба метода, генотерапия и генетическая вакцинация, по сути основаны на введении молекул нуклеиновой кислоты пациенту и последующей транскрипции и/или трансляции кодируемой генетической информации. В альтернативе, генетическая вакцинация или генотерапия также могут включать методы, которые включают выделение определенных соматических клеток у пациента, проходящего лечение, последующую in vitro трансфекцию таких клеток и повторное введение обработанных клеток пациенту.

ДНК, как и РНК, может использоваться в качестве молекул нуклеиновых кислот для введения в рамках генотерапии или генетической вакцинации. ДНК, как известно, является относительно устойчивой и простой в обращении. Однако использование ДНК несет в себе риск нежелательного встраивания вводимых фрагментов ДНК в геном пациента, что потенциально может приводить к потере функции нарушенных генов. В качестве дополнительного риска, происходит нежелательное образование антител против ДНК. Другим недостатком является ограниченный уровень экспрессии кодируемого пептида или белка, который достигается при введении ДНК и ее транскрипции/трансляции. Среди других причин - также то, что уровень экспрессии вводимой ДНК будет зависеть от присутствия специфических факторов транскрипции, которые регулируют транскрипцию ДНК. При отсутствии таких факторов, транскрипция ДНК не будет давать достаточных количеств РНК. В результате уровень транслируемого пептида или получаемого белка ограничен.

При использовании в генотерапии или генетической вакцинации РНК вместо ДНК, риск нежелательной интеграции в геном и образования антител против ДНК сведен к минимуму или отсутствует. Однако РНК, как предполагают, представляет собой довольно нестабильные соединения, которые могут быстро разрушаться под действием повсеместно присутствующих РНКаз.

In vivo, деградация РНК способствует регуляции полупериода существования РНК. Данный эффект рассматривали в качестве механизма тонкой регуляции экспрессии эукариотических генов, и впоследствии это было подтверждено (Friedel et al., Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life, Nucleic Acid Research, 2009, 1-12). Таким образом, каждая природная мРНК имеет свой индивидуальный полупериод существования в зависимости от гена, из которого получена мРНК. Это вносит вклад в регуляцию уровня экспрессии данного гена. Нестабильные РНК важны для реализации транзиентной экспрессии гена в различные моменты времени. Впрочем, долгоживущие РНК могут быть связаны с накоплением отдельных белков или с непрерывной экспрессией генов. In vivo, полупериод существования молекул мРНК может также зависеть от внешних факторов, таких как гормональная терапия, как, например, было показано в случае мРНК инсулиноподобного фактора роста I, актина и альбумина (Johnson et al., Newly synthesized RNA: Simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 88, pp. 5287-5291, 1991).

Для генотерапии и генетической вакцинации обычно требуется устойчивая РНК. С одной стороны это продиктовано тем, что продукт, кодируемый последовательностью РНК, должен накопиться in vivo. С другой стороны, РНК должна сохранять свою структурную и функциональную целостность при производстве в виде подходящей лекарственной формы, в течение ее хранения и при введении. Таким образом, значительное внимание было уделено получению устойчивых молекул РНК для генотерапии или генетической вакцинации в целях предотвращения их ранней деградации или разрушения.

Сообщали, что G/C-состав молекул нуклеиновых кислот может влиять на их стабильность. Таким образом, нуклеиновые кислоты, содержащие повышенное количество остатков гуанина (G) и/или цитозина (C), могут быть более функционально стабильными, нежели нуклеиновые кислоты, содержащие большое количество нуклеотидов аденина (A) и тимина (T) или урацила (U). В данном контексте, в WO 02/098443 предложена фармацевтическая композиция, содержащая мРНК, которая стабилизирована посредством модификаций последовательности в транслируемой области. При такой модификации последовательности используется вырожденность генетического кода. Соответственно, кодоны, которые содержат менее благоприятную комбинацию нуклеотидов (менее благоприятную в отношении стабильности РНК), можно заменить альтернативными кодонами, не изменяя при этом кодируемую аминокислотную последовательность. Такой способ стабилизации РНК ограничен условиями определенной нуклеотидной последовательности каждой единственной молекулы РНК, которая не может оставить место требуемой аминокислотной последовательности. Кроме того, данный подход ограничен кодирующими областями РНК.

В качестве альтернативного варианта стабилизации мРНК было обнаружено, что природные эукариотические молекулы мРНК содержат характерные стабилизирующие элементы. Например, они могут включать так называемые нетранслируемые области (UTR или НТО) на своих 5'-концах (5'UTR) и/или 3'-концах (3'UTR), а также другие структурные особенности, такие как 5'-кэп структуру или 3'-поли(A) хвост. И 5'UTR, и 3'UTR обычно транскрибируются с геномной ДНК и являются, таким образом, элементом незрелой мРНК. Характерные структурные особенности зрелой мРНК, такие как 5'-кэп и 3'-поли(A)-хвост (также называемый поли(A)-хвостом или поли(A)-последовательностью) обычно добавляются к транскрибируемой (незрелой) мРНК в ходе процессинга мРНК.

3'-поли(A)-хвост, как правило, представляет собой монотонный фрагмент последовательности из аденин-нуклеотидов, добавленный на 3'-конец транскрибированной мРНК. Он может включать до приблизительно 400 аденин-нуклеотидов. Было обнаружено, что длина таких 3'-поли(A)-хвостов потенциально является особо важным элементом для стабильности индивидуальной мРНК.

Почти все эукариотические мРНК заканчиваются такой поли(A)-последовательностью, которая добавляется на их 3'-концы повсеместно распространенным аппаратом расщепления/полиаденилирования. Присутствие поли(A)-последовательности на 3'-концах является одной из наиболее характерных особенностей эукариотических мРНК. После расщепления, большинство пре-мРНК, за исключением зависимых от репликации транскриптов гистонов, нуждается в наличии полиаденилированного хвоста. В данном контексте, 3'-концевой процессинг является ядерным котранскрипционным процессом, который способствует транспорту мРНК из ядра в цитоплазму и влияет на стабильность и трансляцию мРНК. Формирование таких 3'-концов происходит в двухстадийной реакции, направляемой аппаратом расщепления/полиаденилирования, и зависит от присутствия двух элементов последовательности в мРНК-предшественниках (пре-мРНК): высококонсервативного гексануклеотида AAUAAA (сигнала полиаденилирования) и нижестоящей G/U-богатой последовательности. В первой стадии, пре-мРНК расщепляются между двумя указанными элементами. Во второй стадии, непосредственно следующей за первой стадией, только сформированный 3'-конец продолжается с присоединением поли(A)-последовательности, состоящей из 200-250 аденилатов, что впоследствии влияет на все аспекты метаболизма мРНК, в том числе на экспорт, стабильность и трансляцию мРНК (Dominski, Z. and W.F. Marzluff (2007), Gene 396(2):373-90).

Единственное известное исключение для этого правила - зависимые от репликации мРНК гистонов, которые заканчиваются гистоновой стебель-петлей вместо поли(A)-последовательности. Примеры гистоновых последовательностей стебель-петля описаны в Lopez et al. (Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308).

После стебель-петель в гистоновых пре-мРНК обычно расположена богатая пуринами последовательность, известная как нижестоящий элемент гистона (HDE). Такие пре-мРНК подвергаются процессингу в ядре с одиночным эндонуклеолитическим расщеплением приблизительно через 5 нуклеотидов после стебель-петли, катализируемым U7 мяРНП посредством спаривания оснований U7 мяРНК с HDE.

Вследствие необходимости упаковки только что синтезированной ДНК в хроматин, синтез гистонов регулируется совместно с клеточным циклом. Увеличенный синтез гистоновых белков в течение фазы S достигается посредством транскрипционной активации генов гистонов, а также посттранскрипционной регуляцией уровней гистоновой мРНК. Может быть показано, что гистоновая стебель-петля является существенной во всех посттранскрипционных этапах регуляции экспрессии гистонов. Для эффективного процессинга необходим экспорт мРНК в цитоплазму, загрузка на полирибосомы и регуляция стабильности мРНК.

В отношении изложенного выше, был идентифицирован белок массой 32 кДа, который связан с гистоновой стебель-петлей на 3'-конце гистоновых транскриптов в ядре и в цитоплазме. Уровень экспрессии этого стебель-петля-связывающего белка (SLBP) регулируется клеточным циклом и является наиболее высоким в течение S-фазы, когда уровни гистоновой мРНК повышены. SLBP необходим для эффективного 3'-концевого процессинга гистоновой пре-мРНК U7 мяРНП. После завершения процессинга SLBP остается связанным с стебель-петлей на конце зрелых гистоновых мРНК и стимулирует их трансляцию в гистоновые белки в цитоплазме. (Dominski, Z. and W.F. Marzluff (2007), Gene, 396(2):373-90). Примечательно, что РНК-связывающий домен SLBP консервативен у животных и простейших (Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308), при этом может быть показано, что его связывание с последовательностью стебель-петли гистона зависит от структуры стебель-петли, и что минимальный связывающий участок содержит по меньшей мере 3 нуклеотида 5' и 2 нуклеотида 3' стебель-петли (Pandey, N. B., et al. (1994), Molecular and Cellular Biology, 74.3), 1709-1720 и Williams, A. S., & Marzluff, W.F., (1995), Nucleic Acids Research, 23(4), 654-662).

Даже несмотря на то, что гены гистонов обычно относят либо к ʺрепликационно-зависимымʺ генам, которые дают мРНК, заканчивающуюся гистоновой стебель-петлей, либо к генам ʺзаместительного типаʺ, которые дают мРНК, несущую вместо него поли(A)-хвост, природные мРНК, содержащие и гистоновую стебель-петлю, и поли(A) или олиго(A) 3', были выявлены в нескольких крайне редких случаях. Sanchez с сотр. исследовали эффект природных олиго(A)-хвостов на 3'-конце гистоновой стебель-петли гистоновой мРНК в процессе оогенеза Xenopus при использовании люциферазы в качестве белка-репортера и установили, что олиго(A)-хвост является активной частью механизма репрессии трансляции, который вызывает сайленсинг гистоновой мРНК в процессе оогенеза, и его удаление является частью механизма, который активирует трансляцию гистоновых мРНК (Sanchez, R. and W.F. Marzluff (2004), Mol Cell Biol 24(6):2513-25).

Кроме того, потребности в регуляции репликационно-зависимых гистонов на уровне процессинга пре-мРНК и стабильности мРНК исследовали с использованием искусственных конструкций, кодирующих маркерный белок альфа-глобин, воспользовавшись тем, что ген глобина содержит интроны в отличие от безынтронных генов гистонов. С этой целью были получены конструкции, в которых после последовательности, кодирующей альфа-глобин, был расположен сигнал гистоновой стебель-петли (стебель-петля гистона, после которой расположен гистоновый нижестоящий элемент) и сигнал полиаденилирования (Whitelaw, E., et al. (1986). Nucleic Acids Research, 14(17), 7059-7070; Pandey, N.B., & Marzluff, W.F. (1987). Molecular and Cellular Biology, 7(12), 4557-4559; Pandey, N.B., et al. (1990). Nucleic Acids Research, 18(11), 3161-3170).

Кроме того, было показано, что 3'UTR мРНК α-глобина может быть важным фактором хорошо известной стабильности мРНК α-глобина (Rodgers et al, Regulated a-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping, RNA, 8, pp. 1526-1537, 2002). 3'UTR мРНК α-глобина очевидно участвует в формировании специфического рибонуклеопротеидного комплекса, α-комплекса, присутствие которого коррелирует со стабильностью мРНК in vitro (Wang et al., An mRNA stability complex functions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro, Molecular and Cellular biology, Vol 19, No. 7, July 1999, p. 4552-4560).

Независимо от факторов, влияющих на стабильность мРНК, эффективная трансляция вводимых молекул нуклеиновой кислоты в целевых клетках или ткани особенно важна для любого подхода, в котором молекулы нуклеиновой кислоты используют для генотерапии или генетической вакцинации. Наряду с регуляцией стабильности, трансляция большинства мРНК также регулируется такими структурными особенностями как UTR, 5'-кэп и 3'-поли(A)-хвост. В этой связи сообщали, что длина поли(A)-хвоста может также играть важную роль для эффективности трансляции. Стабилизация 3'-элементов, тем не менее, может также оказывать ослабляющий эффект в отношении трансляции.

В 5'UTR могут быть найдены другие регуляторные элементы, которые могут влиять на уровни экспрессии. Например, сообщали, что синтез специфических белков, например белков, которые относятся к трансляционному аппарату, может регулироваться не только на транскрипционном, но также и на трансляционном уровне. Например, трансляция белков, кодируемых так называемыми «TOP-генами», может понижаться вследствие трансляционной репрессии. В этом отношении, термин «TOP-ген» относится к гену, соответствующему мРНК, которая отличается присутствием TOP последовательности на 5'-конце и в большинстве случаев ассоциированной с ростом регуляцией трансляции (Iadevaia et al., All translation elongation factors and the e, f, and h subunits of translation initiation factor 3 are encoded by 5'-terminal oligopyrimidine (TOP) mRNAs; RNA, 2008, 14:1730-1736). В этом отношении, TOP последовательность, также называемая «5'-концевым олигопиримидиновым трактом», обычно состоит из остатка C на кэп-сайте, после которого следует непрерывная последовательность длиной до 13 пиримидинов или даже более (Avni et al., Vertebrate mRNAs with a 5'-terminal pyrimidine tract are Candidates for translational repression in quiescent cells: characterization of the translational cis-regulatory element, Molecular and Cellular Biology, 1994, p. 3822-3833). Указанные TOP последовательности, как сообщают, присутствуют во многих мРНК, которые кодируют компоненты трансляционного аппарата, и ответственны за селективную репрессию трансляции таких TOP-содержащих мРНК вследствие блокировки роста (Meyuhas, et al., Translational Control of Ribosomal Protein mRNAs in Eukaryotes, Translational Control. Cold Spring Harbor Monograph Archive. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996, p. 363-388).

Цель изобретения состоит в предоставлении молекул нуклеиновых кислот, которые могут быть пригодны для применения в генотерапии и/или генетической вакцинации. В частности, цель изобретения состоит в предоставлении искусственных молекул нуклеиновых кислот, таких как молекулы мРНК, которые обеспечивают повышенную продукцию белка из указанных искусственных молекул нуклеиновых кислот, которые предпочтительно демонстрируют увеличенную трансляционную эффективность. Другая цель настоящего изобретения состоит в предоставлении молекул нуклеиновых кислот, кодирующих такие превосходные молекулы мРНК, которые могут быть пригодны для применения в генотерапии и/или генетической вакцинации. Другая цель настоящего изобретения состоит в предоставлении фармацевтической композиции для применения в генотерапии и/или генетической вакцинации. В итоге цель настоящего изобретения состоит в предоставлении улучшенных молекул нуклеиновых кислот, которые позволяют преодолеть обсуждаемые выше недостатки предшествующего уровня техники рентабельным и прямым подходом.

Цель, лежащая в основе настоящего изобретения, достигается с помощью заявленного объекта.

Для ясности и легкости прочтения, представлены следующие определения. Любая техническая особенность, указываемая для этих определений, может быть включена во все без исключения варианты осуществления изобретения. Дополнительные определения и объяснения могут быть прямо предусмотрены в рамках данных вариантов осуществления.

Адаптивный иммунный ответ: Адаптивный иммунный ответ, как обычно понимается, является антиген-специфичным ответом иммунной системы. Антигенная специфичность обеспечивает ответы, которые направлены против определенных патогенов или инфицированных патогеном клеток. Способность устанавливать такие специализированные ответы обычно поддерживается в теле «клетками памяти». Если патоген поражает организм более одного раза, эти специфичные клетки памяти используются, чтобы быстро устранить его. В этой связи, первым этапом адаптивного иммунного ответа является активация наивных антиген-специфичных T-клеток или различных иммунных клеток, способных индуцировать антиген-специфичный иммунный ответ с участием антиген-презентирующих клеток. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные T-клетки. В роли антиген-презентирующих клеток могут выступать три типа клеток: дендритные клетки, макрофаги и B-клетки. Каждый из указанных типов клеток имеет определенную функцию при индукции иммунных ответов. Дендритные клетки могут захватывать антигены при фагоцитозе и макропиноцитозе и могут стимулироваться при контакте, например, с чужеродным антигеном, после чего они мигрируют в локальную лимфоидную ткань, где они дифференцируются в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают антигенные частицы, такие как бактерии, и индуцируются инфекционными агентами или другими соответствующими стимулами, экспрессируя молекулы MHC. Уникальная способность B-клеток связывать и интернализировать растворимые белковые антигены посредством своих рецепторов также может быть важна при индукции T-клеток. MHC-молекулы, как правило, отвечают за презентацию антигена T-клеткам. В данном случае, презентация антигена на молекулах MHC приводит к активации T-клеток, что вызывает их пролиферацию и дифференцировку в вооруженные эффекторные T-клетки. Самая важная функция эффекторных T-клеток - цитолиз инфицированных клеток, осуществляемый CD8⁺ цитотоксическими T-клетками, и активация макрофагов Th1 клетками, которые вместе составляют клеточный иммунитет, а также активация B-клеток Th2 и Th1 клетками, с продукцией антител различных классов и направлением, таким образом, гуморального иммунного ответа. T-клетки распознают антиген своими T-клеточными рецепторами, которые не распознают и не связывают антиген непосредственно, но вместо этого они распознают короткие пептидные фрагменты, например, образующиеся из патогенов белковые антигены, например, так называемые эпитопы, которые связываются с молекулами MHC на поверхностях других клеток.

Адаптивная иммунная система: Адаптивная иммунная система по существу предназначена для устранения или предотвращения роста патогенов. Как правило, она регулирует адаптивный иммунный ответ, предоставляя иммунной системе позвоночных способность распознавать и запоминать определенные патогены (формируя иммунитет), а также организовывать более сильные атаки при каждом последующем контакте с патогеном. Система обладает высокой способности к адаптации вследствие соматической гипермутации (процесса ускоренных соматических мутаций) и V(D)J рекомбинации (необратимая генетическая рекомбинация сегментов генов антигенных рецепторов). Данный механизм позволяет небольшому количеству генов производить огромное количество различных антигенных рецепторов, которые затем уникально экспрессируются на каждом отдельном лимфоците. Поскольку перестройка генов приводит к необратимому изменению ДНК в каждой клетке, все потомство которой затем унаследует гены, кодирующие ту же специфичность рецептора, включая B-клетки памяти и T-клетки памяти, которые являются ключами к долговременному специфичному иммунитету.

Адъювант/адъювантный компонент: Адъювант или адъювантный компонент в самом широком смысле обычно является фармакологическим и/или иммунологическим средством, которое может изменять, например усиливать, эффект других средств, таких как лекарственное средство или вакцина. Это должно интерпретироваться в широком смысле и относится к широкому спектру веществ. Как правило, такие вещества способны повышать иммуногенность антигенов. Например, адъюванты могут распознаваться врожденными иммунными системами и, например, могут вызывать врожденный иммунный ответ. «Адъюванты» обычно не вызывают адаптивный иммунный ответ. Поэтому «адъюванты» не относятся к антигенам. Их механизм действия отличен от эффектов, вызываемых антигенами, приводящими к адаптивному иммунному ответу.

Антиген: В рамках настоящего изобретения, «антиген» обычно относится к веществу, которое может распознавать иммунная система, предпочтительно адаптивная иммунная система, и способно вызывать антиген-специфичный иммунный ответ, например, путем образования антител и/или антиген-специфичных T-клеток, как часть адаптивного иммунного ответа. Как правило, антиген может представлять собой или включать пептид или белок, который MHC может презентировать T-клеткам.

Искусственная молекула нуклеиновой кислоты: Под искусственной молекулой нуклеиновой кислоты обычно может пониматься молекула нуклеиновой кислоты, например ДНК или РНК, которая не существует в природе. Другими словами, искусственная молекула нуклеиновой кислоты может пониматься как неприродная молекула нуклеиновой кислоты. Такая молекула нуклеиновой кислоты может быть неприродной вследствие ее индивидуальной последовательности (которая не существует в природе) и/или из-за других модификаций, например структурных модификаций нуклеотидов, которые не существуют в природе. Искусственная молекула нуклеиновой кислоты может быть молекулой ДНК, молекулой РНК или гибридной молекулой, включающей части РНК и ДНК. Как правило, искусственные молекулы нуклеиновых кислот могут быть созданы и/или получены с помощью методов генной инженерии, чтобы соответствовать требуемой искусственной последовательности нуклеотидов (гетерологичной последовательности). В этой связи искусственная последовательность обычно является последовательностью, которая может не существовать в природе, то есть она отличается от последовательности дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом. Термин «дикий тип» можно понимать как последовательность, существующая в природе. Кроме того, термин «искусственная молекула нуклеиновой кислоты» не ограничен значением «одна единственная молекула», но, как правило, понимается как включающий группу идентичных молекул. Таким образом, он может относиться к множеству идентичных молекул, содержащихся в аликвоте.

Бицистронная РНК, мультицистронная РНК: Бицистронная или мультицистронная РНК обычно представляет собой РНК, предпочтительно мРНК, которая, как правило, может иметь две (бицистронная) или более (мультицистронная) открытых рамок считывания (ORF). Открытая рамка считывания в данном контексте является последовательностью кодонов, которая может транслироваться в пептид или белок.

Носитель/полимерный носитель: Носитель в рамках изобретения обычно может являться соединением, которое облегчает транспорт и/или образование комплекса с другим соединением (грузом). Полимерный носитель обычно является носителем, который сформирован из полимера. Носитель может быть связанным со своим грузом ковалентным или нековалентным взаимодействием. Носитель может транспортировать нуклеиновые кислоты, например, РНК или ДНК, в целевые клетки. Носитель, в некоторых вариантах осуществления, может быть катионным компонентом.

Катионный компонент: Термин «катионный компонент», как правило, относится к заряженной молекуле, которая заряжена положительно (катион) при значении pH типично от 1 до 9, предпочтительно при значении pH, равном или ниже 9 (например, от 5 до 9), равном или ниже 8 (например, от 5 до 8), равном или ниже 7 (например, от 5 до 7), наиболее предпочтительно при физиологическом pH, например, от 7,3 до 7,4. Таким образом, катионный компонент может быть любым положительно заряженным соединением или полимером, предпочтительно катионным пептидом или белком, который положительно заряжен при физиологических условиях, в особенности при физиологических условиях in vivo. «Катионный пептид или белок» могут содержать по меньшей мере одну положительно заряженную аминокислоту или более одной положительно заряженной аминокислоты, например, выбранных из Arg, His, Lys или Orn. Таким образом, «поликатионные» компоненты, которые также включены в объем изобретения, демонстрируют больше одного положительного заряда при данных условиях.

5'-кэп: 5'-кэп представляет собой группу, как правило, модифицированную нуклеотидную группу, которая обычно «кэпирует» 5'-конец зрелой мРНК. 5'-кэп обычно может быть сформирован модифицированным нуклеотидом, в частности производным нуклеотида гуанина. Предпочтительно, 5'-кэп связан с 5'-концом через 5'-5'-трифосфатную связь. 5'-кэп может быть метилирован, например m7CpppN, где N является концевым 5'-нуклеотидом нуклеиновой кислоты, несущим 5'-кэп, обычно 5'-концом РНК. Другие примеры 5'-кэп структуры включают глицерил, инвертированный дезокси-безосновный остаток (группу), 4'-, 5'-метиленнуклеотиды, 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотиды, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситоловый нуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, трео-пентофуранозилнуклеотид, ациклический 3', 4'-секо-нуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутилнуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентилнуклеотид, 3'-3'-инвертированную нуклеотидную группу, 3'-3'-инвертированную безосновную группу, 3'-2'-инвертированную нуклеотидную группу, 3'-2'-инвертированную безосновную группу, 1,4-бутандиолфосфат, 3'-фосфорамидат, гексилфосфат, аминогексилфосфат, 3'-фосфат, 3'-фосфоротиоат, фосфородитиоат или мостиковую или не мостиковую метилфосфонатную группу.

Клеточный иммунитет/клеточный иммунный ответ: Клеточный иммунитет обычно относится к активации макрофагов, натуральных киллерных клеток (NK), антиген-специфических цитотоксических T-лимфоцитов и к секреции различных цитокинов в ответ на антиген. В более общих терминах, клеточный иммунитет основан не на антителах, а на активации клеток иммунной системы. Как правило, клеточный иммунный ответ может быть охарактеризован, например, активацией антиген-специфических цитотоксических T-лимфоцитов, которые способны вызывать апоптоз клеток, например, специфических иммунных клеток, таких как дендритные клетки, или других клеток, которые презентируют эпитопы чужеродных антигенов на своей поверхности. Такие клетки могут быть инфицированы вирусом или внутриклеточными бактериями, или являться раковыми клетками, презентирующими опухолевые антигены. Другими характеристиками может быть активация макрофагов и натуральных киллерных клеток, позволяющая им разрушать патогены и стимулировать клетки, секретирующие различные цитокины, которые влияют на функцию других клеток, задействованных в адаптивных иммунных ответах и врожденных иммунных ответах.

ДНК: ДНК - это обычное сокращенное обозначение дезокси-рибонуклеиновой кислоты. Она представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, то есть полимер, состоящий из нуклеотидов. Эти нуклеотиды обычно являются дезоксиаденозинмонофосфатными, дезокситимидинмонофосфатными, дезоксигуанозинмонофосфатными и дезоксицитидинмонофосфатными мономерами, которые состоят из сахара (дезоксирибозы), основания и фосфатной группы, и полимеризуются с формированием характерной структуры цепи. Структура основной цепи, как правило, сформирована фосфодиэфирными связями между сахаром нуклеотида, то есть дезоксирибозой, первого мономера и фосфатной группой второго, смежного мономера. Определенный порядок мономеров, то есть порядок оснований, связанных с сахар/фосфатным скелетом, называют последовательностью ДНК. ДНК может быть одноцепочечной или двухцепочечной. В двухцепочечной форме, нуклеотиды первой цепи обычно гибридизуются с нуклеотидами второй цепи, например, по правилу спаривания оснований A/T и G/C.

Эпитоп: Эпитопы (также назваемые 'антигенная детерминанта') можно разделить на T-клеточные эпитопы и B-клеточные эпитопы. T-клеточные эпитопы или части белков в рамках настоящего изобретения могут включать фрагменты, предпочтительно имеющие длину от приблизительно 6 до приблизительно 20 или даже более аминокислот, например, фрагменты, процессированные и презентированные молекулами MHC класса I, предпочтительно имеющие длину от приблизительно 8 до приблизительно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессированные и презентированные молекулами MHC класса II, предпочтительно имеющие длину приблизительно 13 или более аминокислот, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже более аминокислот, где указанные фрагменты могут быть выбраны из любой части аминокислотной последовательности. Такие фрагменты обычно распознаются T-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы MHC, то есть фрагменты обычно не распознаются в своей нативной форме. B-клеточные эпитопы обычно представляют собой фрагменты, расположенные на внешней поверхности (нативного) белка или пептидных антигенов, как определено в настоящей заявке, предпочтительно содержащие 5-15 аминокислот, более предпочтительно содержащие 5-12 аминокислот, еще более предпочтительно содержащие 6-9 аминокислот, которые могут распознаваться антителами, то есть в их нативной форме.

Такие эпитопы белков или пептидов могут быть, помимо прочего, выбраны из любого из указанных в настоящем описании вариантов таких белков или пептидов. В этой связи антигенные детерминанты могут быть конформационными или прерывистыми эпитопами, которые состоят из сегментов белков или пептидов, как определено в настоящей заявке, которые являются прерывистыми в аминокислотной последовательности белков или пептидов, как определено в настоящей заявке, но сведены вместе в трехмерной структуре, или непрерывными или линейными эпитопами, которые состоят из одной полипептидной цепи.

Фрагмент последовательности: Фрагмент последовательности обычно может быть более короткой частью полноразмерной последовательности, например, молекулы нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Соответственно, фрагмент, как правило, состоит из последовательности, которая идентична соответствующему отрезку в пределах полноразмерной последовательности. Предпочтительный фрагмент последовательности в рамках настоящего изобретения состоит из непрерывного отрезка элементов, таких как нуклеотиды или аминокислоты, соответствующего непрерывному отрезку элементов в молекуле, из которой получен фрагмент, который представляет по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% от целой (то есть полноразмерной) молекулы, из которой получен фрагмент.

G/C модифицированный: G/C-модифицированная нуклеиновая кислота обычно может быть нуклеиновой кислотой, предпочтительно искусственной молекулой нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании, основанной на модифицированной последовательности дикого типа, предпочтительно включающей увеличенное количество гуанозиновых и/или цитозиновых нуклеотидов по сравнению с последовательностью дикого типа. Такое увеличенное количество может быть вызвано заменой кодонов, содержащих аденозиновые или тимидиновые нуклеотиды, кодонами, содержащими гуанозиновые или цитозиновые нуклеотиды. Если обогащенный G/C состав присутствует в кодирующей области ДНК или РНК, используется вырожденность генетического кода. Таким образом, замены кодонов предпочтительно не приводят к изменению кодируемых амино