Композиции для борьбы с клещами варроа у пчел

Композиции для борьбы с клещами варроа у пчел

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение согласно некоторым его вариантам осуществления относится к композиции для борьбы с заражением клещом варроа у пчел.

Уровень техники

Медоносные пчелы, Apis mellifera, необходимы для эффективного опыления сельскохозяйственных культур и, следовательно, критически важны для мирового сельского хозяйства. Медоносные пчелы также производят экономически важные продукты, включая в себя мед и пчелиный воск. Медоносные пчелы подвержены ряду паразитов и патогенов, включая в себя клеща-эктопаразита, Varroa destructor.

Синдром разрушения колоний (CCD) медоносных пчел грозит уничтожением сельского хозяйства США и всего мира. В действительности, в последней вспышке CCD в США зимой 2006-2007 гг., по оценкам 25% или больше 2,4 млн. ульев медоносных пчел было потеряно вследствие CCD. По оценкам 23% пчеловодных хозяйств в США пострадали от CCD в течение зимы 2006-2007 гг., затронув в среднем 45% пчеловодных хозяйств. Зимой 2007-2008 гг. инициативная группа по CCD USDA-ARS оценила, что в общем 36% всех ульев из коммерческих хозяйств были разрушены CCD.

CCD характеризуется быстрой потерей популяции взрослых пчел колонии, при этом мертвых взрослых пчел, как правило, обнаруживают на расстоянии от колонии. На последних стадиях разрушения, матку обслуживают только несколько вновь появившихся взрослых пчел. Разрушенные колонии часто характеризуются существенным запечатанным расплодом и пищевыми запасами. Явление CCD было впервые описано в 2006 г.; тем не менее, пчеловоды отмечали разрушения уникальных колоний, соответствующие CCD, еще в 2004 г. Различные факторы, такие как клещи и инфекционные средства, погодные условия, электромагнитное излучение (антенны сотовой связи), пестициды, плохое питание и стресс, были предложены в качестве причин. В настоящее время борьба с CCD сфокусировалась на борьбе с клещом варроа, санации и удалении пораженных ульев, лечении оппортунистических инфекций (таких как Nosema) и улучшенном питании. Эффективные превентивные меры не были разработаны к настоящему времени.

Клещи варроа паразитируют на куколках и взрослых пчелах и размножаются в гони днях куколок. Клещи используют свои ротовые органы для прокола экзоскелета и питания гемолимфой пчел. В этих местах повреждения в экзоскелете скапливаются такие бактериальные инфекции, как Melissococcus pluton, которая вызывает европейский гнилец пчелиного расплода. В дополнение к их паразитическим эффектам, предполагают, что клещи варроа действуют в качестве переносчиков ряда патогенов медоносных пчел, включая в себя вирус деформации крыла (DWV), вирус Кашмира (KBV), вирус острого паралича пчел (ABPV) и вирус черных маточников (BQCV), и могут ослаблять иммунные системы своих хозяев, делая их подверженными инфекциям. Если оставить необработанными заражения варроа, как правило, приводят к смертности на уровне колонии.

Существующие способы лечения заражений варроа оказались неэффективными, поскольку клещи развивают устойчивость к существующим акарицидам. Кроме того, применение таких акарицидов может вводить вредные химические соединения в мед, который предназначен для потребления человеком.

Заявка на выдачу патента США №20090118214 раскрывает применение дсРНК для профилактики и лечения вирусных инфекций у медоносных пчел.

Сущность изобретения

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено выделенное нуклеиновокислотное средство, содержащее последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO. 93-105 и 106.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую раскрытое в настоящем документе выделенное нуклеиновокислотное средство.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена проглатываемая пчелой композиция, содержащая по меньшей мере одно нуклеиновокислотное средство, раскрытое в настоящем документе.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ профилактики или лечения заражения улья клещом Varroa destructor, включающий введение пчеле из улья эффективного количества по меньшей мере одного нуклеиновокислотного средства, характеризующегося последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 93-105 и 106, тем самым обеспечивая профилактику или лечение заражения улья клещом Varroa destructor.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ снижения подверженности медоносной пчелы синдрому разрушения колоний (CCD), включающий введение медоносной пчеле эффективного количества по меньшей мере одного нуклеиновокислотного средства, выбранного из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных в SEQ ID NO: 93-95 и 106, тем самым снижая подверженность медоносных пчел синдрому разрушения колоний (CCD).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере пять нуклеиновокислотных средств, причем каждое из нуклеиновокислотных средств характеризуется различной последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 93-105 и 106.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере одно из нуклеиновокислотных средств, характеризующееся последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит каждое из нуклеиновокислотных средств, характеризующееся последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция находится в форме, выбранной из группы, состоящей из твердой формы и жидкой формы.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция дополнительно содержит белок.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения белок находится в форме пыльцы и/или соевых лепешек.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения жидкая форма выбрана из группы, состоящей из раствора сахарозы и раствора кукурузной патоки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения медоносная пчела представляет собой пчелу колонии, и при этом введение снижает подверженность колонии пчел синдрому разрушения колоний.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения введение осуществляют путем кормления.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нуклеиновокислотное средство предусмотрено в проглатываемой пчелой композиции, выбранной из группы, состоящей из жидкой проглатываемой пчелой композиции и твердой проглатываемой пчелой композиции.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере одно из нуклеиновокислотных средств, характеризующееся последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере пять нуклеиновокислотных средств, причем каждое средство характеризуется различной последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 93-106.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нуклеиновокислотное средство вводят в виде конструкта нуклеиновой кислоты.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нуклеиновокислотные средства представлены в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.

Если не определено другое, все использованные в настоящем документе технические и/или научные термины имеют те же значения, которые обычно подразумеваются под ними специалистом в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут использоваться в практическом осуществлении или испытании вариантов осуществления настоящего изобретения, примеры способов и/или материалов описаны ниже. В случае конфликта описание настоящего патента, включая в себя определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными, и не предусмотрено, что они являются обязательно ограничивающими.

Краткое описание чертежей

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем документе, только в качестве примера, со ссылкой на прилагаемые графические материалы. Специально ссылаясь на графические материалы в деталях, акцентируют на том, что проиллюстрированные подробные данные представлены исключительно в качестве примера и для целей иллюстративного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. В связи с этим, описание настоящего изобретения, рассматриваемое вместе с графическими материалами, делает очевидным для специалистов в настоящей области техники то, как можно осуществить на практике варианты осуществления настоящего изобретения.

На графических материалах:

На фиг. 1 представлено схематическое представление временной динамики различных экспериментов для переноса дсРНК в клещи варроа.

На фиг. 2А-Е представлены фотографии результатов слот-блот анализа присутствия дсРНК-GFP у проглотивших дсРНК-GFP пчел (фигура 2А), у личинок, которых кормят взрослые пчелы (фигура 2 В), у куколок (фигура 2С) и у вновь появившихся пчел (фигура 2D). Присутствие дсРНК-GFP и миРНК, полученной из нее, анализировали с помощью нозерн-блоттинга (фигура 2Е). D=дни после введения дсРНК-GFP в улей.

На фиг. 3 представлена фотография, иллюстрирующая результаты анализа ОТ-ПЦР экстрагированной из варроа РНК в дни, указанные в верхнем ряду (время, как указано на фигуре 1). Числа зеленым (верхний ряд) указывают на особи варроа, которых поместили на проглотивших дсРНК-GFP пчел и числа черным указывают на РНК от варроа, помещенных на контрольных пчел. + = положительный контроль (несущая GFP плазмида).

На фиг. 4 представлена фотография, иллюстрирующая ОТ-ПЦР РНК варроа с праймерами для белка - ингибитора апоптоза (IAP; последовательность 27). М: маркеры размера. Полосы 1-3: матричная РНК варроа из ульев, обработанных дсРНК последовательностей 27. Полоса 4: матричная РНК варроа из контрольных ульев. Полоса 5: положительный контроль (несущая IAP плазмида). Полоса 6: отрицательный контроль (нет матрицы).

На фиг. 5 представлена гистограмма, иллюстрирующая количество варроа на каждую пчелу (взрослые пчелы вместе с личинками внутри запечатанных ячеек) в контрольных ульях и в ульях, обработанных смесью дсРНК I (минимальная обработка) и смесью дсРНК II (максимальная обработка).

На фиг. 6 представлена фотография, иллюстрирующая передачу дсРНК от взрослых пчел клещам варроа. ОТ-ПЦР проводили на РНК от пчел, которых кормили GFP-специфической дсРНК, и необработанных контрольных пчел (полосы В+, В-, соответственно) и РНК от клещей варроа, паразитирующих на обработанных или необработанных контрольных пчелах (полосы V+ и V-, соответственно). Полоса С: положительный контроль (несущая GFP плазмида). М = маркеры размера;

На фиг. 7 представлена фотография, иллюстрирующая передачу дсРНК от взрослых пчел клещам варроа и варроа обратно пчелам. Пчел заражали или клещами варроа, несущими GFP дсРНК или миРНК (V+), или контрольными клещами (V), свободными от GFP-специфической дсРНК или миРНК. В+ представляет собой РНК, амплифицированную из пчел, зараженных получившими GFP-дсРНК или миРНК клещами, В- представляет собой РНК, амплифицированную из пчел, зараженных контрольными клещами, свободными от GFP-специфической дсРНК или миРНК. Полоса С: положительный контроль (несущая GFP плазмида). М = маркеры размера;

На фиг. 8 представлено схематическое представление 60-дневного эксперимента по кормлению специфической для варроа дсРНК, включая в себя схему кормления медоносных пчел и график испытания для экспрессии гена варроа (внизу) и жизненный цикл медоносной пчелы, которой питается клещ варроа;

На фиг. 9A-9F проиллюстрирован сайленсинг экспрессии гена варроа после горизонтального переноса специфической для варроа дсРНК от пчелы клещу варроа. На фиг. 9А-9С представлены графики, представляющие средние значения (±SE) результатов ОТ-ПЦР в реальном времени РНК варроа с зондами в отношении мРНК гена варроа: РНК полимераза III (9А, зонды SEQ ID NO. 137 и 138), IAP1 и IAP2 (9В, зонды SEQ ID NO. 141 и 142) и вакуолярная протонная АТФаза (9С, зонды SEQ ID NO. 139 и 140), соответственно. РНК варроа экстрагировали из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 5 специфических для варроа дсРНК (смесь I), или из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 14 специфических для варроа дсРНК (смесь II). Контроли представляют РНК варроа, экстрагированную из клещей, заражающих необработанных пчел, или клещей, заражающих пчел, которых кормили нерелевантной (GFP) дсРНК. На фиг. 9D-9F представлены фотографии, на которых показана полуколичественная ОТ-ПЦР РНК варроа, иллюстрирующая специфический сайленсинг экспрессии гена FAS варроа - ингибитора апоптоза в клещах, заражающих пчел, которых кормили специфической для варроа дсРНК. РНК FAS ингибитора апоптоза амплифицировали (с применением праймеров SEQ ID NO. 145 и 146) в РНК варроа, экстрагированной из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 5 специфических для варроа дсРНК (9D, смесь I), или из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 14 специфических для варроа дсРНК (9D, смесь II). Контроли представляют амплификацию РНК FAS ингибитора апоптоза в РНК варроа, экстрагированной из клещей, заражающих необработанных пчел (9Е, необработанный), или клещей, заражающих пчел, которых кормили нерелевантной (9Е, дсРНК-GFP) дсРНК. На фиг. 9F представлен контроль, показывающий амплификацию конститутивного гена актина (с применением праймеров SEQ ID NO. 147 и 148). Числа указывают на число циклов амплификации. - ОТ реакции служат в качестве контролей для примесей ДНК. Отмечают сильный сайленсинг экспрессии FAS ингибитора апоптоза у клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью I или смесью II (фиг. 9D);

На фиг. 10 представлен график, показывающий среднее (±SE) общего количества пчел (запечатанный расплод и взрослые особи) у пчел, которых кормили смесью 5 специфических для варроа дсРНК (смесь I) или смесью 14 специфических для варроа дсРНК (смесь II), или контрольных пчел, которых кормили нерелевантной (dsGFP) дсРНК или необработанных пчел (необработанные). Не обнаружили никаких существенных различий;

На фиг. 11 представлен график, показывающий заражение варроа (количество клещей) у обработанных пчел и контролей (как на фиг. 10), показывая значительное снижение подверженности заражению варроа после кормления пчел смесью I или смесью II.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение согласно некоторым его вариантам осуществления относится к способам и композициям для снижения подверженности пчел заражению клещом варроа.

Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение не обязательно ограничено в своем применении деталями, представленными в следующем описании или проиллюстрированными примерами. Согласно настоящему изобретению возможны другие варианты осуществления или его можно осуществить на практике или выполнить различными путями.

Пчелы подвержены множеству различных вирусных инфекций. Было показано, что лечение таких инфекций отрицательной регуляцией конкретного вирусного генного продукта успешно в устранении индуцированных вирусами инфекций у пчелы (смотрите заявку на выдачу патента США №20090118214).

Авторы настоящего изобретения в настоящем документе предлагают лечение заражений клещом варроа у пчел путем отрицательной регуляции конкретных генных продуктов клеща варроа.

Клещи варроа паразитируют на куколках и взрослых пчелах и размножаются в гонидиях куколок. Клещи используют свои ротовые органы для прокола экзоскелета и питаются гемолимфой пчел. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что полинуклеотидные средства, введенные пчелам для лечения заражений клещом варроа, присутствовали в гемолимфе пчел, тем самым становясь доступными клещу.

Авторы настоящего изобретения показали, что последовательности дсРНК могут успешно передаваться клещам варроа (фигуры 6 и 7), что дсРНК может служить для отрицательной регуляции экспрессии конкретного гена у клеща варроа (9А-9Е) и дополнительно, что нацеленное воздействие на конкретные гены для отрицательной регуляции может привести к снижению числа клещей варроа (фигура 11). Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что последовательности РНК, переданные клещам от пчел, которых кормили дсРНК, могли передаваться обратно необработанным, "нативным" пчелам посредством заражения варроа (фигура 7).

Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ профилактики или лечения заражения пчелы клещом Varroa destructor, включающий введение пчеле из улья эффективного количества по меньшей мере одного нуклеиновокислотного средства, характеризующегося последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 93-105 и 106, тем самым обеспечивая профилактику или лечение заражения пчелы клещом Varroa destructor.

Используемый в настоящем документе термин "пчела" относится как к взрослой пчеле, так и ее ячейкам с куколками. Согласно одному варианту осуществления пчела находится в улье.

Взрослую пчелу определяют как любое из насекомых с несколькими крыльями, волосатым брюшком, как правило, с жалом надсемейства Apoidea в отряде Hymenoptera, включая в себя как ведущие одиночный образ жизни виды, так социальные виды, и характеризующихся сосательными и жевательными ротовыми аппаратами для сбора нектара и пыльцы. Примеры видов пчел включают в себя без ограничения Apis, Bombus, Trigona, Osmia и подобное. Согласно одному варианту осуществления пчелы включают в себя без ограничения шмелей (Bombus terrestris), медоносных пчел (Apis mellifera) (включая в себя пчел-сборщиц и ульевых пчел) и Apis cerana.

Согласно одному варианту осуществления пчела представляет собой часть колонии.

Термин "колония" относится к популяции пчел, содержащей десятки, как правило, до нескольких десятков тысяч пчел, которые кооперируются для построения гнезд, сбора пищи и вывода расплода. Колония в норме содержит одну матку, при этом остальные пчелы являются либо "рабочими" (самки), либо "трутнями" (самцы). Социальная структура колонии поддерживается маткой и рабочими пчелами и зависит от эффективной системы коммуникации. Разделение труда сред касты рабочих пчел в первую очередь зависит от возраста пчелы, но варьирует в зависимости от потребностей колонии. Размножение и сила колонии зависят от матки, количества пищевых запасов и размера рабочей силы. Медоносные пчелы также могут быть разделены на категории: "ульевые пчелы", как правило, в течение первой части жизненного цикла рабочих пчел, в течение которой "ульевая пчела" выполняет задачи в пределах улья, и "пчела-сборщица", в течение последней части жизненного цикла пчелы, в ходе которой "сборщица" определяет местонахождение и собирает пыльцу и нектар снаружи улья и приносит нектар или пыльцу в улей для потребления и запасания.

Согласно настоящему аспекту настоящего изобретения средства согласно настоящему изобретению используют для предотвращения существования клеща Varroa destructor в качестве паразита на пчеле или ее личинках.

Фраза "клещ Varroa destructor " относится к наружному паразитическому клещу, который поражает медоносных пчел Apis cerana и Apis mellifera. Клещ может присутствовать на стадии взрослой особи, питаясь на пчеле, или на стадии личинки, внутри гонидия медоносной пчелы.

Как упоминалось, средства настоящего изобретения способны отрицательно регулировать экспрессию генного продукта клеща Varroa destructor.

Используемая в настоящем документе фраза "генный продукт" относится к молекуле РНК или белку.

Примеры последовательностей, представляющих целевые сегменты гена варроа, которые могут находиться под направленным воздействием, включают в себя без ограничения последовательности нуклеиновых кислот генов варроа, фланкированные последовательностями промотора Т7 в следующих последовательностях (длина специфической для варроа последовательности указана в скобках):

SEQ ID NO: 93 - ген варроа, гомологичный α-тубулину (411 оснований); SEQ ID NO: 94 - ген варроа, гомологичный α-тубулину (277 оснований); SEQ ID NO: 95 - ген варроа, гомологичный α-тубулину (329 оснований); SEQ ID NO: 96 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (380 оснований); SEQ ID NO: 97 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (426 оснований); SEQ ID NO: 98 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе II (366 оснований); SEQ ID NO: 99 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (324 основания); SEQ ID NO: 100 - ген варроа, гомологичный вакуолярной транслоцирующей АТФазе (311 оснований); SEQ ID NO: 101 - ген варроа, гомологичный вакуолярной протонной АТФазе (210 оснований); SEQ ID NO: 102 - ген варроа, гомологичный Na+/K+ АТФазе (307 оснований); SEQ ID NO: 103 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза IAP (263 основания); SEQ ID NO: 104 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (277 оснований); SEQ ID NO: 105 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза IAP 1 и IAP2 (263 основания); SEQ ID NO: 106 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза IAP 1 и IAP2, обратная ориентация (282 основания).

Дополнительные генные продукты, которые могут отрицательно регулироваться согласно настоящему аспекту настоящего изобретения, включают в себя без ограничения субъединицу 2 НАДФ дегидрогеназы; - регистрационный номер Genbank NC 004454; АТФ субъединицу 8 синтетазы; - NC_004454; субъединицу 6 АТФ синтетазы; - NC 004454; ген натриевого канала - регистрационный номер Genbank FJ216963; субъединицу I цитохромоксидазы - регистрационный номер Genbank EF025469.

SEQ ID NO: 1. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 1); SEQ ID NO: 2. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 2); SEQ ID NO: 3. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 3); SEQ ID NO: 4. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 4); SEQ ID NO: 5. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 5); SEQ ID NO: 6. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 6); SEQ ID NO: 7. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 7); SEQ ID NO: 8. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 8); SEQ ID NO: 9. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 9); SEQ ID NO: 10. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (сегмент 1); SEQ ID NO: 11. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (сегмент 2); SEQ ID NO: 12. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (сегмент 3); SEQ ID NO: 13. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 1); SEQ ID NO: 14. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 2); SEQ ID NO: 15. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 3); SEQ ID NO: 16. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 4); SEQ ID NO: 17. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 5); SEQ ID NO: 18. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 6); SEQ ID NO: 19. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 7) SEQ ID NO: 20. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 8); SEQ ID NO: 21. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 9); SEQ ID NO: 22. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 1); SEQ ID NO: 23. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 2); SEQ ID NO: 24. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 3); SEQ ID NO: 25. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 4); SEQ ID NO: 26. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 5); SEQ ID NO: 27. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 6); SEQ ID NO: 28. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 7); SEQ ID NO: 29. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 8); SEQ ID NO: 30. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (сегмент 1); SEQ ID NO: 31. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (сегмент 2); SEQ ID NO: 32. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (сегмент 3); SEQ ID NO: 33. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 1); SEQ ID NO: 34. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 2); SEQ ID NO: 35. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 3); SEQ ID NO: 36. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 4); SEQ ID NO: 37. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 5); SEQ ID NO: 38. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 6); SEQ ID NO: 39. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 7); SEQ ID NO: 40. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 8); SEQ ID NO: 41. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 9); SEQ ID NO: 42. субъединица 2 НАДФ дегидрогеназы; (NC_004454): основания 709-974; SEQ ID NO: 43. субъединица 8 АТФ синтетазы; (NC_004454): основания 3545-3643; SEQ ID NO: 44. Белок натриевого канала (AY259834): основания 3336-3836.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения полинуклеотидное средство является специфическим для целевой РНК и перекрестно не ингибирует или подвергает сайленсингу ген или сплайс-вариант, который проявляет 99% или меньше глобальной гомологии относительно целевого гена, например, меньше чем 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% глобальной гомологии относительно целевого гена.

Полинуклеотидное средство предпочтительно содержит последовательность, по меньшей мере на 90% гомологичную SEQ ID NO: 93-105 и 106, более предпочтительно по меньшей мере на 91% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 91% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 92% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 93% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 94% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 96% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 97% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 98% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 99% гомологичную SEQ ID NO: 93-105 и 106.

Следует понимать, что нацеленному воздействию может подвергаться больше одного гена, чтобы сделать максимальным цитотоксический эффект на клещей варроа.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления следующая группа генов подвергается нацеленному воздействию - субъединица А АТФазы, РНК полимераза III, ингибитор апоптоза (IAP), ингибитор апоптоза FAS и α-тубулин (например с применением средств нуклеиновой кислоты, характеризующихся последовательностью, представленной в SEQ ID NO. 1, 13, 27, 30 и 39, или средств нуклеиновой кислоты, характеризующихся последовательностью, представленной в SEQ ID NO. 93, 96, 100, 104 и 106).

Согласно другому варианту осуществления следующая группа генов подвергается нацеленному воздействию - субъединица А АТФазы, РНК полимераза I, РНК полимераза III, ингибитор апоптоза (IAP), ингибитор апоптоза FAS и α-тубулин.

Следует понимать, что наряду с отрицательной регуляцией ряда генов, настоящее изобретение дополнительно включает применение ряда средств для отрицательной регуляции одного и того же гена (например, ряд дсРНК, каждая из которых гибридизируется с различным сегментом одного и того же гена).

Согласно одному варианту осуществления используют два полинуклеотидных средства из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют три полинуклеотидных средства из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют четыре полинуклеотидных средства из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют пять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют шесть полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют семь полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют восемь полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют девять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют десять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют одиннадцать полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют двенадцать полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют тринадцать полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют каждое из полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.

Согласно одному варианту осуществления используют пять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106 - например, SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.

Инструменты, которые способны идентифицировать видоспецифические последовательности, могут использоваться с этой целью - например, BLASTN и другие подобные компьютерные программы.

Используемый в настоящем документе термин "отрицательная регуляция экспрессии" относится к индукции, прямо или опосредованно, снижения транскрипции требуемого гена, снижения количества, стабильности или транслируемости продуктов транскрипции (например, РНК) гена и/или снижения трансляции полипептида(ов), кодируемого(ых) требуемым геном.

Отрицательная регуляция экспрессии генного продукта клеща Varroa destructor может подвергаться мониторингу, например, путем прямого обнаружения генных транскриптов (например, с помощью ПЦР), путем обнаружения полипептида(ов), кодируемого(ых) геном или патогенной РНК пчелы (например, с помощью вестерн-блоттинга или иммунопреципитации), путем обнаружения биологической активности полипептидов, кодируемых геном (например, каталитическая активность, связывание с лигандом и подобное) или путем мониторинга изменений у клеща Varroa destructor (например, сниженная пролиферация клеща, сниженная вирулентность клеща, сниженная подвижность клеща и т.д.) и путем исследования инфекционности/патогенности пчелы.

Полинуклеотидные отрицательно регулирующие средства согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с любым способом синтеза полинуклеотидов, известным в настоящей области техники, таким как ферментативный синтез или твердофазный синтез. Устройство и реагенты для проведения твердофазного синтеза коммерчески доступны, например, от Applied Biosystems. Также можно использовать любые другие средства для такого синтеза; фактический синтез полинуклеотидов находится в компетенции специалиста в настоящей области техники и может быть осуществлен посредством общепринятых методик, подробно изложенных, например, в "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988) и "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984) с использованием твердофазной химии, например, цианоэтилфосфорамидита с последующим снятием защитных групп, деминерализацией и очищением, например, с помощью автоматизированного способа с применением тритил-она или ВЭЖХ.

Полинуклеотидные средства согласно настоящему изобретению могут содержать гетероциклические нуклеозиды, состоящие из пуриновых и пиримидиновых оснований, связанных в направлении 3' - 5' фосфодиэфирной связью.

Предпочтительно используемые полинуклеотидные средства представляют собой средства с модифицированным каркасом, межнуклеозидными связями или основаниями, как в широком смысле описано в настоящем документе ниже.

Конкретные примеры предпочтительных полинуклеотидных средств, применимых согласно настоящему аспекту настоящего изобретения, включают в себя полинуклеотидные средства, содержащие модифицированные каркасы или не встречающиеся в природе межнуклеозидные связи. Полинуклеотидные средства, характеризующиеся модифицированными каркасами, включают в себя средства, которые сохраняют атом фосфора в каркасе, как раскрыто в патентах США №№:4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306;5550111;5563253; 5571799; 5587361 и 5625050.

Предпочтительные модифицированные полинуклеотидные каркасы включают в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая в себя 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая в себя 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, характеризующиеся нормальными 3-5' связями, их 2-5' связанные аналоги, и соединения, характеризующиеся инвертированной полярностью, причем соседние пары нуклеозидных звеньев связаны 3'-5' - 5'-3' или 2'-5' - 5'-2'. Также можно использовать различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.

Альтернативно, модифицированные полинуклеотидные каркасы, которые не включают в себя атом фосфора, характеризуются каркасами, которые образованы короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают в себя каркасы, характеризующиеся морфолино связями (образованными частично из части сахара нуклеозида); силоксановые каркасы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые каркасы; формацетильные и тиоформацетильные каркасы; метиленформацетильные и тиоформацетильные каркасы; содержащие алкен каркасы; сульфаматные каркасы; метилениминовые и метиленгидразиновые каркасы; сульфонатные и сульфонамидные каркасы; амидные каркасы; и другие, характеризующиеся смешанными N, О, S и СН2 составными частями, раскрытыми в патентах США №№5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439.

Другие полинуклеотидные средства, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, представляют собой полинуклеотидные средства, модифицированные как в отношении сахара, так и в отношении межнуклеозидной связи, т.е. каркас нуклеотидных звеньев заменен новыми группами. Основные звенья сохраняют для комплементарности с соответствующей полинуклеотидной мишенью. Пример такого полинуклеотидного миметика включает в себя пептидную нуклеиновую кислоту (PNA). Полинуклеотид PNA относится к полинуклеотиду, в котором сахарный каркас замещен содержащим амид каркасом, в частности, аминоэтилглициновым каркасом. Основания сохраняются и связываются напрямую или опосредовано с аза-атомами азота амидной части каркаса. Патенты США, которые раскрывают получение соединений PNA, включают в себя без ограничения патенты США №№5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен посредством ссылки в настоящий документ. Другие модификации каркасов, которые можно использовать в настоящем изобретении, раскрыты в патенте США №6303374.

Полинуклеотидные средства согласно настоящему изобретению также могут включать в себя модификации или замещения оснований. Используемый в настоящем документе термин "немодифицированные" или "природные" основания включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные основания включают в себя без ограничения другие синтетические и природные основания, такие как 5-метилцитозин (5-me-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил-урацил и -цитозин, 6-азо-урацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные основания включают в себя основания, раскрытые в патенте США №3687808, основания, раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz