Генетически модифицированные мыши, экспрессирующие химерные молекулы главного комплекса гистосовместимости

Генетически модифицированные мыши, экспрессирующие химерные молекулы главного комплекса гистосовместимости

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №61/552584, поданной 28 октября 2011 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к не являющемуся человеком животному, например, грызуну (например, мыши или крысе), которое генетически сконструировано для экспрессии гуманизированного белка главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса, а также к зародышам, тканям и клеткам, его экспрессирующим. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения генетически модифицированного не являющегося человеком животного, которое экспрессирует гуманизированный белок МНС II. Также предусматриваются способы применения не яляющихся человеком животных, клеток и тканей, которые экспрессируют гуманизированный белок МНС II класса, для идентификации пептидов, которые активируют лимфоциты и привлекают Т-клетки, и для разработки вакцин и других терапевтических средств для человека.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В приобретенном иммунном ответе чужеродные антигены распознаются рецепторными молекулами на В-лимфоцитах (например, иммуноглобулинами) и Т-лимфоцитах (например, Т-клеточным рецептором, или TCR). Эти чужеродные антигены презентируются на поверхности клеток в виде пептидных фрагментов специализированными белками, имеющими общее название молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС). Молекулы МНС кодируются множественными локусами, которые встречаются в виде соединенного кластера генов, который охватывает приблизительно 4 м.п.н. У мышей гены МНС находятся на хромосоме 17, и исторически они называются гены гистосовместимости 2 (Н-2). У людей гены находятся на хромосоме 6 и называются гены антигена лейкоцита человека (HLA). Локусы у мышей и людей являются полигенными; они включают в себя три высоко полиморфных класса генов МНС (I, II и III класс), которые проявляют сходную организацию в геноме человека и мыши (смотрите фиг. 2 и фиг. 3 соответственно).

Локусы МНС проявляют самый высокий полиморфизм в геноме; некоторые гены представлены >300 аллелями (например, HLA-DR-β человека и HLA-B человека). Все гены МНС I и II класса могут презентировать пептидные фрагменты, но каждый ген экспрессирует белок с различными характеристиками связывания, отражая полиморфизмы и аллельные варианты. Любой рассматриваемый индивидуум содержит уникальный спектр пептидных фрагментов, которые могут быть презентированы на клеточной поверхности В- и Т-клеткам в ходе иммунного ответа.

Как люди, так и мыши содержат гены МНС II класса (смотрите фиг. 2 и 3). У людей классические гены МНС II называются HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR, тогда как у мышей они представляют собой Н-2А и Н-2Е (часто сокращенно I-Α и 1-Е соответственно). Дополнительные белки, кодируемые генами в локусе МНС II, HLA-DM и HLA-DO у людей и Н-2М и Н-20 у мышей, не встречаются на клеточной поверхности, но локализуются в компартменте эндоцитоза и обеспечивают правильную загрузку молекул МНС II пептидами. Молекулы II класса состоят из двух полипептидных цепей: α цепи и β цепи. Внеклеточная часть цепи α содержит два внеклеточных домена, α1 и а2; и внеклеточная часть цепи β также содержит два внеклеточных домена, β1 и β2 (смотрите фиг. 1). Цепи α и β нековалентно соединены друг с другом.

Молекулы МНС II класса экспрессируются на антигенпрезентирующих клетках (АПК), например, В-клетках, макрофагах, дендритных клетках, эндотелиальных клетках в ходе воспаления и т.д. Молекулы МНС II, экспрессирующиеся на поверхности АПК, как правило, презентируют образованные во внутриклеточных везикулах антигены CD4+ Т-клеткам. Чтобы принимать участие в CD4+Т-клеточной активации, комплекс МНС класса II с представляющим интерес антигеном должен быть достаточно стабильным, чтобы длительно существовать для привлечения CD4+ Т-клетки. Когда CD4+ Т-хелперная клетка привлекается комплексом чужеродный пептид/МНС II на поверхности АПК, Т-клетка активируется для высвобождения цитокинов, которые принимают участие в иммунном ответе на возбудителя.

Не все антигены будут вызывать активацию Т-клеток вследствие механизмов толерантности. Тем не менее, при некоторых заболеваниях (например, злокачественной опухоли, аутоиммунных заболеваниях) пептиды, происходящие из собственных белков, становятся мишенью клеточного компонента иммунной системы, что приводит к разрушению клеток, презентирующих такие пептиды. Произошел значительный прогресс в распознавании антигенов, являющихся клинически значимыми (например, антигенов, связанных с различными типами злокачественных опухолей). Тем не менее, для улучшения идентификации и выбора пептидов, которые будут вызывать подходящий ответ в Т-клетке человека, в частности пептидов клинически значимых антигенов, остается потребность в системах in vivo и in vitro, которые имитируют аспекты иммунной системы человека. Таким образом, существует необходимость в биологических системах (например, генетически модифицированных не относящихся к человеку животных и клетках), которые могут проявлять компоненты иммунной системы человека.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусматривается биологическая система для получения или идентификации пептидов, которые ассоциируются с белками МНС II класса человека и их химерами и связываются с CD4+ Т-клетками. Предусматриваются не являющиеся человеком животные, содержащие не являющиеся человеческими клетки, которые экспрессируют гуманизированные молекулы, функционирующие в клеточном иммунном ответе. Также предусматриваются гуманизированные локусы грызуна, которые кодируют гуманизированные белки МНС II. Также предусматриваются гуманизированные клетки грызуна, которые экспрессируют гуманизированные молекулы МНС. Предусматриваются системы in vivo и in vitro, которые содержат гуманизированные клетки грызуна, причем клетки грызуна экспрессируют одну или несколько гуманизированных молекул иммунной системы.

В настоящем документе предусматривается не являющееся человеком животное, например, грызун (например, мышь или крыса), содержащее в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированный комплекс МНС II, причем человеческая часть гуманизированного комплекса МНС II содержит внеклеточный домен комплекса МНС II человека, например, гуманизированный внеклеточный домен α МНС II и гуманизированный внеклеточный домен β МНС II.

Согласно одному аспекту в настоящем документе предусматривается не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена α МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α МНС II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть такого химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α МНС II содержит внеклеточный домен α МНС II человека. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное экспрессирует функциональный комплекс МНС II на поверхности клетки животного. Согласно одному варианту осуществления внеклеточный домен α МНС II человека у животного содержит домены α1 и α2 МНС II человека; согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α МНС II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида α МНС II. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α МНС II, экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку α промоторных и регуляторных элементов МНС II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида происходит из белка HLAII класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP, например, человеческая часть происходит из белка HLA-DR4. Не являющееся человеком животное может представлять собой грызуна, например, мышь. Согласно одному аспекту не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена α МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α МНС II, дополнительно содержит на эндогенном локусе гена β МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β МНС II. Также в настоящем документе предусматривается способ получения генетически модифицированного не являющегося человеком животного, содержащего на эндогенном локусе гена α МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α МНС II. Такой способ может предусматривать замещение на эндогенном локусе гена α МНС II нуклеотидной последовательности, кодирующей эндогенный не относящийся к человеку полипептид α МНС II, на нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α МНС II.

Также в настоящем документе предусматривается не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена β МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β МНС II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть такого химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β МНС II содержит внеклеточный домен β МНС II человека. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное экспрессирует функциональный комплекс МНС II на поверхности клетки животного. Согласно одному варианту осуществления человеческий внеклеточный домен β МНС II у животного содержит домены β1 и β2 МНС II человека; согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β МНС II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида β МНС II. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β МНС II, экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку β промоторных и регуляторных элементов МНС II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида происходит из белка HLAII класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP, например, человеческая часть происходит из белка HLA-DR4. Не являющееся человеком животное может представлять собой грызуна, например, мышь. Согласно одному аспекту не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена β МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β МНС II, дополнительно содержит на эндогенном локусе гена α МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α МНС II. Также в настоящем документе предусматривается способ получения генетически модифицированного не являющегося человеком животного, содержащего на эндогенном локусе гена β МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β МНС II. Такой способ может предусматривать замещение на эндогенном локусе гена β МНС II нуклеотидной последовательности, кодирующей эндогенный не относящийся к человеку полипептид β МНС II, на нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β МНС II.

Согласно одному аспекту предусматривается не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена МНС II первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α МНС II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β МНС II, причем человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α МНС II содержит человеческий внеклеточный домен α МНС II, и человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β МНС II содержит человеческий внеклеточный домен β МНС II. Согласно одному варианту осуществления химерные человеческие/не относящиеся к человеку полипептиды α и β МНС II образуют функциональный химерный комплекс МНС II (например, человеческий/не относящийся к человеку комплекс МНС II) на поверхности клетки. Согласно одному варианту осуществления человеческий внеклеточный домен α МНС II содержит домены α1 и α2 человека МНС II человека. Согласно одному варианту осуществления человеческий внеклеточный домен β МНС II содержит домены β1 и β2 человека МНС II человека. Согласно различным аспектам первая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку α промоторных и регуляторных элементов МНС II. Согласно различным аспектам вторая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку β промоторных и регуляторных элементов МНС II. Согласно некоторым вариантам осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α МНС II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида α МНС II. Согласно некоторым вариантам осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β МНС II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида β МНС II.

Согласно различным вариантам осуществления не являющееся человеком животное представляет собой грызуна, и человеческие части химерных человеческих/относящихся к грызуну полипептидов α и β МНС II содержат последовательности человека, происходящие из белка HLA II класса, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения человеческие части химерных человеческих/относящихся к грызуну последовательностей α и β МНС II происходят из последовательности HLA-DR4 человека; таким образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточный домен α МНС II, происходит из последовательности гена HLA-DRα*01, и нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточный домен β МНС II, происходит из последовательности, кодирующей ген ΗLΑ-DRβ1*04.

Согласно различным вариантам осуществления настоящего изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности расположены на одной хромосоме. Согласно некоторым аспектам животное содержит две копии локуса МНС II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности, тогда как согласно другим аспектам животное содержит одну копию локуса МНС II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности. Таким образом, животное может являться гомозиготным или гетерозиготным в отношении локуса МНС II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности.

Согласно некоторым аспектам химерный полипептид α МНС II и/или химерный полипептид β МНС II функционально связан с не относящейся к человеку лидерной последовательностью.

Согласно одному аспекту генетически сконструированное не являющееся человеком животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из группы, состоящей из мыши и крысы. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления не относящиеся к человеку последовательности химерных генов α и β МНС II происходят из нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок МНС II мыши, например, белок Н-2Е мыши. Согласно одному варианту осуществления грызун (например, мышь или крыса) согласно настоящему изобретению не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды МНС II из их эндогенных локусов. Согласно одному варианту осуществления, в которых грызун представляет собой мышь, мышь не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды Н-2Е и Н-2А из их эндогенных локусов.

Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления предусматривается мышь, содержащая на эндогенном локусе МНС II мыши первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид α МНС II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид β МНС II, причем человеческая часть химерного полипептида α МНС II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида α белка HLA-DR4 человека, и человеческая часть химерного человеческого/мышиного полипептида β МНС II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида β белка HLA-DR4 человека, причем мишиная часть химерного полипептида α МНС II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α Н-2Е мыши, и мышиная часть химерного полипептида β МНС II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β Н-2Е мыши, и при этом мышь экспрессирует функциональный химерный HLA-DR4/H-2E комплекс МНС II. Согласно некоторым аспектам внеклеточный домен химерного полипептида α МНС II содержит домены α1 и а2 человека; согласно некоторым аспектам внеклеточный домен химерного полипептида β МНС II содержит домены β1 и β2 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления первая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных α промоторных и регуляторных элементов МНС II мыши, и вторая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных β промоторных и регуляторных элементов МНС II мыши. Согласно различным вариантам осуществления мышь не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды МНС II, например, полипептиды Н-2Е и Н-2А, из их эндогенных локусов. Согласно некоторым аспектам мышь содержит две копии локуса МНС II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности, тогда как согласно другим аспектам мышь содержит одну копию локуса МНС II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности.

Также предусматриваются способы получения генетически сконструированных не являющихся человеком животных (например, грызунов, например, мышей или крыс), описанных в настоящем документе. Согласно различным вариантам осуществления не являющихся человеком животных (например, грызунов, например, мышей или крыс) по настоящему изобретению получают путем замещения эндогенных последовательностей МНС II нуклеотидными последовательностями, кодирующими химерные человеческие/не относящиеся к человеку (например, человеческие/мышиные) полипептиды α и β МНС II. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу модификации локуса МНС II грызуна (например, мыши или крысы) для экспрессии химерного человеческого/относящегося к грызуну комплекса МНС II, предусматривающему замещение на эндогенном локусе МНС II мыши нуклеотидной последовательности, кодирующей комплекс МНС II грызуна, на нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/относящийся к грызуну комплекс МНС II. Согласно одному аспекту способа нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/относящийся к грызуну комплекс МНС II, содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен цепи α МНС II человека и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α МНС II грызуна, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен цепи β МНС II человека и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β МНС II грызуна. Согласно некоторым аспектам относящаяся к грызуну часть химерного комплекса МНС II происходит из белка Н-2Е мыши, и человеческая часть происходит из белка HLA-DR4 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления замещение описанных в настоящем документе эндогенных локусов МНС II проводят в одной ES (эмбриональной стволовой) клетке, и одну ES клетку вводят в зародыш грызуна (например, мыши или крысы) для получения генетически модифицированного грызуна (например, мыши или крысы).

Также в настоящем документе предусматриваются клетки, например, выделенные антигенпрезентирующие клетки, полученные от описанных в настоящем документе не являющихся человеком животных (например, грызуны, например, мыши или крысы). Также предусматриваются ткани и зародыши, полученные от описанных в настоящем документе не являющихся человеком животных.

Любой из описанных в настоящем документе вариантов осуществления и аспектов может использоваться совместно друг с другом, если иное не указано или не очевидно из контекста. Другие варианты осуществления станут очевидными специалистам в настоящей области техники из обзора последующего подробного раскрытия. Последующее подробное раскрытие включает в себя иллюстративные представления различных вариантов осуществления настоящего изобретения, которые не ограничивают заявленное настоящее изобретение. Прилагаемые фигуры составляют часть настоящего описания изобретения и вместе с описанием служат исключительно для иллюстрации вариантов осуществления, а не для ограничения настоящего изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлено схематическое изображение молекулы МНС II класса, экспрессирующейся на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АПК), содержащей четыре домена: α1, α2, β1 и β2. Серые кружки представляют пептид, связанный на пептидсвязывающей бороздке.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) относительной геномной структуры HLA человека, показывающее гены I, II и III класса.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) относительной геномной структуры МНС мыши, показывающее гены I, II и III класса.

На фиг. 4 (A-D) схематически проиллюстрирована (без соблюдения масштаба) стратегия создания нацеливающего вектора, содержащего гуманизированные I-Е β и I-Е α (т.е. химеру Η-2Εβ/ΗLΑ-DRβ1*04 и H-2Eα/HLA-DRα*01 соответственно). На фиг. 4С конечную гуманизированную последовательность МНС II из фиг. 4В лигируют между сайтами рестрикции PI-SceI и I-CeuI конечной конструкции из фиг. 4А для создания конструкции, содержащей гуманизированный МНС II и экзон 1 I-Eα из BALB/c. Pg=псевдоген; BHR=бактериальная гомологичная рекомбинация; СМ=хлорамфеникол; spec=спектиномицин; hyg=гигромицин; neo=неомицин; ЕР=электропорация. Треугольники представляют экзоны, закрашенные треугольники представляют экзоны мыши от мыши C57BL/6 (за исключением заштрихованных треугольников, которые представляют экзон 1 I-Eα от мыши BALB/c) и незакрашенные треугольники представляют экзоны человека.

На фиг. 5 показано схематическое изображение, без соблюдения масштаба, генов ΙΕ и I-Α МНС II класса, показывающее нокаут мышиного локуса с использованием кассеты гигромицина с последующим введением вектора, содержащего гуманизированные I-Е β и I-Е α (т.е. химеру Η-2Εβ/ΗLΑ-DRβ1*04 и H-2Eα/HLA-DRα*01 соответственно). Незакрашенные треугольники представляют экзоны человека; закрашенные треугольники представляют экзоны мыши. Используемые для генотипирования зонды обведены кружком.

На фиг. 6 показано схематическое изображение, без соблюдения масштаба, Cre-опосредованного удаления кассеты неомицина из фиг. 5. Незакрашенные треугольники представляют экзоны человека; закрашенные треугольники представляют экзоны мыши. Две верхние цепи представляют локусы МНС II у гетерозиготной мыши с гуманизированным МНС II, несущей селективную кассету неомицина, и две нижние цепи представляют локусы МНС II у гетерозиготной мыши с гуманизированным МНС II с удаленной кассетой неомицина.

На фиг. 7 показано схематическое сравнительное изображение, без соблюдения масштаба, локусов II класса мыши и человека. Гены II класса представлены прямоугольниками, а пустые прямоугольники представляют псевдогены. Представлены относительные размеры (т.п.н.) различных фрагментов нуклеиновой кислоты.

На фиг. 8, на левой панели, представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) стратегии гуманизации для цепи α МНС II; в частности на фигуре показано замещение доменов α1 и α2, кодируемых экзонами 2 и 3 гена α МНС II, при сохранении трансмембранной и цитоплазматической хвостовых последовательностей мыши. В гуманизированном локусе лидерная последовательность α МНС II получена от штамма BALB/c мыши. На правой панели показана гуманизация цепи β МНС II; в частности на фигуре показано замещение доменов β1 и β2, кодируемых экзонами 2 и 3 гена β МНС II, при сохранении мышиной лидерной и трансмембранной и цитоплазматической хвостовых последовательностей мыши. В верхнем ряду представлены все последовательности человека; в среднем ряду представлены все последовательности мыши; в нижнем ряду представлены все гуманизированные последовательности, с экзонами 2 и 3, происходящими из генов HLA-DR человека.

На фиг. 9 показан анализ FACS с антителом к HLA-DR В-клеток от мыши, гетерозиготной в отношении химерного HLA-DR4 (кассета neo удалена) в присутствии (1681НЕТ + поли(I:С) или при отсутствии (1681НЕТ ) поли(I:С), и от мыши дикого типа (мыши WT).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным не являющимся человеком животным (например, мышам, крысам, кроликам и т.д.), которые экспрессируют относящийся к человеку или гуманизированный полипептид МНС II; к зародышам, клеткам и тканям, его содержащим; способам их получения; а также способам их применения. Если не указано иное, все используемые в настоящем документе термины и фразы включают значения, которые подразумеваются под терминами и фразами в настоящей области техники, если противоположное ясно не указано или ясно не следует из контекста, в котором используется термин или фраза.

Термин "консервативная", используемый для описания консервативной аминокислотной замены, включает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком с R-группой боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Консервативные аминокислотные замены могут быть достигнуты путем модификации нуклеотидной последовательности так, чтобы ввести изменение нуклеотида, которое будет кодировать консервативную замену. Как правило, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять представляющие интерес функциональные свойства белка, например, способность МНС II к презентации представляющего интерес пептида. Примеры групп аминокислот, которые содержат боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают такие алифатические боковые цепи, как глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; такие алифатические гидроксильные боковые цепи, как серии и треонин; такие амидсодержащие боковые цепи, как аспарагин и глутамин; такие ароматические боковые цепи, как фенилаланин, тирозин и триптофан; такие основные боковые цепи, как лизин, аргинин и гистидин; такие кислотные боковые цепи, как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и такие серосодержащие боковые цепи, как цистеин и метионин. Группы консервативных аминокислотных замен включают, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. Согласно некоторым вариантам осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке на аланин, что используется, например, в сканирующем аланином мутагенезе. Согласно некоторым вариантам осуществления проводят консервативную замену, которая характеризуется положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45), включенной в настоящий документ посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления замена представляет собой умеренно консервативную замену, причем замена характеризуется неотрицательным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.

Таким образом, в настоящем изобретении также предусматривается генетически модифицированное не являющееся человеком животное, геном которого содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид МНС II, причем полипептид содержит консервативные аминокислотные замены в описанной в настоящем документе аминокислотной последовательности.

Специалисту в настоящей области техники понятно, что в дополнение к остаткам нуклеиновой кислоты, кодирующим описанный в настоящем документе человеческий или гуманизированный полипептид МНС II, вследствие вырожденности генетического кода, другие нуклеиновые кислоты могут кодировать полипептид по настоящему изобретению. Следовательно, в дополнение к генетически модифицированному не являющемуся человеком животному, которое содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид МНС II с консервативными аминокислотными заменами, также предусматривается не являющееся человеком животное, геном которого содержит нуклеотидную последовательность, которая отличается от описанной в настоящем документе нуклеотидной последовательности вследствие вырожденности генетического кода.

Термин "идентичность" при использовании в связи с последовательностью включает идентичность, определяемую с помощью набора различных известных в настоящей области техники алгоритмов, которые могут использоваться для измерения идентичности нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности. Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления, идентичности определяют с использованием ClustalW v. 1.83 (медленного) выравнивания с использованием штрафа за открытие делеции, составляющего 10,0, штрафа за продление делеции, составляющего 0,1, и с использованием матрицы сравнения согласно Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Длина последовательностей, сравниваемых в отношении идентичности последовательностей, будет зависеть от конкретных последовательностей. Согласно различным вариантам осуществления идентичность определяют путем сравнения последовательности зрелого белка в направлении от его N-конца к его С-концу. Согласно различным вариантам осуществления при сравнении химерной человеческой/не относящейся к человеку последовательности с последовательностью человека, человеческая часть химерной человеческой/не относящейся к человеку последовательности (но не часть, не относящаяся к человеку) используется в осуществления сравнения с целью выяснения уровня идентичности между последовательностью человека и человеческой частью химерной человеческий/не относящейся к человеку последовательности (например, сравнивая эктодомен человека химерного человеческого/мыши белка с эктодоменом белка человека).

Термины "гомология" или "гомологичный" в отношении последовательностей, например, нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, означает, что две последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными по меньшей мере приблизительно в 75% нуклеотидов или аминокислот, по меньшей мере приблизительно в 80% нуклеотидов или аминокислот, по меньшей мере приблизительно в 90-95% нуклеотидов или аминокислот, например, больше чем 97% нуклеотидов или аминокислот. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что для оптимального нацеленного воздействия на ген нацеливающий конструкт должен содержать плечи, гомологичные эндогенным последовательностям ДНК (т.е. "плечи гомологии"); таким образом, гомологичная рекомбинация может происходить между нацеливающей конструкцией и нацеленной эндогенной последовательностью.

Термин "функционально связанный" относится к смежному положению, причем описанные таким образом компоненты находятся во взаимодействии, позволяющем им функционировать предусмотренным для них образом. В связи с этим, кодирующая белок последовательность нуклеиновой кислоты может быть функционально связана с регуляторными последовательностями (например, последовательностью промотора, энхансера, сайленсера и т.д.) так, чтобы сохранять надлежащую транскрипционную регуляцию. Кроме того, различные части химерного или гуманизированного белка по настоящему изобретению могут быть функционально связаны для сохранения надлежащей укладки, процессинга, нацеленного воздействия, экспрессии и других функциональных свойств белка в клетке. Если не указано иное, различные домены химерного или гуманизированного белка по настоящему изобретению функционально связаны друг с другом.

Используемые в настоящем документе термины " комплекс МНС II", "белок МНС II" или подобное включают комплекс между полипептидом α МНС II и полипептидом β МНС II. Используемый в настоящем документе термин "полипептид α МНС II" или "полипептид β МНС II" (или подобное) включает полипептид α МНС I отдельно или полипептид β МНС II отдельно соответственно. Аналогично, термины "комплекс HLA-DR4", "белок HLA-DR4", "комплекс Н-2Е", "белок Н-2Е" или подобное относятся к комплексу между полипептидами α и β. Как правило, термины "МНС человека" и "HLA" используются взаимозаменяемо.

Термин "замещение" в отношении замещения гена относится к размещению экзогенного генетического материала на эндогенном генетическом локусе, тем самым замещая весь эндогенный ген или его часть ортологичной или гомологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Как показано в примерах ниже, последовательность нуклеиновой кислоты эндогенного локуса МНС II замещали нуклеотидной последовательностью, содержащей последовательности, кодирующие части полипептидов α и β МНС II человека; в частности, кодирующие внеклеточные части полипептидов α и β МНС II.

Используемый в настоящем документе термин "функциональный", например, по отношению к функциональному полипептиду, относится к полипептиду, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность, в норме связанную с нативным белком. Например, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения замещение на эндогенном локус (например, замещение на эндогенном не относящемся к человеку локусе МНС II) дает в результате локус, который не способен экспрессировать функциональный эндогенный полипептид.

Генетически модифицированные в отношении МНС II животные

Согласно различным аспектам настоящее изобретение в основном относится к генетически модифицированным не являющимся человеком животным, которые содержат в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный комплекс МНС II; таким образом, животные экспрессируют человеческий или гуманизированный комплекс МНС II (например, полипептиды α и β МНС II).

Гены МНС относятся к трем классам: I классу, II классу и III классу, причем все указанные классы кодируются либо на хромосоме 6 человека, либо на хромосоме 17 мыши. Схематическая иллюстрация относительной организации классов МНС человека и мыши представлена на фиг. 2 и 3 соответственно. Большинство генов МНС являются полиморфными, фактически, они представляют собой наиболее полиморфные гены геномов мыши и человека. Предполагают, что полиморфизмы МНС являются важными в обеспечении эволюционного преимущества; изменения в последовательности могут привести к различиям в связывании пептида, что обеспечивает возможность лучшей презентации антигена. Одно исключение составляет цепь HLA-DRα человека и ее мышиный гомолог, Еα (т.е. Н-2Еа), которые являются мономорфными.

Комплекс МНС II класса содержит два нековалентно связанных домена: цепь α и цепь β, также в настоящем документе имеющие название полипептид α и полипептид β (фиг. 1). Белок охватывает плазматическую мембрану; таким образом, он содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Внеклеточная часть цепи α включает в себя домены α1 и α2, и внеклеточная часть цепи β включает в себя домены β1 и β2. Домены α1 и β1 образуют пептидсвязывающую бороздку на клеточной поверхности. Вследствие трехмерной конформации пептидсвязывающей бороздки комплекса МНС II теоретически не существует верхнего предела в отношении длины связанного ант