Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, содержащие 5'utr гена top

Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, содержащие 5'utr гена top

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к молекулам искусственной нуклеиновой кислоты, содержащим элемент 5'UTP, полученный из 5'UTP гена ТОР, открытую рамку считывания и необязательно элемент 3'UTP, поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования. Изобретение также относится к вектору, содержащему элемент 5'UTP, полученный из 5'UTP гена ТОР, к фармацевтической композиции, содержащей молекулу искусственной нуклеиновой кислоты или вектор, и к набору, содержащему молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, вектор и/или фармацевтическую композицию, предпочтительно для применения в области генной терапии и/или генетической вакцинации.

Генная терапия или генетическая вакцинация относятся к наиболее перспективным и быстро развивающимся способам современной медицины. Они могут обеспечивать высокоспецифичные и индивидуальные возможности для лечения широкого ряда различных заболеваний. В частности, наследственные генетические заболевания, а также аутоиммунные заболевания, рак или связанные с опухолями заболевания, а также воспалительные заболевания могут быть объектами для таких лечебных подходов. Также предусматривается предупреждать (на ранних стадиях) начало развития таких заболеваний с использованием таких подходов.

Основной концептуальной рациональной функцией генной терапии является соответствующая модуляция нарушенной экспрессии гена, ассоциированной с патологическими состояниями при определенных болезнях. Патологически измененная экспрессия гена может привести к сверхпродукции основных продуктов гена, например, сигнальных факторов, таких как гормоны, факторы «домашнего хозяйства», ферментов метаболизма, структурных белков и тому подобное. Измененная экспрессия гена может возникнуть не только в результате нарушенной регуляции транскрипции и/или трансляции, но также за счет мутаций внутри ORF, кодирующей определенный белок. Патологические мутации могут быть вызваны, например, аберрацией хромосом или более специфическими мутациями, такими как точечная мутация или мутация со сдвигом рамки считывания, которые все приводят к ограниченной функциональной активности и потенциально к полной потере функции генного продукта. Однако нарушенная регуляция транскрипции и трансляции также может иметь место, если мутации затрагивают гены, кодирующие белки, которые принимают участие в функционировании аппарата транскрипции и трансляции клетки. Такие мутации могут привести к патологической позитивной или негативной регуляции генов, которые являются сами по себе функциональными. Гены, кодирующие генные продукты, которые осуществляют такие регулирующие функции, могут представлять, например, факторы транскрипции, сигнальные рецепторы, белки-медиаторы или тому подобное. Однако потеря функции таких генов, кодирующих регуляторные белки, может в некоторых обстоятельствах реверсироваться искусственным введением других факторов, функционирующих справа от нарушенного генного продукта. Такие генные дефекты также могут компенсироваться генной терапией посредством замены самого пораженного гена.

Генетическая вакцинация позволяет индуцировать требуемый иммунный ответ на выбранные антигены, такие как специфические компоненты поверхности бактерий, вирусные частицы, опухолевые антигены или тому подобное. В общем, вакцинация представляет собой одно из основных достижений современной медицины. Однако в настоящее время эффективные вакцины имеются только для небольшого числа болезней. Следовательно, инфекции, которые не профилактируются вакцинацией, продолжают ежегодно поражать миллионы людей.

Обычно вакцины подразделяются на вакцины «первого», «второго» и «третьего» поколения. Как правило, вакцины «первого поколения» представляют собой вакцины на основе цельных микроорганизмов. Они основаны на живых и аттенуированных или убитых патогенах, например, вирусов, бактерий или тому подобное. Основным недостатком живых и аттенуированных вакцин является риск реверсии микроорганизмов в варианты, угрожающие жизни. Таким образом, хотя и будучи аттенуированными, такие патогены могут по существу нести собой непредсказуемый риск. Убитые патогены не могут быть такими эффективными, как это требуется для генерации специфического иммунного ответа. Для сведения к минимуму таких рисков были разработаны вакцины «второго поколения». Как правило, они представляют собой субъединичные вакцины, состоящие из компонентов определенных антигенов или рекомбинантных белков, которые получены из патогенов.

Под генетическими вакцинами, т.е. вакцинами, используемыми для генетической вакцинации, понимаются вакцины «третьего поколения». Как правило, они состоят из генно-инженерных молекул нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают экспрессию пептидных или белковых (антигенных) фрагментов, характерных для патогена или опухолевого антигена in vivo. Генетические вакцины экспрессируются при введении пациенту и захватываются компетентными клетками. Экспрессия нуклеиновых кислот приводит к продукции кодированных белков. В результате данные белки распознаются иммунной системой пациента в качестве чужеродных, и запускается иммунный ответ.

Как это следует из вышеизложенного, оба способа, генная терапия и генетическая вакцинация, в основном основаны на введении нуклеиновокислотных молекул пациенту и последующей транскрипции и/или трансляции кодированной генетической информации. Альтернативно генетическая вакцинация или генная терапия также могут включать способы, которые включают выделение специфических клеток организма пациента, который подвергается лечению, затем трансфекцию таких клеток in vitro, и повторное введение обработанных клеток пациенту.

ДНК, а также РНК, могут использоваться в качестве нуклеиновокислотных молекул для введения в контексте генной терапии или генетической вакцинации. Известно, что ДНК является относительно стабильной и простой в обращении молекулой. Однако применение ДНК несет за собой риск нежелательной инсерции введенных ДНК-фрагментов в геном пациента, потенциально приводя к потере функции нарушенных генов. В качестве дополнительного риска существует возможность нежелательной продукции анти-ДНК-антител. Другим недостатком является ограниченный уровень экспрессии кодированного пептида или белка, который может быть достигнут при введении ДНК и ее транскрипции/трансляции. Помимо прочих причин уровень экспрессии ДНК будет зависеть от присутствия специфических факторов транскрипции, которые регулируют транскрипцию ДНК. В отсутствии таких факторов транскрипция ДНК не будет обеспечивать удовлетворительные количества РНК. В результате полученный уровень транслированного пептида или белка является весьма низким.

При использовании РНК вместо ДНК для генной терапии или генетической вакцинации риск нежелательной геномной интеграции и продукции анти-ДНК-антител является минимальным или отсутствует вовсе. Однако считается, что РНК является менее стабильной молекулой, которая может легко разрушаться в результате воздействия повсеместно распространенных РНКаз.

В условиях in vivo разрушение РНК определяет период полураспада РНК. Этот эффект учитывался и подвергался тонкой регуляции экспрессии эукариотических генов (Friedel et al., «Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life», Nucleic Acid Research, 2009, 1-12). Следовательно, каждая встречающаяся в природе мРНК имеет индивидуальный период полураспада в зависимости от гена, из которого получена мРНК. Это вносит свой вклад в регуляцию уровня экспрессии данного гена. Нестабильные РНК имеют важное значение для реализации временной экспрессии гена в различных временных точках. Однако длительно «долгоживующие» РНК могут привести к накоплению различных белков или продолжительной экспрессии генов. В условиях in vivo период полураспада мРНК также может зависеть от факторов окружающей среды, таких как обработка гормонами, что было показано, например, для мРНК инсулиноподобного ростового фактора I, актина и альбумина (Johnson et al., «Newly synthesized RNA: simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes», Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 88, pp. 5287-5191, 1991).

Для генной терапии и генетической вакцинации обычно требуется стабильная РНК. С одной стороны, это объясняется тем фактом, что продукт, кодированный РНК-последовательностью, будет накапливаться in vivo. С другой стороны, РНК должна сохранять ее структурную и функциональную целостность при ее приготовлении в подходящей лекарственной форме для хранения и введения. Таким образом, было уделено большое внимание получению стабильных молекул РНК для генной терапии и генетической вакцинации в целях предупреждения их быстрого разрушения или исчезновения.

Сообщалось, что G/C-содержание в нуклеиновокислотных молекулах может оказать влияние на их стабильность. Так, нуклеиновые кислоты, содержащие повышенное количество остатков гуанина (G) и/или цитозина (С) могут быть функционально более стабильными по сравнению с нуклеиновыми кислотами, содержащими большое количество адениновых (А) и тиминовых (Т) или урациловых (U) нуклеотидов. В данном контексте в международной заявке WO 02/098443 описывается фармацевтическая композиция, содержащая мРНК, которая стабилизирована модификациями последовательности в транслируемой области. Такая модификация последовательности возможна за счет вырожденности генетического кода. Следовательно, кодоны, которые содержат менее благоприятную комбинацию нуклеотидов (менее благоприятную в отношении стабильности РНК), могут быть замещены альтернативными кодонами без изменения кодированной аминокислотной последовательности. Данный способ стабилизации РНК ограничивается необходимостью определения конкретной нуклеотидной последовательности для каждой отдельной молекулы РНК, что не дает оставить пространство требуемой аминокислотной последовательности. Также данный подход ограничивается кодирующими областями РНК.

В качестве альтернативного варианта стабилизации мРНК было установлено, что встречающиеся в природе молекулы эукариотической мРНК содержат характерные стабилизирующие элементы. Например, они могут содержать так называемые нетранслируемые области (UTR) в их 5'-конце (5'UTR) и/или в их 3'-конце (3'UTR), а также другие характерные структуры, такие как 5'-кэпированные структуры или 3'-поли(А)-хвост. Как правило, 5'UTR и 3'UTR транскрибируются из геномной ДНК и, таким образом, являются элементом незрелой мРНК. Специфические характерные структуры зрелой мРНК, такие как 5'-кэп и 3'-поли(А)-хвост (также называемый поли(А)-хвост или поли(А)-последовательность) обычно добавляются к уже транскрибированной мРНК во время процессинга мРНК.

Как правило, 3'-поли(А)-хвост представляет собой непрерывный участок последовательности из адениновых нуклеотидов, добавленный к 3'-концу транскрибированной мРНК. Он может содержать до 400 адениновых нуклеотидов. Было установлено, что длина такого 3'-поли(А)-хвоста является потенциально ключевым элементом для стабильности каждой отдельной мРНК.

Также было показано, что присутствие 3'UTR в мРНК α-глобина может быть важным фактором для хорошо известной стабильности мРНК α-глобина (Rodgers et al., «Regulated α-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping», RNA, 8, pp. 1526-1537, 2002). 3'UTR мРНК α-глобина явно участвует в образовании специфического рибонуклеопротеин-комплекса, α-комплекса, присутствие которого коррелирует со стабильностью мРНК in vitro (Wang et al., «An mRNA stability complex functions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro», Molecular and Cellular Biology, vol. 19, No. 7, July 1999, p. 4552-4560).

Независимо от факторов, влияющих на стабильность мРНК, эффективная трансляция введенных нуклеиновокислотных молекул в клетках-мишенях или ткани-мишени является ключевой для любого подхода с использованием нуклеиновокислотных молекул для генной терапии или генетической вакцинации. Наряду с регуляцией стабильности, трансляция большинства мРНК также регулируется характерными структурами, такими как UTR, 5'-кэп и 3'-поли(А)-хвост. В данном контексте сообщалось, что длина поли(А)-хвоста также может играть важную роль в эффективности трансляции. Однако стабилизирующие 3'-элементы также могут оказывать ослабляющий эффект на трансляцию.

Дополнительные регуляторные элементы, которые могут оказывать влияние на уровни экспрессии, можно найти в 5'UTR. Например, сообщалось, что синтез конкретных белков, например, белков, относящихся к трансляционному аппарату, может регулироваться не только на уровне транскрипции, но и на уровне трансляции. Например, трансляция белков, кодированных так называемыми «ТОР-генами», может подвергаться негативной регуляции посредством репрессии трансляции. В данном документе термин «ТОР-ген» относится к гену, соответствующему мРНК, которая характеризуется наличием ТОР-последовательности в 5'-конце и в большинстве случаев регуляцией трансляции, связанной с ростом (Iadevaia et al., «All translation elongation factors and the e, f and h subunits of translation initiation factor 3 are encoded by 5'-terminal oligopyrimidine (TOP) mRNAs»; RNA, 2008, 14:1730-1736). В данном контексте ТОР-последовательность - также называемая «5'-концевым олигопиримидиновым трактом» - как правило, состоит из остатка С в месте кэпирования с последующей непрерываемой последовательностью из 13 или даже более пиримидинов (Avni et al., «Vertebrate mRNA with 5'-terminal pyrimidine tract are candidates for translational repression in quiescent cells: characterization of the translational cis-regulatory element», Molecular and Cellular Biology, 1994, p. 3822-3833). Сообщалось, что такие ТОР-последовательности присутствуют во многих мРНК, кодирующих компоненты трансляционного аппарата, и они ответственны за избирательную репрессию трансляции данных мРНК, содержащих ТОР, при остановке роста (Meyuhas et al., «Translational control of ribosomal protein mRNAs in eukaryotes, Translational Control». Cold Spring Harbor Monograph Archive. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996, p. 363-388). Полагают, что данные последовательности ТОР служат в качестве цис-регуляторного элемента, который ингибирует связывание трансляционных регуляторных белков или самого трансляционного аппарата. В результате трансляция данных генов ингибируется при остановке роста клеток. Конкретнее, когда клетка испытывает голод или подвергается обработке некоторыми химическими веществами, такими как 12-О-тетрадеканоил-1-форбол-13-ацетат (ТРА), то мРНК генов ТОР, которые обычно ассоциируются с полисомами, изменяют их статус и переводят в состояние трансляционно неактивной «субполисомы», в то время как большинство мРНК не-ТОР-генов остаются в состоянии «полисомы» (Yamashita et al., «Comprehensive detection of human terminal oligopyrimidine (TOP) genes and analysis of their characteristics». Nucleic Acids Res., 2008 Jun; 36(11):3707-15. doi: 10.1093/nar/gkn248. Epub 2008, May 14). В данном контексте было показано, что олигопиримидиновый тракт в 5'-конце 5'UTR (мотива ТОР) требуется для регрессии трансляции генов ТОР. Олигопиримидиновый тракт в 5'-конце молекул мРНК рибосомального белка млекопитающих требуется для их трансляционного контроля (Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991 Apr. 15; 88(8): 3319-23). Кроме того, было показано, что миРНК miR-10a повышает трансляцию рибосомальных белков посредством связывания слева от ТОР-мотива, находящегося в 5'UTR генов ТОР. Такое усиление трансляции зависело от присутствия ТОР-мотива в 5'UTR. Кроме того, такая трансляционная регуляция рибосомальных генов ТОР зависела от присутствия miR-10a или его человеческого гомолога miR-10b, который сверхэкспрессируется в нескольких типах опухолей и, как сообщают, он вовлечен в развитие рака (Jrom et al., «MicroRNA-10a binds the 5'UTP pf ribosomal protein mRNAs and enhances their translation». Mol. Cell. 2008 May 23; 30(4):460-71).

Целью изобретения является обеспечение молекул нуклеиновой кислоты, которые могут быть пригодны для применения в генной терапии и/или генетической вакцинации. В частности, целью изобретения является обеспечение молекул искусственной нуклеиновой кислоты, таких как молекулы мРНК, которые обеспечивают повышенную продукцию белка из указанных молекул искусственной нуклеиновой кислоты, предпочтительно которые проявляют повышенную эффективность трансляции. Еще одной целью изобретения является обеспечение нуклеиновокислотных молекул, кодирующих такие усовершенствованные молекулы мРНК, которые могут быть пригодными для применения в генной терапии и/или генетической вакцинации. Также целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для применения в генной терапии и/или генетической вакцинации. В заключении целью настоящего изобретения является обеспечение усовершенствованных молекул нуклеиновой кислоты, которым не свойственны обсуждаемые выше недостатки предшествующего уровня техники посредством экономически эффективного и простого подхода.

Цель, лежащая в основе настоящего изобретения, достигается заявленным предметом.

В целях ясности и четкости приводятся последующие определения. Любой технический признак данных определений может применяться для каждого и любого варианта осуществления изобретения. Дополнительные определения и пояснения могут конкретно приводиться в контексте данных вариантов осуществления.

Адаптивный иммунный ответ: как правило, адаптивный иммунный ответ понимается, как антиген-специфический ответ иммунной системы. Специфичность антигена позволяет генерировать ответы, которые направлены на специфические патогены или инфицированные патогеном клетки. Способность усиления данных генерированных иммунных ответов обычно поддерживается в организме «клетками памяти». Если патоген попадает в организм субъекта более чем один раз, то эти специфические клетки памяти используются для быстрой его элиминации. В данном контексте первой стадией адаптивного иммунного ответа является активация нативных антиген-специфических Т-клеток или различных иммунных клеток, способных индуцировать антиген-специфический иммунный ответ антигенпрезентирующими клетками. Это имеет место в лимфоидных тканях и органах, через которые нативные Т-клетки постоянно циркулируют. Тремя типами клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, являются дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из этих клеток имеет отдельную функцию в индукции иммунных ответов. Дендритные клетки могут захватывать антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и могут стимулироваться при контакте, например, с чужеродным антигеном, с миграцией в локальную лимфоидную ткань, где они подвергаются дифференцировке в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают антигены в виде частиц, такие как бактерии, и индуцируются инфекционными агентами или другими соответствующими стимулами с экспрессией молекул МНС. Уникальная способность В-клеток связываться и интернализировать растворимые белковые антигены посредством их рецепторов также может быть важной для индукции Т-клеток. Как правило, молекулы МНС ответственны за презентацию антигена Т-клеткам. В данном случае презентация антигена на молекулах МНС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в нацеленные эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является индукция гибели инфицированных цитотоксических CD+8 Т-клеток и активация макрофагов Th1-клетками, которые вместе составляют клеточный иммунитет, и активация В-клеток Th2- и Th1-клетками с продукцией различных классов антител, регулируя, таким образом, гуморальный иммунный ответ. Т-клетки распознают антиген рецепторами Т-клеток, которые не распознают и не связываются непосредственно с антигеном, а вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, антигены на основе белка патогена, так называемые эпитопы, которые связываются с молекулами МНС на поверхности других клеток.

Адаптивная иммунная система: адаптивная иммунная система в основном специализирована на элиминацию или предупреждение роста патогенов. Она, как правило, регулирует адаптивный иммунный ответ обеспечением способности иммунной системы позвоночных животных распознавать и запоминать специфические патогены (для генерации иммунитета), и, делая атаки более сильными каждый раз, когда происходит встреча с патогеном. Система является высоко адаптируемой за счет соматической гипермутации (процесс ускоренных соматических мутаций) и V(D)J рекомбинации (необратимая генетическая рекомбинация сегментов гена антигенного рецептора). Данный механизм позволяет небольшому числу генов продуцировать огромное количество различных антигенных рецепторов, которые затем уникально экспрессируются на каждом отдельном лимфоците. Поскольку реаранжировка генов приводит к необратимому изменению ДНК в каждой клетке, то все потомки (потомство) этой клетки затем будут наследовать гены, кодирующие специфичность тех же рецепторов, включая В-клетки памяти и Т-клетки памяти, которые являются ключевыми для сохранения продолжительного специфического иммунитета.

Адъювант/адъювантный компонент: адъювант или адъювантный компонент в самом широком смысле обычно представляет фармакологический и/или иммунологический агент, который может модифицировать, например, повышать действие других агентов, таких как лекарственный препарат или вакцина. Он рассматривается в широком смысле и относится к большому спектру веществ. Как правило, эти вещества способны повышать иммуногенность антигенов. Например, адъюванты могут распознаваться врожденной иммунной системой и, например, могут индуцировать врожденный иммунный ответ. Как правило, «адъюванты» не индуцируют адаптивный иммунный ответ. В этом смысле «адъюванты» не рассматриваются в качестве антигенов. Механизм их действия отличается от эффектов, запускаемых антигенами, приводящих к развитию адаптивного иммунного ответа.

Антиген: в том смысле, в котором здесь используется термин «антиген», он обычно относится к веществу, которое может распознаваться иммунной системой, предпочтительно адаптивной иммунной системой, и которое способно запускать антиген-специфический иммунный ответ, например, в виде продукции антител и/или появлении антиген-специфических Т-клеток в качестве части адаптивного иммунного ответа. Как правило, антиген может представлять собой или может содержать пептид или белок, которые могут презентироваться молекулами МНС Т-клеткам.

Молекула искусственной нуклеиновой кислоты: в том смысле, в котором здесь используется термин «молекула искусственной нуклеиновой кислоты», он представляет молекулу нуклеиновой кислоты, например, ДНК или РНК, которая не встречается в природе. Другими словами, под термином «молекула искусственной нуклеиновой кислоты» понимается неприродная молекула нуклеиновой кислоты. Такая нуклеиновокислотная молекула является неприродной за счет наличия определенной последовательности (которая не встречается в природе) и/или за счет других модификаций, например, структурных модификаций нуклеотидов, которые не встречаются в природе. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты может быть молекулой ДНК, молекулой РНК или гибридной молекулой, содержащей фрагменты ДНК и РНК. Как правило, молекулы искусственной нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы и/или получены методами генной инженерии для получения соответствующей требуемой искусственной последовательности нуклеотидов (гетерологичной последовательности). В том смысле, в котором здесь используется термин «искусственная последовательность», он обычно представляет последовательность, которая не встречается в природе, т.е. она отличается от послеовательности дикого типа, по меньшей мере, по одному нуклеотиду. Термин «дикий тип» может пониматься, как последовательность, встречающаяся в природе. Также термин «молекула искусственной нуклеиновой кислоты» не ограничивается значением «одна единичная молекула», но обычно он включает группу идентичных молекул. Следовательно, термин может относиться к множеству идентичных молекул, находящихся в аликвотном образце.

Бицистронная РНК, полицистронная РНК: бицистронная или полицистронная РНК, как правило, представляет РНК, предпочтительно мРНК, которая обычно имеет две (бицистронная) или более (полицистронная) открытые рамки считывания (ORF). В данном контексте открытая рамка считывания представляет последовательность кодонов, которая транслируется в пептид или белок.

Носитель/полимерный носитель: в том смысле, в котором здесь используется термин «носитель», он обычно представляет соединение, которое облегчает транспорт и/или комплексообразование другого соединения (карго). Как правило, полимерный носитель представляет носитель, который образован полимером. Носитель может быть связан с его карго ковалентной или нековалентной связью. Носитель может транспортировать нуклеиновые кислоты, например, РНК или ДНК, к клеткам-мишеням. Носитель может - в некоторых вариантах осуществления - быть катионным компонентом.

Катионный компонент: в том смысле, в котором здесь используется термин «катионный компонент», он обычно относится к заряженной молекуле, которая заряжена положительно (катион) при значении рН обычно от 1 до 9, предпочтительно при значении рН, равном или ниже 9 (например, от 5 до 9) или ниже 8 (например, от 5 до 8), равном или ниже 7 (например, от 5 до 7), наиболее предпочтительно при физиологическом значении рН, например, от 7,3 до 7,4. Следовательно, катионный компонент может представлять любое положительно заряженное соединение или полимер, предпочтительно катионный пептид или белок, который положительно заряжен в физиологических условиях in vivo. «Катионный пептид или белок» может содержать, по меньшей мере, одну положительно заряженную аминокислоту, или более чем одну положительно заряженную аминокислоту, которые, например, выбраны из Arg, His, Lys или Orn. Следовательно, «поликатионные» компоненты также находятся в объеме настоящего термина и относятся к катионным компонентам, имеющим более чем один положительный заряд в конкретных условиях.

5'-кэп: 5'-кэп представляет структуру, как правило, структуру модифицированного нуклеотида, которая обычно «кэпирует» 5'-конец зрелой мРНК. Как правило, 5'-кэп может быть образован модифицированным нуклеотидом, в частности, производным гуанинового нуклеотида. Предпочтительно 5'-кэп связан с 5'-концом посредством 5'-5'-трифосфатной связи. 5'-кэп может быть метилирован, например, m7GpppN, где N является концевым 5'-нуклеотидом нуклеиновой кислоты, несущей 5'-кэп, обычно 5'-конец РНК. Дополнительные примеры 5'-кэпированных структур включают глицерил, обращенный дезоксиостаток без основания (фрагмент), 4',5'-метиленнуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситол-нуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, треопентофуранозилнуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутилнуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентилнуклеотид, 3',3'-обращенный нуклеотидный фрагмент, 3',3'-обращенный фрагмент без основания, 3',2'-обращенный нуклеотидный фрагмент, 3',2'-обращенный фрагмент без основания, 1,4-бутандиолфосфат, 3'-фосфорамидат, гексилфосфат, аминогексилфосфат, 3'-фосфат, 3'-фосфоротиоат, фосфородитиоат или мостиковый или немостиковый метилфосфонатный фрагмент.

Клеточный иммунитет/клеточный иммунный ответ: клеточный иммунитет обычно относится к активации макрофагов, природных клеток-киллеров (NK), антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождению различных цитокинов в ответ на антиген. В более широком понимании клеточный иммунитет основан не на антителах, а на активации клеток иммунной системы. Как правило, клеточный иммунный ответ может характеризоваться, например, активацией антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, которые способны индуцировать апоптоз клеток, например, специфических иммунных клеток, таких как дендритные клетки или другие клетки, экспонируя эпитопы чужеродных антигенов на их поверхности. Такие клетки могут быть инфицированы вирусом или инфицированы внутриклеточной бактерией, или они являются раковыми клетками, располагающими опухолевые антигены. Дополнительными событиями может быть активация макрофагов и природных клеток-киллеров, что индуцирует разрушение патогенов и стимуляцию клеток на секрецию цитокинов, которые оказывают влияние на функцию других клеток, принимающих участие в адаптивных иммунных ответах и ответах врожденного иммунитета.

ДНК: ДНК является общепринятой аббревиатурой дезоксирибонуклеиновой кислоты. Это молекула нуклеиновой кислоты, т.е. полимер, состоящий из нуклеотидов. Данными нуклеотидами обычно являются мономеры дезоксиаденозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат и дезоксицитидинмонофосфат, которые - сами по себе - состоят из сахара (дезоксирибозы), основания и фосфата, и они полимеризуются в виде характерного структурного скелета. Структура скелета, как правило, образована фосфодиэфирными связями между сахаром нуклеотида, т.е. дезоксирибозой, первого мономера и фосфатом второго смежного мономера. Специфический порядок мономеров, т.е. порядок оснований, связанных с сахаром/фосфатом-скелетом, называется ДНК-последовательностью. ДНК может быть одноцепочечной или двухцепочечной. В двухцепочечной форме нуклеотиды первой цепи обычно гибридизуются с нуклеотидами второй цепи, например, спариванием оснований А/Т и спариванием оснований G/C.

Эпитоп: эпитопы (также называемые «антигенной детерминантой») могут быть разделены на эпитопы Т-клеток и эпитопы В-клеток. Эпитопы Т-клеток или фрагменты белков в контексте настоящего изобретения могут содержать фрагменты, предпочтительно имеющие длину примерно от 6 до примерно 20, или даже более аминокислот, например, фрагменты, процессированные и презентированные молекулами МНС класса I, предпочтительно имеющие длину примерно от 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10 (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессированные и презентированные молекулами МНС класса II, предпочтительно имеющие длину примерно от 13 или более аминокислот, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот, где фрагменты могут быть выбраны из любой части аминокислотной последовательности. Как правило, данные фрагменты распознаются Т-клетками, будучи в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы МНС, т.е. обычно фрагменты, которые не распознаются в их нативной форме. Эпитопы В-клеток обычно представляют фрагменты, расположенные на наружной поверхности (нативных) белковых или пептидных антигенов, как здесь определено, предпочтительно содержащие от 5 до 15 аминокислот, более предпочтительно содержащие от 5 до 12 аминокислот, еще более предпочтительно содержащие от 6 до 9 аминокислот, которые могут распознаваться антителами, т.е. в их нативной форме.

Такие эпитопы белков и пептидов могут быть дополнительно выбраны из упомянутых здесь вариантов таких белков и пептидов. В данном контексте антигенные детерминанты могут представлять конформационные или прерывистые эпитопы, которые состоят из сегментов белков и пептидов, как здесь определено, которые являются прерывистыми в аминокислотной последовательности белков и пептидов, как здесь определено, но которые связаны вместе в трехмерной структуре, или непрерывные или линейные эпитопы, которые состоят из одной полипептидной цепи.

Фрагмент последовательности: фрагмент последовательности как правило, может быть более коротким фрагментом чем полноразмерная последовательность, например, нуклеиновокислотная молекула или аминокислотная последовательность. Следовательно, фрагмент обычно состоит из последовательности, которая идентична соответствующему участку в полноразмерной последовательности. Предпочтительный фрагмент последовательности в контексте настоящего изобретения состоит из непрерывного участка мономеров, таких как нуклеотиды или аминокислоты, соответствующего непрерывному участку мономеров в молекуле, из которой получен фрагмент, который составляет, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 70% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% от общей (т.е. полноразмерной) молекулы, из которой получен фрагмент.

G/C модифицированная: G/C модифицированная нуклеиновая кислота обычно представляет нуклеиновую кислоту, предпочтительно молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, как здесь определено, основанную на модифицированной последовательности дикого типа, предпочтительно содержащую повышенное количество гуанозиновых и/или цитозиновых нуклеотидов по сравнению с последовательностью дикого типа. Такое повышенное количество может быть получено заменой кодонов, содержащих аденозиновые или тимидиновые нуклеотиды, кодонами, содержащими гуанозиновые и цитозиновые нуклеотиды. Если повышенное содержание G/C имеет место в кодирующей области ДНК или РНК, то при этом используется вырожденность генетического кода. Следовательно, замены кодонов предпочтительно не изменяют кодированные аминокислотные остатки, но избирательно повышают содержание G/C в нуклеиновокислотной молекуле.

Генная терапия: генная терапия обычно означает лечение пациента или отдельных частей организма пациента, например, выделенных тканей/клеток, нуклеиновыми кислотами, кодирующими пептид или белок. Как правило, генная терапия включает, по меньшей мере, одну из следующих стадий: а) введение нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, как здесь определено, непосредственно пациенту - любым путем введения - или введение нуклеиновой кислоты in vitro в выделенные клетки/ткани пациента, что приводит к трансфекции клеток пациента in vivo/ex vivo или in vitro; b) транскрипцию и/или трансляцию введенной нуклеиновокислотной молекулы и необязательно с) повторное введение выделенных, трансфектированных клеток пациенту, если нуклеиновая кислота не вводится непосредственно пациенту.

Генетическая вакцинация: в том смысле, в котором здесь используется термин «генетическая вакцинация», обычно он означает вакцинацию введением нуклеиновокислотной молекулы, кодирующей антиген или иммуноген, или его фрагментов. Молекула нуклеиновой кислоты может вводиться в организм субъекта в выделенные клетки субъекта. При трансфекции некоторых клеток организма или при трансфекции выделенных клеток антиген или иммуноген могут экспрессироваться такими клетками и затем презентироваться иммунной системе, индуцируя адаптивный, т.е. антиген-специфический иммунный ответ. Следовательно, обычно генетическая вакцинация включает, по меньшей мере, одну из следующих стадий: а) введение нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, как здесь определено, субъекту, предпочтительно пациенту, или введение нуклеиновой кислоты в выделенные клетки субъекта, предпочтительно от пациента, что приводит к трансфекции клеток пациента in vivo или in vitro; b) транскрипцию и/или трансляцию введенной молекулы нуклеиновой кислоты и необязательно с) повторное введение выделенных, трансфектированных клеток субъекту, предпочтительно пациенту, если нуклеиновая кислота не вводится непосредственно пациенту.

Гетерологичная последовательность: две последовательности обычно называются «гетерологичными», если их получают не из одного гена. То есть, несмотря на то, что гетерологичные последовательности могут быть получены из одного организма, в естественных условиях (в природе) они не встречаются в одной молекуле нуклеиновой кислоты, такой как одна и та же мРНК.

Гуморальный иммунитет/гуморальный иммунный ответ: гуморальный иммунитет обычно относится к продукции антител и необязательно к вспомогательным процессам, сопровождающим продукцию антител. Как правило, гуморальный иммунный ответ характеризуется, например, активацией Th1-клеток и продукцией цитокинов, образованием герминального центра и переключением изотопов, созреванием аффинности и генерацией клеток памяти. Так же, как правило, гуморальный иммунитет относится к эффекторным функциям антител, которые включают нейтрализацию патогена и токсина, активацию классического пути комплемента и стимуляцию фагоцитоза опсонином, и элиминацию патогена.

Иммуноген: в том смысле, в котором здесь используется термин «иммуноген», он понимается, как соединение, которое способно стимулировать иммун