Иммунизация вектором на основе вируса бешенства, экспрессирующим чужеродный белковый антиген

Иммунизация вектором на основе вируса бешенства, экспрессирующим чужеродный белковый антиген

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Информация о правительственной дотации

Изобретение, описанное в настоящем описании, было осуществлено при правительственной поддержке по гранту № R21AI068837-01A2, выданному National Institutes of Health. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Испрашивается приоритет по дате подачи временной патентной заявки США №61/708197, поданной 1 октября 2012 года. Полное содержание упомянутой выше заявки включено в качестве ссылки.

Список последовательностей

Настоящая заявка включает список последовательностей, который предоставлен в формате ASCII через EFS-Web, и он включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 17 июня 2013 года, названа 37075_0280_00_WO_SeqListing_ST25, и имеет размер 3396 байт.

Область изобретения

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии, в частности, к применению рекомбинантных вакцин на основе вируса бешенства, экспрессирующих чужеродные антигены, для иммунизации против этих чужеродных антигенов.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Вирус бешенства (RV) представляет собой вирус с несегментированной отрицательной цепью РНК семейства Rhabdoviridae и рода лиссавирусов. Геном RV имеет размер приблизительно 12 т.п.н. и кодирует пять моноцистронных РНК, кодирующих нуклеокапсидный белок (N), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), трансмембранный гликопротеин (G) и вирусную полимеразу (L). Белок N RV заключает в капсид вирусную РНК с формированием рибонуклеопротеина (RNP), который является матрицей для транскрипции и репликации РНК вирусным полимеразным комплексом, состоящим из белков P и L. M RV связывает RNP с цитоплазамтическим доменом (CD) G RV в образовавшейся в клетке-хозяине вирусной мембране. G RV опосредует инфицирование клетки-хозяина. Главным признаком вируса бешенства является нейроинвазивность, которая относится к уникальной способности проникать в центральную нервную систему (ЦНС) из периферических областей.

Вирус бешенства представляет собой перспективный вакцинный вектор, способный эффективно индуцировать гуморальные и клеточные иммунные ответы на чужеродные антигены. Рекомбинантные живые вирусные векторы, экспрессирующие чужеродные антигены, эффективно индуцируют мощные клеточные и гуморальные иммунные ответы против экспрессируемых антигенов. Вследствие низкой распространенности серотипов в человеческой популяции, RV является превосходным кандидатом для вирусного вектора. Способы конструирования вирусов являются устоявшимися, в настоящее время включают вплоть до двух чужеродных генов общим размером 6,5 т.п.н., и чужеродные последовательности стабильно поддерживаются. RV растет до высоких титров в клеточных линиях, одобренных для производства вакцин человека, и его получение является экономичным. См., Smith et al., 2006, Virology, 353(2): 344-356. Например, компетентный по репликации RV, содержащий гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие gp160 ВИЧ-1, описан в WO 01/55330. Иммунизация RV, кодирующим бактериальные, вирусные антигены или антигены злокачественной опухоли, слитые по меньшей мере с частью белка N или белка G RV, описаны в публикации патента США 2008/0311147. Экспрессия Env или Gag ВИЧ-1 приводит к мощным иммунным ответам, направленным против ВИЧ-1 (Schnell et al,. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(7): 3544-3549).

Доступность технологии обратной генетики позволила модифицировать вирусные элементы RV, которые обеспечивают патогенность и иммуногенность, и сделала осуществимой систематическую разработку более безопасного и более эффективного модифицированного живого вектора на основе бешенства. Например, патогенность фиксированных штаммов RV (т.е. ERA, SAD) для иммунокомпетентных мышей может быть полностью устранена путем внесения единичных аминокислотных замен в их белке G (Faber et al., 2005, J Virol 79: 14141-14148). RV, содержащие G SADB19 с мутацией Arg₃₃₃→Glu₃₃₃ являются непатогенными для взрослых мышей после внутричерепной/внутримозговой инокуляции; мутация Asn₁₉₄→Ser₁₉₄ в том же гене препятствует реверсии в патогенный фенотип (Faber et al., 2005, J Virol 79:14141-14148; Dietzschold et al., 2004, Vaccine 23: 518-524; US Pat. 7695724). Ген G, содержащий обе мутации, был обозначен как "GAS". С использованием гена GAS были сконструированы варианты RV с единичным и двойным GAS, SPBNGAS и SPBNGAS-GAS, соответственно (Faber et al., 2005, J Virol 79: 14141-14148; Li et al., 2008, Vaccine 26: 419-426). Внесение второго гена G значительно повышает эффективность вакцин посредством повышения его иммуногенности вследствие более высокой экспрессии G (Faber et al., 2002, J Virol 76: 3374-3381). Повышенная экспрессия G ассоциирована с мощной активацией генов, связанных с каскадом передачи сигнала NFκB, включая IFN-α/β и IFN-γ (Li et al., 2008, Vaccine 26:419-426) и увеличенной клеточной смертью (Faber et al., 2002, J Virol 76:3374-3381). Более того, присутствие двух генов G также существенно снижает вероятность реверсии к патогенности, поскольку непатогенный фенотип, определяемый GAS, доминирует над патогенным G, который может появиться во время роста вируса in vivo или in vitro (Faber et al., 2007, J Virol 81:7041-7047).

Следующим усовершенствованием безопасности рекомбинантного RV является высоко аттенуированный вариант RV с тройным G, SPBAANGAS-GAS-GAS (Faber et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci USA 206(27):11300-11305). Вариант SPBAANGAS-GAS-GAS является полностью непатогенным после внутричерепного инфицирования мышей, которые либо имеют иммунодефицит, связанный со стадией развития (например, мыши в возрасте 5 суток), либо имеют врожденные дефициты иммунной функции.

Рекомбинантный RV, которые экспрессируют чужеродные антигены, происходящие из различных болезнетворных агентов, могут служить подходящими вакцинными векторами. Однако проблема, которая часто появляется при использовании рекомбинантных вирусов в вакцинологии, состоит в том, что они сконструированы так, что иммунная система подвергается воздействию антигенов вирусного вектора и чужеродного агента одновременно, и иммунный ответ против вирусного вектора доминирует над ответом на чужеродный антиген.

Для повышения эффективности вакцин широко используют адъюванты. Безопасность и переносимость являются ключевыми нормативными вопросами, противостоящими применению адъювантов. Область разработки адъювантов рассмотрена Petrovsky et al., "New-Age Vaccine Adjuvants: Friend or Foe?" BioPharm International, August 2, 2007, http<colon>//biopharminternational<dot>findpharma<dot>com/biopharm/article/articleDetail<dot>jsp?id=444996&sk=&date=&pageID=5.

Как описано Petrovsky et al., польза включения любого адъюванта в вакцины должна быть сбалансирована относительно любой увеличенной реактогенности или риска неблагоприятных реакций. В большинстве случаев увеличенная эффективность адъюванта ассоциирована с увеличенной реактогенностью и токсичностью. Например, хотя полный адъювант Фрейнда (CFA) является "золотым стандартом" с точки зрения адъювантной эффективности, его чрезвычайная реактогенность и токсичность препятствуют его применению в вакцинах для человека.

Как описано Petrovsky et al., основной нерешенной проблемой в разработке адъювантов является то, как достигнуть мощного адъювантного эффекта, избегая реактогенности или токсичности. Большинство новых адъювантов для человека, включая MF59,4, ISCOMS,5, QS21,6, AS02,7 и AS048 обладают существенно более высокой локальной реактогенностью и системной токсичностью, чем квасцы. Даже квасцы, хотя и являются одобренными FDA, имеют существенные неблагоприятные эффекты, включая боль в области инъекции, воспаление и лимфаденопатию, и менее часто некроз в области инъекции, гранулемы или стерильный абсцесс. Хотя многие вызываемые адъювантами реакции на вакцины не являются опасными для жизни и устраняются с течением времени, они остаются одним из наиболее важных барьеров для лучшего принятия обществом стандартной профилактической вакцинации. В частности, это касается педиатрической вакцинации, где длительное недомогание ребенка вследствие увеличенной реактогенности может прямо приводить к сопротивлению вакцинации со стороны родителей и общества.

Использование эмульсий типа "масло-в-воде" ограничивается их реактогенностью и потенциалом в отношении неблагоприятных реакций. Частицы эмульсий типа "масло-в-воде" являются раздражающими и вызывают локальное воспаление, индуцируя хемотактический сигнал, который вызывает локальную инвазию макрофагов. Вследствие частых неблагоприятных реакций, основным применением у человека эмульсий типа "масло-в-воде" являются терапевтические вакцины против злокачественной опухоли и ВИЧ. Petrovsky et al., выше. Другие адъюванты, предложенные для применения у человека, характеризуются проблемами безопасности и/или рисками реактогенности в различной степени: монофосфориллипид A (значительная реактогенность); неметилированный динуклеотид CpG (в основном, реактогенность, токсичность, включая реакции области инъекции, гриппоподобные симптомы и головная боль), QS21, содержащий тритерпеноидные гликозиды (сапонины), происходящие из коры южноамериканского мыльного дерева (сильная боль в области инъекции, гранулемы и тяжелый гемолиз); ISCOM, которые представляют собой иммуностимулирующие комплексы, содержащие сапонин, стерин, и необязательно фосфолипид (проблемы токсичности и безопасности). Petrovsky et al., выше. Только недавно нанокристаллические частицы инулина Advax продемонстрировали перспективу свободы от побочных эффектов, адъювант является природным происходящим из растений полисахаридом, состоящим из цепи молекул фруктозы, оканчивающейся одной молекулой глюкозы.

Существует потребность в рекомбинантных композициях на основе RV и способах иммунизации, которые обеспечивают мощный иммунный ответ на чужеродные антигены, экспрессируемые рекомбинантными RV, без использования адъювантов.

Сущность изобретения

Способ индукции иммунного ответа у индивидуума включает стадии: (a) получения аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства, кодирующего по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, функционально связанный с последовательностями контроля, которые контролируют экспрессию указанного чужеродного антигена в подходящей реципиентной клетке; (b) введения указанного вируса бешенства в реципиентную клетку указанного индивидуума в условиях, которые позволяют экспрессию указанного одного или нескольких чужеродных белковых антигенов, тем самым индуцируя иммунный ответ на указанный чужеродный белковый антиген; и (c) усиления указанного иммунного ответа на указанный чужеродный белковый антиген путем введения указанному индивидууму указанного чужеродного белкового антигена, содержащегося в усиливающей композиции, которая свободна от адъюванта.

Чужеродный белковый антиген может содержать, например, прионный белковый антиген, ассоциированный со злокачественной опухолью антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген или антиген простейших.

Вирус бешенства аттенуируют, т.е. преобразуют в непатогенный, например, путем внесения одной или нескольких мутаций в ген гликопротеина (G) бешенства, которые обеспечивают аттенуацию. Например, аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства может содержать мутантный ген G, который кодирует гликопротеин вируса бешенства, где аминокислота 333 представляет собой глутаминовую кислоту. Мутантный ген G, кроме того, может кодировать гликопротеин вируса бешенства, где аминокислота 194 отлична от лизина, например, аминокислота 194 представляет собой серин. В некоторых вариантах осуществления аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства содержит два или более генов G. По меньшей мере один и предпочтительно все из генов G содержат ослабляющую патогенность мутацию.

В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, расположена между двумя генами G в геноме указанного аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства. В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, расположена между генами M и L в геноме аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства.

В некоторых вариантах осуществления иммунизация аттенуированным рекомбинантным вирусом бешенства, кодирующим по меньшей мере один чужеродный белок, происходит без адъюванта.

Изобретение также относится к набору для осуществления на практике упомянутого выше режима иммунизации. Набор может содержать: (a) первую композицию, содержащую аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства, кодирующий по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, функционально связанный с последовательностями контроля, которые контролируют экспрессию указанного чужеродного антигена в подходящей реципиентной клетке; и (b) вторую композицию, содержащую по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, где указанная вторая композиция является свободной от адъюванта. В некоторых вариантах осуществления первая композиция набора также свободна от адъюванта.

Описание чертежей

На фиг. 1 представлена серия графиков, демонстрирующих титры антител против овальбумина для общего иммуноглобулина (общий IgG), IgG1 и IgG2A у мышей, иммунизированных SPBAANGAS-OVA-GAS или SPBAAGAS-GAS (столбец A), с последующей усиливающей иммунизацией SPBAANGAS-OVA-GAS (столбец B) и третьей иммунизацией растворимым OVA (столбец C). В каждой рамке левый столбик соответствует мышам, первоначально иммунизированным SPBAAGAS-GAS, в то время как правый столбик соответствует мышам, первоначально иммунизированным SPBAAGAS-OVA-GAS.

На фиг. 2 представлены графики продуцирования нейтрализующих антител против вируса Нипах (NiV) (панель A), и антител, связывающих гликопротеин NiV (NiV-G) (панель B). Мышей иммунизировали различными концентрациями (10³-10⁶ FFU) варианта RV SPBAANGAS-NG-GAS, а затем у них проводили взятие крови через 21 сутки после первичной иммунизации и через 10 суток после усиливающей иммунизации. Нейтрализующие титры NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Результаты представлены на фиг. 2, панель A (нейтрализующие антитела против NiV) и панель B (антитела, связывающие NiV-G). В каждой паре столбиков левый столбик соответствует титру антител после первичной иммунизации; правый столбик соответствует титру антител после усиливающей иммунизации. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.

На фиг. 3 представлены графики продуцирования нейтрализующих антител против NiV (панель A), и антител, связывающих NiV-G (панель B). Мышей иммунизировали 10⁵ FFU варианта RV SPBNGAS-GAS. Затем через 29 суток в одной группе проводили усиливающую иммунизацию 10⁵ FFU SPBAANGAS-NG-GAS (столбики, обозначенные SPBNGAS-GAS/SPAANGAS-NG-GAS), в то время как другую группу иммунизировали 10⁵ FFU SPBN (столбики, обозначенные SPBNGAS-GAS/SPBNGAS-GAS). Взятие крови у мышей проводили через 21 сутки после первичной иммунизации (1 взятие крови: левые столбики в каждом из двух наборов столбиков на панелях) и через 10 суток после усиливающей иммунизации (2 взятие крови: правые столбики в каждом из двух наборов столбиков на панелях). Нейтрализующие титры NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Результаты представлены на фиг. 3A (NiV нейтрализующие антитела) и на фиг. 3B (антитела, связывающие NiV-G). Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.

На фиг. 4 представлен график продуцирования антител против NiV-G. Сначала две группы мышей иммунизировали 10⁵ FFU SPBAANGAS-NG-GAS или 10⁵ FFU варианта RV SPBNGAS-GAS. Через двадцать три дня обеим группам мышей проводили усиливающую иммунизацию рекомбинантно экспрессируемым растворимым не содержащим адъюванта NiV-G. У мышей проводили взятие крови через 19 суток после первичной иммунизации (левые столбики в каждой паре столбиков на фиг. 4) и через 10 суток после усиливающей иммунизации (правые столбики в каждой паре столбиков) и количественно определяли антитела, связывающие NiV-G. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.

Фиг. 5 включает иммунизацию и расписание взятия образцов крови A, и на серии графиков B-D представлена продукция антител против NiV-G. Мышей иммунизировали на нулевые сутки и 29 сутки 10⁵ FFU SPBAANGAS-NG-GAS. Через сто девяносто пять суток после второй иммунизации мышам проводили усиливающую иммунизацию рекомбинантно экспрессируемым растворимым NiV-G. У мышей проводили взятие крови в моменты времени взятия крови, показанные в расписании, обозначенном A. Количественно определяли нейтрализующие антитела против NiV (панель B), все специфические антитела против NiV-G (панель C), и специфичные к NG изотипы IgM, IgG 1, IgG 2A и IgG 2B (панель D). Нейтрализующие титры NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.

На фиг. 6A и 6B представлена продукция антител против NiV-G. Мышей иммунизировали NiV-G и через 3 недели им проводили усиливающую иммунизацию NiV-G. У мышей проводили взятие крови через 10 суток после первичной иммунизации и через 10 суток после усиливающей иммунизации. Проводили измерение общих антител, связывающих NiV-G, для двух взятий крови (фиг. 6A). Специфичные к NiV-G изотипы IgM, IgG 1, IgG 2A и IgG 2B, продуцированные после усиливающей иммунизации, измеряли с использованием ELISA (фиг. 6B). Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.

Определения

Определения, используемые в настоящей заявке, предназначены для иллюстративных целей и не ограничивают объем изобретения.

Форма единственного числа используется в настоящем описании для обозначения одного или более одного (например, по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более одного элемента.

Термин "приблизительно" понятен специалисту в данной области, и он варьирует в некоторой степени в зависимости от контекста, в котором его используют. Как используют в рамках изобретения, "приблизительно" охватывает варьирование ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%, и еще более предпочтительно ±0,1%.

Термин "антитело", как используют в рамках изобретения, относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна специфически связываться с определенным эпитопом на антигене. Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины, происходящие из природных источников или из рекомбинантных источников, и они могут представлять собой иммунореактивные части интактных иммуноглобулинов. Антитела, как правило, представляют собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов. Антитела, которые можно использовать при применении на практике настоящего изобретения, могут существовать в различных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab)2, а также одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426).

Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить в качестве депо в ткани, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, Calif., p. 384). Адъюванты включают, но не ограничиваются ими, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы плюроник, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциальные пригодные для человека адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Термин "не содержащий адъюванта" относится к любому препарату, который не содержит адъюванта, как описано выше.

Как используют в рамках изобретения, каждая "аминокислота" представлена с помощью ее полного названия, трехбуквенного кода, соответствующего ему, или соответствующего ему однобуквенного кода, как указано в следующей таблице:

Полное название	Трехбуквенный код	Однобуквенный код
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Глутаминовая кислота	Glu	E
Лизин	Lys	K
Аргинин	Arg	R
Гистидин	His	H
Тирозин	Tyr	Y
Цистеин	Cys	C
Аспарагин	Asn	N
Глутамин	Gln	Q
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Глицин	Gly	G
Аланин	Ala	A
Валин	Val	V
Лейцин	Leu	L
Изолейцин	Ile	I
Метионин	Met	M
Пролин	Pro	P
Фенилаланин	Phe	F
Триптофан	Trp	W

Выражение "аминокислота", как используют в рамках изобретения, включает как природные, так и синтетические аминокислоты, и как D-, так и L-аминокислоты.

Термин "животное" имеет его обычно значение и включает человека.

"Аттенуированный", как используют в рамках изобретения в контексте живого вируса, такого как вирус бешенства, означает, что способность вируса инфицировать клетку или индивидуума и/или способность вызывать заболевание снижена (например, устранена). Аттенуация может быть результатом либо генетического механизма, вовлекающего преждевременную терминацию транскрипции с генома RV, либо она может быть иммунологической в качестве процесса, при котором патогенный RV утрачивает свою вирулентность.

"Кодирующий" относится к свойству, присущему конкретным последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таким как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих определенную последовательность нуклеотидов (т.е., рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот и биологический свойства, являющихся результатом этого. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, приводит к образованию белка в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно предоставляется в списках последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, может быть указана в качестве кодирующей белок или другой продукт этого гена или кДНК.

"Экспрессия гена" или "экспрессия", как используют в рамках изобретения, относится к процессу, посредством которого информация с гена преобразуется в функциональный продукт гена, такой как РНК или белок. Таким образом, "уровень экспрессии" продукта маркерного гена в представляющем интерес образце относится к уровню РНК, в частности, к уровню мРНК, или к уровню кодируемого белка, и он не ограничивается любым из них.

Как используют в рамках изобретения, "экспрессирующий вектор" представляет собой генетический элемент, который функционирует в качестве автономного элемента репликации ДНК под его собственной последовательностью контроля, с которым может быть связан или в который может быть встроен другой сегмент ДНК, так чтобы осуществлялась репликация связанного или встроенного сегмента. Экспрессирующие векторы включают плазмиды, фаги или космиды. Как правило, экспрессирующие векторы содержат промоторные последовательности, которые способствуют эффективной транскрипции и трансляции связанного или встроенного сегмента ДНК в конкретной клетке-хозяине. Экспрессирующий вектор также обычно содержит ориджин репликации и терминатор(ы) транскрипции, а также конкретные гены, которые способны обеспечивать фенотипическую селекцию в трансфицированных клетках-хозяевах.

Под "чужеродным белковым антигеном" или антигеном, экспрессируемым рекомбинантным вирусом бешенства, подразумевают антиген белка, который не является нативным для вируса бешенства, экспрессирующего антиген. В определенных вариантах осуществления, когда чужеродный антиген представляет собой антиген вируса, вирус отличается от вируса бешенства.

Как используют в рамках изобретения, термин "ген" относится к элементу или комбинации элементов, которые способны экспрессироваться в клетке либо отдельно, либо в комбинации с другими элементами. Как правило, ген содержит (от 5' к 3'-концу): (1) промоторную область, которая включает 5' нетранслируемую лидерную последовательность, способную функционировать в любой клетке, такой как прокариотическая клетка, вирус или эукариотическая клетка (включая трансгенных животных); (2) последовательность структурного гена или полинуклеотидную последовательность, которая кодирует желаемый белок; и (3) 3'-нетранслируемую область, которая, как правило, вызывает терминацию транскрипции и полиаденилирование 3'-области последовательности РНК. Каждый из этих элементов функционально связан путем последовательного присоединения к соседнему элементу.

Как используют в рамках изобретения, "продукты генов" включают любой продукт, который продуцируется в процессе транскрипции, обратной транскрипции, полимеризации, трансляции, посттрансляционного процессинга и/или экспрессии гена. Продукты генов включают, но не ограничиваются ими, белки, полипептиды, пептиды, пептидные фрагменты или полинуклеотидные молекулы.

Как используют в рамках изобретения, "ген белка G RV" или "ген белка G" или "ген G" означает последовательности нуклеиновой кислоты, которые, когда они присутствуют в геноме RV, являются достаточными для кодирования гликопротеина RV в инфицированной клетке. Таким образом, ген белка G включает кодирующую последовательность, которая фланкируется на 3'-конце короткой последовательностью начала транскрипции и на 5'-конце короткой последовательностью остановки транскрипции/полиаденилирования. Ген G может включать межгенную область из 1-59 нетранслируемых нуклеотидов, которая расположена между 5'-последовательность остановки/полиаденилирования и 3'-последовательностью начала транскрипции следующего гена вируса. См., например, pgs. 134-136 Conzelman K-K (1998), Ann. Rev. Genet. 32: 123-62.

"Гомологичный", как используют в рамках изобретения, относится к субъединичному сходству последовательностей между двумя полимерными молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновой кислоты, такими как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или между двумя полипептидными молекулами. Когда положение субъединиц в обеих молекулах занимает одна и та же мономерная субъединица; например, если положение в каждой из двух молекулах ДНК занимает аденин, тогда они являются гомологичными по этому положению. Гомология между двумя последовательностями прямо зависит от количества совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях являются гомологичными, две последовательности являются на 50% гомологичными; если 90% положений (например, 9 из 10), совпадают или гомологичны, две последовательности являются на 90% гомологичными. В качестве примера, последовательности ДНК 3'ATTGCC5' и 5'TATGGC3' являются на 50% гомологичными.

Как используют в рамках изобретения, "гомологию" используют синонимично с "идентичностью".

Термин "иммунизация" относится к процессу индукции частичной или полной защиты от заболевания. Альтернативно термин относится к процессу индукции или усиления ответа иммунной системы на антиген.

"Иммунный ответ" на антиген или вакцинную композицию представляет собой развитие у индивидуума гуморального и/или клеточно-опосредуемого иммунного ответа на молекулы, присутствующие в представляющей интерес антигенной или вакцинной композиции. Для целей настоящего изобретения "гуморальный иммунный ответ" представляет собой опосредуемый антителами иммунный ответ, и он вовлекает образование антител с аффинностью в отношении антигена/вакцины по изобретению, в то время как "клеточно-опосредуемый иммунный ответ" представляет собой ответ, опосредуемый T-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами. "Клеточно-опосредуемый иммунный ответ" индуцируется презентацией антигенных эпитопов, связанных с молекулами класса I или класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC).

"Выделенный" означает измененный или извлеченный из природного состояния действиями человека. Например, нуклеиновая кислота или пептид, присутствующие в природе в живом организме, не являются "выделенными", однако те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сосуществующих с ними материалов в их природном состоянии, являются "выделенными". Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать в по существу очищенной форме или они могут существовать в ненативной среде, например, такой как клетка-хозяин.

"Мутация", как используют в рамках изобретения, относится к изменению последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида относительно эталонной последовательности (которая предпочтительно представляет собой встречающуюся в природе нормальную последовательность или последовательность "дикого типа"), и включает транслокации, делеции, инсерции и замены/точковые мутации. "Мутант", как используют в рамках изобретения, относится либо к нуклеиновой кислоте, либо к белку, содержащим мутацию.

"Нуклеиновая кислота" относится к полинуклеотиду и включает полирибонуклеотиды и полидезоксирибонуклеотиды.

Кодирующая последовательность является "функционально связанной" с последовательностью контроля, такой как последовательность контроля транскрипции и трансляции в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, которая затем подвергается транс-сплайсингу РНК и транслируется в белок, кодируемый кодирующей последовательностью.

Как используют в рамках изобретения, термины "пептид", "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должны содержать по меньшей мере две аминокислоты, и отсутствует ограничение максимального количества аминокислот, которое может составлять последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащие две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Как используют в рамках изобретения, термин относится как к коротким цепям, которые обычно в данной области называют, например, пептидами, олигопептидами и олигомерами, и к более длинным цепям, которые обычно называют в данной области белками, для которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки, среди прочих. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.

Как используют в рамках изобретения, "полинуклеотид" включает кДНК, РНК, гибрид ДНК/РНК, антисмысловую РНК, рибозим, геномную ДНК, синтетические формы и смешанные полимеры, как смысловые, так и антисмысловые цепи, и он может быть химически или биохимически модифицирован так, чтобы он содержал неприродные или дериватизированные, синтетические или полусинтетические нуклеотидные основания. Также в объем изобретения входят изменения гена дикого типа или синтетического гена, включающие, но не ограничивающиеся ими, делецию, инсерцию, замену одного или нескольких нуклеотидов, или слияние с другими полинуклеотидными последовательностями при условии, что такие изменения первичной последовательности гена не изменят способности экспрессируемого пептида индуцировать пассивный иммунитет.

"Фармацевтически приемлемый" означает физиологически переносимый для применения либо у человека, либо в ветеринарии.

Как используют в рамках изобретения, "фармацевтические композиции" включают составы для применения у человека и в ветеринарии.

Как используют в рамках изобретения, "промотор" относится к области последовательности ДНК, активной при инициации и регуляции экспрессии структурного гена. Эта последовательность ДНК, обычно выше кодирующей последовательности структурного гена, контролирует экспрессию кодирующей области путем обеспечения распознавания РНК-полимеразой и/или другими элементами, требуемыми для начала транскрипции в правильном участке.

Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к любому позвоночному животному, включая, но не ограничиваясь ими, человека и других приматов, грызунов (например, мыши, крысы и морские свинки), зайцеобразных (например, кролики), бычьих (например, крупный рогатый скот), овечьих (например, овца), козьих (например, козы), свиных (например, свинья), лошадиных (например, лошади), собачьих (например, собаки), кошачьих (например, кошки), домашних птиц (например, куры, индейки, утки, гуси, другие куриноподобные птицы и т.д.), а также неприрученных или диких животных, включая, но не ограничиваясь ими, таких животных как копытное животное (например, олень), медведь, рыбы, зайцеобразные, грызуны, птицы и т.д.

Как используют в рамках изобретения, "трансфицированная" клетка представляет собой клетку, в которую введена экзогенная или гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая была введена, может быть встроена в геном трансфицированной клетки или может поддерживаться эписомально. Стабильно трансфицированная клетка представляет собой клетку, в которой введенная ДНК встроилась в хромосому так, что она наследуется дочерними клетками посредством репликации хромосомы.

Термин "вакцина", как используют в рамках изобретения, определяют как материал, используемый для индукции иммунного ответа после введения материала позвоночному, как правило, млекопитающему. В предпочтительных вариантах осуществления вакцина может представлять собой иммуногенную композицию, обеспечивающую или способствующую предупреждению заболевания. В других вариантах осуществления вакцина представляет собой композицию, которая может обеспечивать или способствовать излечению заболевания. В других вариантах осуществления вакцинная композиция может обеспечивать или способствовать смягчению заболевания. Другие варианты осуществления вакцинной иммуногенной композиции можно использовать в качестве терапевтических и/или профилактических средств.

"Вектор", как используют в рамках изобретения, относится к репликону, такому как плазмида, фаг или космида, с которым может быть связан другой сегмент ДНК для осуществления репликации связанного сегмента.

Термин "вирус", как используют в рамках изобретения, определяют как частицу, состоящую из нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), заключенной в белковую оболочку, с наружной липидной оболочкой или без нее, которая способна реплицироваться в клетке-хозяине.

Как предусматривается настоящим изобретением в отношении описанных композиций и способов, в одном аспекте варианты осуществления изобретения включают компоненты и/или стадии, оп