Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент

Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая патентная заявка заявляет приоритет по временной патентной заявке США №61/709891, поданной 4 октября 2012 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.

[002] ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ МАТЕРИАЛОВ, ПОДАННЫХ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Данный документ посредством ссылки включает в полном объеме машинно-считываемый перечень нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, поданный совместно с данным документом и идентифицируемый следующим образом: один файл в формате ASCII (текстовом) размером 8259 байт, названный "714287SequenceListing.TXT," созданный 3 октября 2013 г.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Конъюгаты антитело-лекарственное средство, пригодные для лечения рака и других болезней, обычно состоят из трех отдельных элементов: клеточно-связывающего агента, линкера и цитотоксического агента. Один из обычно используемых способов получения включает стадию модификации, на которой клеточно-связывающий агент приводят в контакт с бифункциональным линкером для получения клеточно-связывающего агента, ковалентно присоединенного к линкеру, имеющему реакционноспособную группу, стадию очистки, на которой модифицированное антитело очищают от других компонентов реакции модификации, стадию конъюгации, на которой модифицированный клеточно-связывающий агент приводят в контакт с цитотоксическим агентом для образования ковалентной химической связи между линкером (с использованием реакционноспособной группы) и цитотоксическим агентом, и вторую стадию очистки, на которой конъюгат очищают от других компонентов реакции конъюгации.

[004] Недавно проведенные клинические испытания показали многообещающую роль конъюгатов антитело-лекарственное средство в лечении многих различных типов рака. Таким образом, существует потребность в получении конъюгатов с высокой степенью очистки и высокой стабильностью, которые могут быть использованы для лечения пациентов. Несмотря на достижения в получении конъюгатов антитело-лекарственное средство, современные методы ограничены несколькими факторами. Например, конъюгаты, полученные этими способами, содержат повышенное количество примесей, включая свободный цитотоксический агент (например, частицы, производные от димеров цитотоксического агента) и/или высокомолекулярные частицы (например, димеры и другие агрегаты более высокого порядка). Современные способы очистки, используемые в технике, такие как тангенциальная поточная фильтрация и адсорбционная хроматография, не позволяют эффективно удалять такие примеси без значительного снижения выхода и/или являются обременительными для крупномасштабных производственных процессов.

[005] Таким образом, сохраняется потребность в усовершенствованных способах получения конъюгатов антитело-лекарственное средство, которые бы являлись более стабильными и имели более высокую степень очистки, чем конъюгаты антитело-лекарственное средство, полученные с помощью способов, используемых в настоящее время. Данное изобретение предлагает такой способ. Это и другие преимущества изобретения, а также дополнительные признаки изобретения, будут понятны из описания изобретения, приведенного в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

(006) Изобретение предлагает способы получения очищенных конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, включающие приведение в контакт смесина смесь, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, с поливинилдифторидной (ПВДФ) мембраной для удаления по меньшей мере части примесей из смеси, тем самым обеспечивая очищенный конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. Настоящее изобретение также включает конъюгат, содержащий клеточно-связывающий агент, химически связанный с цитотоксическим агентом, полученный в соответствии со способами, описанными в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[007] Фигуры 1А-В представляют собой хроматограммы, показывающие химические вещества, присутствующие в реакционной смеси конъюгата антитело-SMCC-DM1 до (Фигура 1А) и после (Фигура 1В) ПВДФ-фильтрации.

[0081 Фигура 2 представляет собой линейный график, изображающий процентное содержание частиц димера DM1 (ось Y), присутствующих в реакционной смеси конъюгата антитело-SMCC-DM1 до и после фильтрации через множество ПВДФ-мембран (ось X).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[009] Специалисту в данной области техники будет понятно, что конъюгаты, содержащие клеточно-связывающий агент, такой как антитело, химически связанный с цитотоксическим агентом ("конъюгаты антитело-цитотоксический агент"), как правило, получают путем модификации антитела бифункциональным сшивающим реагентом при низком pH (т.е., pH 7,0 или ниже), очистки антитела, имеющего связанные с ним линкеры, конъюгации цитотоксического агента с антителом, имеющим связанные с ним линкеры, и очистки конъюгата антитело-цитотоксический агент. Недавно были разработаны способы получения конъюгатов с повышенной стабильностью путем максимизирования количества линкера, стабильно связанного с клеточно-связывающим агентом и минимизации нежелательных побочных реакций, приводящих к нестабильности конъюгата. Например, были разработаны способы, в которых процесс получения конъюгата проводят в одну стадию (см., например, процессы, описанные в публикации патентной заявки США №2012/0253021) и/или при высоком pH (например, pH 7 или выше) (см., например, процессы, описанные в публикации международной патентной заявки № WO 2012/135522) для увеличения уровня содержания целевых соединений клеточно-связывающих агентов, имеющих линкер, стабильно связанный с ними, и снижения уровня содержания нежелательных продуктов реакции (например, клеточно-связывающих агентов, имеющих линкер, нестабильно связанный с ними). Хотя такие процессы дают конъюгаты с повышенной стабильностью, было обнаружено, что такие процессы приводят к получению конъюгатов, имеющих повышенные уровни содержания примесей, таких как свободный цитотоксический агент (например, веществ, связанных с димером цитотоксического агента) и/или высокомолекулярных соединений (например, димеров и других агрегатов более высокого порядка). Современные способы очистки, используемые в данной области техники, такие как тангенциальная поточная фильтрация и адсорбционная хроматография, не позволяют эффективно удалять эти примеси без значительного снижения выхода и/или являются обременительными для крупномасштабных производственных процессов.

[0010] Неожиданно было обнаружено, что поливинилдифторидная (ПВДФ) мембрана может быть использована для удаления по меньшей мере части примесей из смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. В частности, было неожиданно обнаружено, что свободный цитотоксический агент (например, вещества, связанные с димером цитотоксического агента) могут быть действенно и эффективно удалены из смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, путем приведения в контакт смеси с ПВДФ-мембраной. Соответственно, изобретение предлагает способы производства конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент с повышенной чистотой и стабильностью, включающие приведения в контакт смесей, содержащих конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, с ПВДФ-мембраной.

[0011] Изобретение предлагает способ получения очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, включающий приведение в контакт смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, с ПВДФ-мембраной для удаления по меньшей мере части примесей из смеси, тем самым обеспечивая получение очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. ПВДФ-мембрана может быть использована для удаления различных примесей, обычно присутствующих в смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. Например, ПВДФ-мембрана может быть использована для удаления одной или нескольких примесей, выбранных из группы димеров цитотоксического агента, агрегатов конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, свободного цитотоксического агента, неконъюгированного линкера и их смесей.

[0012] В одном варианте реализации изобретения смесь, содержащая конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, содержит димеры цитотоксического агента в качестве примеси, и ПВДФ-мембрана удаляет некоторую часть димеров цитотоксического агента из смеси, обеспечивая получение очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. В другом варианте реализации изобретения смесь, содержащая конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, содержит агрегаты конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент в качестве примеси, и ПВДФ-мембрана удаляет некоторую часть агрегатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент из смеси, обеспечивая получение очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент.В другом варианте реализации изобретения смесь, содержащая конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, содержит свободный цитотоксический агент в качестве примеси, и ПВДФ-мембрана удаляет некоторую часть свободного цитотоксического агента из смеси, обеспечивая получение очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. В другом варианте реализации изобретения смесь, содержащая конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, содержит неконъюгированный линкер в качестве примеси, и ПВДФ-мембрана удаляет некоторую часть неконъюгированного линкера из смеси, обеспечивая получение очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент.

[0013] В предпочтительном варианте реализации изобретения смесь, содержащая конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, содержит димеры цитотоксического агента, химически связанные друг с другом с помощью линкера (например, DM1-MCC-DM1, DM1-SPP-DM1 или DM1-CX1-1-DM1), в качестве примеси, и ПВДФ-мембрана удаляет некоторую часть димеров цитотоксического агента, химически связанных друг с другом с помощью линкера (например, DM1-MCC-DM1, DM1-SPP-DM1 или DM1-CX1-1-DM1), из смеси, обеспечивая получение очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения смесь, содержащая конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, содержит димеры цитотоксического агента, не связанные химически друг с другом с помощью линкера (например, DM1-DM1), в качестве примеси, и ПВДФ-мембрана удаляет некоторую часть димеров цитотоксического агента, не связанных химически друг с другом с помощью линкера (например, DM1-DM1), из смеси, обеспечивая получение очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент.

[0014] Когда смесь, содержащую конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, приводят в контакт с ПВДФ-мембраной, полученный очищенный конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент содержит пониженный уровень по меньшей мере одной или нескольких примесей по сравнению с уровнем содержания одной или нескольких примесей в смеси перед приведением в контакт смеси с ПВДФ-мембраной. Например, ПВДФ-мембрана удаляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или даже 100% одной или нескольких примесей в смеси по сравнению с уровнем содержания одной или нескольких примесей в смеси перед проведением воздействия на смесь с помощью ПВДФ-мембраны. В одном варианте реализации изобретения ПВДФ-мембрана удаляет от примерно 10% до примерно 100%, от примерно 10% до примерно 90%, от примерно 20% до примерно 100%, от примерно 20% до примерно 90%, от примерно 20% до примерно 80%, от примерно 30% до примерно 100%, от примерно 30% до примерно 90%, от примерно 30% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 80%, от примерно 50% до примерно 90%, от примерно 50% до примерно 100% (например, от примерно 60% до примерно 90%, от примерно 70% до примерно 90%), от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 90% до примерно 100%, или от примерно 95% до примерно 100% (например, от примерно 96% до примерно 100%, от примерно 97% до примерно 100%, от примерно 98% до примерно 100%, от примерно 99% до примерно 100%, от примерно 95% до примерно 96%, от примерно 95% до примерно 97%, от примерно 95% до примерно 98%, или от примерно 95% до примерно 99%) одной или нескольких примесей в смеси по сравнению с уровнем содержания одной или нескольких примесей в смеси перед приведением в контакт смеси с ПВДФ-мембраной.

[0015] В одном варианте реализации изобретения величину pH смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, регулируют перед приведением в контакт смеси с ПВДФ-мембраной. Величина pH смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, предпочтительно составляет от примерно 4 до примерно 9 (например, pH от примерно 4,5 до примерно 8,5, от примерно 5 до примерно 8, от примерно 5,5 до примерно 7,5, от примерно 6 до примерно 7, от примерно 6,5 до примерно 7,5, от примерно 7 до примерно 8, от примерно 8 до примерно 9, от примерно 4,5 до примерно 6, или от примерно 4,5 до примерно 5). В некоторых вариантах реализации изобретения pH смеси составляет от примерно 6 до примерно 6,5 (например, pH от 5,5 до 7, pH от 5,7 до 6,8, pH от 5,8 до 6,7, pH от 5,9 до 6,6, или pH от 6 до 6,5), pH примерно 6 или ниже (например, pH от примерно 4 до 6, от примерно 4 до примерно 5,5, от примерно 4 до примерно 4,5, от примерно 4 до примерно 5, от примерно 5 до 6), или pH примерно 6,5 или выше (например, pH от 6,5 до примерно 9, от примерно 6,5 до примерно 7, от примерно 7 до примерно 9, от примерно 7,5 до примерно 9, или от 6,5 до примерно 8). В одном варианте реализации изобретения pH смеси имеет значение выше 7,5 (например, pH от 7,6 до примерно 9, от 7,7 до примерно 9, от примерно 7,8 до примерно 9, от примерно 7,9 до примерно 9, от 7,6 до примерно 8,5, от 7,6 до примерно 8, от 7,7 до примерно 8,5, от 7,7 до примерно 8, от примерно 7,8 до примерно 8,4, от примерно 7,8 до примерно 8,2, от примерно 8 до примерно 9, или от примерно 8 до примерно 8,5). Например, величина pH смеси может быть равна pH 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; 8,6; 8,7; 8,8; 8, 9 или 9. В другом варианте реализации изобретения pH смеси составляет примерно 4,8 (например, от примерно 4,5 до примерно 5, от примерно 4,6 до примерно 5, или от примерно 4,7 до примерно 4,9).

[0016] Различные ПВДФ-мембраны известны специалистам в данной области техники и могут быть использованы в соответствии с изобретением, описанным в данном документе. В одном варианте реализации изобретения ПВДФ-мембрана имеет размер пор 0,22 микрон. В другом варианте реализации изобретения ПВДФ-мембрана имеет размер пор 0,45 микрон. В другом варианте реализации изобретения ПВДФ-мембрана представляет собой двухслойную мембрану, имеющую размеры пор 0,45 и 0,22 микрон (т.е., двухслойную мембрану с размерами пор 0,45/0,22 микрон).

[0017] В некоторых вариантах реализации изобретения ПВДФ-мембрану подвергают гамма-облучению. В других вариантах реализации изобретения ПВДФ-мембрану не подвергают гамма-облучению.

[0018] Был описан ряд способов получения конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент (см., например, публикацию патентной заявки США №2012/0253021; публикацию международной патентной заявки № WO 2012/135522; патент США 5208020; патент США 6441163; патент США 7811572; публикацию патентной заявки США №2006/0182750; публикацию патентной заявки США №2008/0145374; и публикацию патентной заявки США №2011/0003969).

[0019] В одном варианте реализации изобретения изобретение предлагает способ получения конъюгата, содержащего клеточно-связывающий агент, химически связанный с цитотоксическим агентом, в котором реакция модификации и реакция конъюгации объединены в одну стадию, с последующей стадией очистки (т.е., одностадийный процесс, описанный в публикации патентной заявки США №2012/0253021), и в котором процесс включает приведение в контакт смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, с ПВДФ-мембраной до или после стадии очистки. Одностадийный процесс включает приведение в контакт клеточно-связывающего агента (например, антитела) с цитотоксическим агентом с образованием первой смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, и затем приведение в контакт первой смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, бифункциональным сшивающим реагентом, содержащим линкер, в растворе, имеющем pH от примерно 4 до примерно 9, для получения второй смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей (например, свободный цитотоксический агент и побочные продукты реакции), где клеточно-связывающий агент химически связан с помощью линкера с цитотоксическим агентом. Вторую смесь затем подвергают очистке для получения очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. Вторую смесь, содержащую конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, приводят в контакт с ПВДФ-мембраной перед стадией очистки, после стадии очистки, или в обоих случаях.

[0020] Одностадийную реакцию предпочтительно проводят при pH от примерно 4 до примерно pH 9 (например, pH от примерно 4,5 до примерно 8,5, от примерно 5 до примерно 8, от примерно 5,5 до примерно 7,5, от примерно 6 до примерно 7, от примерно 6 до примерно 8, от примерно 6 до примерно 9, или от примерно 6,5 до примерно 7,5). В некоторых вариантах реализации изобретения реакцию проводят при pH от примерно 6 до примерно 8 (например, pH примерно 6, примерно 6,5, примерно 7, примерно 7,5 или примерно 8).

[0021] В одном варианте реализации изобретения реакцию проводят при pH примерно 7,1, примерно 7,2, примерно 7,3, примерно 7,4, примерно 7,5, примерно 7,6, примерно 7,7, примерно 7,8, примерно 7,9, примерно 8, примерно 8,1, примерно 8,2, примерно 8,3, примерно 8,4, примерно 8,5, примерно 8,6, примерно 8,7, примерно 8,8, примерно 8,9 или примерно 9. В другом варианте реализации изобретения реакцию проводят при pH от примерно 7,5 до примерно 9, от примерно 7,5 до примерно 8,5, от примерно 7,5 до примерно 8, от примерно 7,8 до примерно 9, от примерно 7,8 до примерно 8,5, от примерно 7,8 до примерно 8, от примерно 8 до примерно 9, от примерно 8 до примерно 8,5, или от примерно 8,5 до примерно 9. В другом варианте реализации изобретения реакцию проводят при pH примерно 7,8 (например, pH от 7,6 до 8,0 или pH от 7,7 до 7,9). В другом варианте реализации изобретения реакцию модификации проводят при pH примерно 8 (например, pH от 7,8 до 8,2 или pH от 7,9 до 8,1).

[0022] В другом варианте реализации изобретения реакцию проводят при pH выше 7,5 (например, pH от 7,6 до примерно 9, от 7,7 до примерно 9, от примерно 7,8 до примерно 9, от примерно 7,9 до примерно 9, от 7,6 до примерно 8,5, от 7,6 до примерно 8, от 7,7 до примерно 8,5, от 7,7 до примерно 8, от примерно 7,8 до примерно 8,4, от примерно 7,8 до примерно 8,2, от примерно 8 до примерно 9, или от примерно 8 до примерно 8,5).

[0023] В одном варианте реализации изобретения приведение в контакт осуществляют путем обеспечения клеточно-связывающего агента, затем приведение в контакт клеточно-связывающего агента с цитотоксическим агентом с образованием первой смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, и затем приведение в контакт первой смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, с бифункциональным сшивающим реагентом. Например, в одном варианте реализации изобретения обеспечивают клеточно-связывающий агент в реакционном сосуде, цитотоксический агент прибавляют в реакционный сосуд (тем самым приводя в контакт с клеточно-связывающим агентом), и затем бифункциональный сшивающий реагент прибавляют к смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент (тем самым приводя в контакт со смесью, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент). В одном варианте реализации изобретения обеспечивают клеточно-связывающий агент в реакционном сосуде, и цитотоксический агент прибавляют в реакционный сосуд немедленно после обеспечения клеточно-связывающего агента в сосуде. В другом варианте реализации изобретения обеспечивают клеточно-связывающий агент в реакционном сосуде, и цитотоксический агент прибавляют в реакционный сосуд через некоторое время после обеспечения клеточно-связывающего агента в сосуде (например, примерно 5 минут, примерно 10 минут, примерно 20 минут, примерно 30 минут, примерно 40 минут, примерно 50 минут, примерно 1 час, примерно 1 день или больше после обеспечения клеточно-связывающего агента в сосуде). Цитотоксический агент может быть добавлен быстро (т.е., за короткий промежуток времени, такой как примерно 5 минут, примерно 10 минут) или медленно (например, с помощью насоса).

[0024] Смесь, содержащая клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, может быть затем введена в контакт с бифункциональным сшивающим реагентом или немедленно после введения в контакт клеточно-связывающего агента с цитотоксическим агентом или в какой-то более поздний момент времени (например, от примерно 5 минут до примерно 8 часов или больше) после введения в контакт клеточно-связывающего агента с цитотоксическим агентом. Например, в одном варианте реализации изобретения бифункциональный сшивающий реагент прибавляют к смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, немедленно после прибавления цитотоксического агента в реакционный сосуд, содержащий клеточно-связывающий агент. Альтернативно, смесь, содержащая клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, может быть введена в контакт с бифункциональным сшивающим реагентом через примерно 5 минут, примерно 10 минут, примерно 20 минут, примерно 30 минут, примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 4 часа, примерно 5 часов, примерно 6 часов, примерно 7 часов, примерно 8 часов или больше, после введения в контакт клеточно-связывающего агента с цитотоксическим агентом.

[0025] В другом варианте реализации изобретения цитотоксический агент и бифункциональный агент прибавляют на протяжении множества циклов (например, 1, 2, 3, 4, 5 или больше циклов). Например, изобретение предлагает способ, включающий стадии: а) приведения в контакт клеточно-связывающего агента с цитотоксическим агентом с образованием первой смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент; и затем введения в контакт первой смеси с бифункциональным сшивающим реагентом, содержащим линкер, в растворе, имеющем pH от примерно 4 до примерно 9, для получения второй смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей (например, свободный цитотоксический агент и побочные продукты реакции), где клеточно-связывающий агент химически связан с помощью линкера с цитотоксическим агентом; b) приведения в контакт второй смеси с цитотоксическим агентом с образованием третьей смеси; и затем приведения в контакт третьей смеси с бифункциональным сшивающим реагентом при pH от примерно 4 до примерно 9 для получения четвертой смеси; и с) очистки четвертой смеси для получения очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент. В одном варианте реализации изобретения стадию b) проводят через некоторый период времени (например, примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа или больше) после стадии а). В другом варианте реализации изобретения стадия b) может быть повторена несколько раз (например, 1, 2, 3, 4 или больше раз) до проведения стадии с). Дополнительная стадия b) может быть проведена через некоторый период времени (например, примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа или больше) после начальной стадии b).

[0026] В другом варианте реализации изобретения бифункциональный сшивающий реагент прибавляют до завершения прибавления цитотоксического агента. Например, в одном варианте реализации изобретения цитотоксический агент прибавляют к клеточно-связывающему агенту непрерывно на протяжении периода времени (например, на протяжении примерно 5 минут, примерно 10 минут, примерно 30 минут, примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 3 часов или больше) с образованием смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент. Бифункциональный сшивающий реагент прибавляют к смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, до завершения прибавления цитотоксического агента, при условии, что в любой момент времени цитотоксический агент имеет молярный избыток по отношению к бифункциональному сшивающему реагенту. В одном варианте реализации изобретения бифункциональный сшивающий реагент прибавляют непрерывно на протяжении периода времени (например, на протяжении примерно 5 минут, примерно 10 минут, примерно 30 минут, примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 3 часов или больше).

[0027] После введения в контакт смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, с бифункциональным сшивающим реагентом, реакции позволяют протекать в течение примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 3 часов, примерно 4 часов, примерно 5 часов, примерно 6 часов, примерно 7 часов, примерно 8 часов, примерно 9 часов, примерно 10 часов, примерно 11 часов, примерно 12 часов, примерно 13 часов, примерно 14 часов, примерно 15 часов, примерно 16 часов, примерно 17 часов, примерно 18 часов, примерно 19 часов, примерно 20 часов, примерно 21 часов, примерно 22 часов, примерно 23 часов, примерно 24 часов или больше (например, примерно 30 часов, примерно 35 часов, примерно 40 часов, примерно 45 часов или примерно 48 часов).

[0028] Таким образом, в одном варианте реализации изобретения изобретение предлагает способ получения очищенного конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, включающий приведение в контакт клеточно-связывающего агента с цитотоксическим агентом с образованием первой смеси, содержащей клеточно-связывающий агент и цитотоксический агент, затем приведение в контакт первой смеси с бифункциональным сшивающим реагентом, содержащим линкер, в растворе, имеющем pH от примерно 4 до примерно 9, для получения второй смеси, содержащей конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, которая содержит клеточно-связывающий агент, химически связанный посредством линкера с цитотоксическим агентом, и одну или несколько примесей; (b) приведение в контакт второй смеси с поливинилдифторидной (ПВДФ) мембраной для удаления по меньшей мере части примесей, тем самым обеспечивая получение очищенной второй смеси конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент; и (с) обработку второй смеси после стадии (b) методом тангенциальной поточной фильтрации, селективного осаждения, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для дополнительной очистки конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент от примесей и тем самым получения очищенной третьей смеси конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, где очищенная третья смесь содержит пониженное количество примесей по сравнению с очищенной второй смесью. В способе по изобретению может быть использован любой способ очистки, описанный в данном документе. В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве стадии очистки используют тангенциальную поточную фильтрацию, адсорбционную хроматографию или неадсорбционную хроматографию.

[0029] В одном варианте реализации изобретения приведение клеточно-связывающего агента в контакт с бифункциональным сшивающим реагентом (т.е., реакция модификации) дает первую смесь, содержащую клеточно-связывающий агент, имеющий связанные с ним линкеры и одну или несколько примесей (например, реагенты и другие побочные продукты). В некоторых вариантах реализации изобретения первая смесь содержит клеточно-связывающий агент, имеющий линкеры, стабильно и нестабильно связанные с ним, и одну или несколько примесей (например, реагенты и другие побочные продукты). Линкер "стабильно" соединен с клеточно-связывающим агентом, если ковалентная связь между линкером и клеточно-связывающим агентом не подвергается существенному ослаблению или разрыву в нормальных условиях хранения в течение периода времени, который может составлять от нескольких месяцев до нескольких лет. В отличие от этого, линкер является "нестабильно" связанным с клеточно-связывающим агентом, если ковалентная связь между линкером и клеточно-связывающим агентом существенно ослабевает или разрывается в нормальных условиях хранения в течение периода времени, который может составлять от нескольких месяцев до нескольких лет.

[0030] Реакцию модификации предпочтительно проводят при pH от примерно 4 до примерно pH 9 (например, pH от примерно 4,5 до примерно 8,5, от примерно 5 до примерно 8, от примерно 5,5 до примерно 7,5, от примерно 6 до примерно 7, от примерно 6 до примерно 8, от примерно 6 до примерно 9 или от примерно 6,5 до примерно 7,5). В некоторых вариантах реализации изобретения реакцию модификации проводят при pH от примерно 6 до примерно 8 (например, pH примерно 6, примерно 6,5, примерно 7, примерно 7,5 или примерно 8).

[0031] В одном варианте реализации изобретения реакцию модификации проводят при pH примерно 7,1, примерно 7,2, примерно 7,3, примерно 7,4, примерно 7,5, примерно 7,6, примерно 7,7, примерно 7,8, примерно 7,9, примерно 8, примерно 8,1, примерно 8,2, примерно 8,3, примерно 8,4, примерно 8,5, примерно 8,6, примерно 8,7, примерно 8,8, примерно 8,9 или примерно 9. В другом варианте реализации изобретения реакцию модификации проводят при pH от примерно 7,5 до примерно 9, от примерно 7,5 до примерно 8,5, от примерно 7,5 до примерно 8, от примерно 7,8 до примерно 9, от примерно 7,8 до примерно 8,5, от примерно 7,8 до примерно 8, от примерно 8 до примерно 9, от примерно 8 до примерно 8,5 или примерно 8,5 до примерно 9. В другом варианте реализации изобретения реакцию модификации проводят при pH примерно 7,8 (например, pH от 7,6 до 8,0 или pH от 7,7 до 7,9). В другом варианте реализации изобретения реакцию модификации проводят при pH примерно 8 (например, pH от 7,8 до 8,2 или pH от 7,9 до 8,1).

[0032] В другом варианте реализации изобретения реакцию модификации проводят при pH выше 7,5 (например, pH от 7,6 до примерно 9, от 7,7 до примерно 9, от примерно 7,8 до примерно 9, от примерно 7,9 до примерно 9, от 7,6 до примерно 8,5, от 7,6 до примерно 8, от 7,7 до примерно 8,5, от 7,7 до примерно 8, от примерно 7,8 до примерно 8,4, от примерно 7,8 до примерно 8,2, от примерно 8 до примерно 9 или от примерно 8 до примерно 8,5). Например, способ по изобретению включает приведение в контакт клеточно-связывающего агента с бифункциональным сшивающим реагентом в растворе, имеющем pH 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9.

[0033] В одном варианте реализации изобретения очистку модифицированного клеточно-связывающего агента от примесей, образующихся в ходе реакции модификации (например, реагентов и побочных продуктов) проводят путем проведения процесса очистки смеси, полученной в результате реакции модификации (т.е., первой смеси). При этом первая смесь может быть очищена с использованием тангенциальной поточной фильтрации (TFF), например, способа мембранной тангенциальной поточной фильтрации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации или селективного осаждения или любого другого пригодного способа очистки, а также их комбинаций. Такая первая стадия очистки дает очищенную первую смесь, т.е., с повышенной концентрацией клеточно-связывающих агентов, имеющих связанные с ними линкеры, и пониженным количеством несвязанного бифункционального сшивающего реагента, по сравнению с первой смесью до очистки в соответствии с изобретением. Предпочтительно, первую смесь очищают с использованием тангенциальной поточной фильтрации или адсорбционной хроматографии (например, ионообменной хроматографии, такой как на керамическом гидроксиапатите).

[0034] После очистки первой смеси для получения очищенной первой смеси клеточно-связывающих агентов, имеющих связанные с ними линкеры, цитотоксический агент конъюгируют с клеточно-связывающими агентами, имеющими связанные с ними линкеры, в первой очищенной смеси путем проведения реакции клеточно-связывающих агентов, имеющих связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе, имеющем pH от примерно 4 до примерно 9, с образованием второй смеси, в результате которой получают вторую смесь, содержащую клеточно-связывающий агент, химически связанный посредством линкера с цитотоксическим агентом, и одну или несколько примесей (например, свободный цитотоксический агент и побочные продукты реакции).

[0035] Необязательно, очистка модифицированного клеточно-связывающего агента может быть опущена. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения первую смесь, содержащую клеточно-связывающий агент, имеющий связанные с ним линкеры, а также реагенты и другие побочные продукты, не подвергают процессу очистки. В данном случае, цитотоксический агент может быть добавлен одновременно со сшивающим реагентом или в какой-то более поздний момент времени, например, через 1, 2, 3 или больше часов после прибавления сшивающего реагента к клеточно-связывающему агенту. Модифицированный клеточно-связывающий агент конъюгируют с цитотоксическим агентом (например, майтанзиноидом) путем проведения реакции модифицированного клеточно-связывающего агента с цитотоксическим агентом в растворе, имеющем pH от примерно 4 до примерно 9, где стадия конъюгации приводит к образованию смеси стабильных конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, нестабильных конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, неконъюгированного цитотоксического агента (т.е., "свободного" цитотоксического агента), реагентов и побочных продуктов.

[0036] Реакцию конъюгации предпочтительно проводят при pH от примерно 4 до примерно pH 9 (например, pH от примерно 4,5 до примерно 8,5, от примерно 5 до примерно 8, от примерно 5,5 до примерно 7,5, от примерно 6,0 до примерно 7 или от примерно 6,5 до примерно 7,5). В некоторых вариантах реализации изобретения реакцию конъюгации проводят при pH от примерно 6 до примерно 6,5 (например, pH от 5,5 до 7, pH от 5,7 до 6,8, pH от 5,8 до 6,7, pH от 5,9 до 6,6 или pH от 6 до 6,5), pH примерно 6 или ниже (например, pH от примерно 4 до 6, от примерно 4 до примерно 5,5, от примерно 5 до 6), или при pH примерно 6,5 или выше (например, pH от 6,5 до примерно 9, от примерно 6,5 до примерно 7, от примерно 7 до примерно 9, от примерно 7,5 до примерно 9 или от 6,5 до примерно 8). В одном варианте реализации изобретения реакцию конъюгации проводят при pH от примерно 4 до pH ниже 6 или при pH от выше 6,5 до 9. В тех случаях, когда стадию конъюгации проводят при pH примерно 6,5 или выше, некоторые сульфгидрил-содержащие цитотоксические агенты могут иметь склонность димеризоваться путем образования дисульфидной связи. В одном варианте реализации изобретения удаление следов металлов и/или кислорода из реакционной смеси, а также необязательное добавление антиоксидантов или использование линкеров с более реакционноспособными отходящими группами или добавление цитотоксического агента в количестве более одной аликвоты, может быть необходимо для обеспечения эффективной реакции в такой ситуации.

[0037] После стадии конъюгации смесь, содержащая конъюгат клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент и одну или несколько примесей, подвергают обработке на стадии очистки. В данном случае, смесь со стадии конъюгации может быть очищена с использованием тангенциальной поточной фильтрации (TFF), например, способа мембранной тангенциальной поточной фильтрации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации или селективного осаждения или любого другого пригодного способа очистки, а также и