Генетически модифицированные в отношении т-клеточного рецептора мыши

Генетически модифицированные в отношении т-клеточного рецептора мыши

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №61/552582, поданной 28 октября 2011 года, предварительной заявкой на выдачу патента США №61/621198, поданной 6 апреля 2012 года, и предварительной заявкой на выдачу патента США №61/700908, поданной 14 сентября 2012 года, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированному не относящемуся к человеку животному, например, грызуну (например, мыши или крысе), которое содержит в своем геноме относящиеся к человеку или гуманизированные вариабельные генные локусы Т-клеточного рецептора (TCR) (например, вариабельные генные локусы TCR α и TCRβ и/или вариабельные генные локусы TCRδ и TCRγ), и экспрессирует относящиеся к человеку или гуманизированные полипептиды TCR (например, полипептиды TCRα и TCRβ и/или полипептиды TCRδ и TCRγ) из относящихся к человеку или гуманизированных вариабельных генных локусов TCR. Не относящееся к человеку животное с относящимися к человеку или гуманизированными вариабельными генными локусами TCR по настоящему изобретению содержит нереаранжированные генные сегменты вариабельной области TCR человека (например, сегменты V, D и/или J) на эндогенных не относящихся к человеку генных локусах TCR. Настоящее изобретение также относится к зародышам, тканям и клеткам (например, Т-клеткам), которые содержат относящиеся к человеку или гуманизированные вариабельные генные локусы TCR и экспрессируют относящиеся к человеку или гуманизированные полипептиды TCR. Также предусмотрены способы получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, содержащего относящиеся к человеку или гуманизированные вариабельные генные локусы TCR; и способы применения не относящихся к человеку животных, зародышей, тканей и клеток, которые содержат относящиеся к человеку или гуманизированные вариабельные генные локусы TCR и экспрессируют относящиеся к человеку или гуманизированные полипептиды TCR из их локусов.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В приобретенном иммунном ответе чужеродные антигены распознаются рецепторными молекулами на В-лимфоцитах (например, иммуноглобулинами) и Т-лимфоцитах (например, Т-клеточным рецептором, или TCR). В то время как патогены в крови и внеклеточном пространстве распознаются антителами в ходе гуморального иммунного ответа, разрушение патогенов внутри клеток опосредуется Т-клетками в ходе клеточного иммунного ответа.

Т-клетки распознают и атакуют антигены, презентированные им в контексте главного комплекса гистосовместимости (МНС) на клеточной поверхности. Распознавание антигена опосредуется TCR, экспрессированными на поверхности Т-клеток. Два основных класса Т-клеток выполняют эту функцию: цитотоксические Т-клетки, которые экспрессируют белок клеточной поверхности CD8, и хелперные Т-клетки, которые экспрессируют белок клеточной поверхности CD4. Цитотоксические Т-клетки активируют каскады передачи сигнала, которые приводят к непосредственному разрушению клетки, презентирующей антиген (в контексте МНС I), тогда как хелперные Т-клетки дифференцируются в несколько классов, и их активация (примированная распознаванием антигена, презентированного в контексте МНС II) приводит к опосредованному макрофагами разрушению патогена и стимуляции продукции антител В-клетками.

Вследствие антигенной специфичности антител в настоящее время проводят обширные исследования антител в отношении их терапевтического потенциала против многочисленных нарушений у людей. Для создания антител, способных нейтрализовать мишени у людей, одновременно избегая активации иммунных ответов против таких антител, ученые сконцентрировали свои усилия на получении относящихся к человеку или гуманизированных иммуноглобулинов. Одним из путей получения гуманизированных антител in vivo является использование мыши VELOCIMMUNE®, гуманизированной мыши, содержащей (1) репертуар нереаранжированных сегментов V, D и J иммуноглобулина человека, функционально связанных друг с другом, и константную область мыши на эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши и (2) репертуар нереаранжированных сегментов Vκ и Jκ человека, функционально связанных друг с другом, и константную κ область мыши на эндогенном локусе κ легкой цепи иммуноглобулина мыши. В связи с этим, мыши VELOCIMMUNE® обеспечивают богатый источник реаранжированных вариабельных доменов антитела с высокой степенью разнообразия для применения в конструировании антител человека.

Аналогично антителу Т-клеточный рецептор содержит вариабельную область, кодируемую переаранжированными локусами (α и β локусами, или δ и γ локусами), содержащими сегменты V(D)J вариабельной области, и эта вариабельная область обеспечивает Т-клетке ее антигенсвязывающую специфичность. Также аналогично антителу специфичность TCR к его антигену может использоваться для разработки новых терапевтических средств. Таким образом, в настоящей области техники существует потребность в не относящихся к человеку животных (например, грызунах, например, крысах или мышах), которые содержат нереаранжированные генные сегменты вариабельной области Т-клетки человека, способные к реаранжировке для образования генов, которые кодируют вариабельные домены Т-клеточного рецептора человека, включающие в себя домены, которые являются родственными друг для друга, и включающие в себя домены, которые специфически связывают представляющий интерес антиген. Также существует потребность в не относящихся к человеку животных, которые содержат локусы вариабельной области Т-клетки, которые содержат консервативные гуманизированные сегменты, включающих в себя не относящихся к человеку животных, которые содержат нереаранжированные генные сегменты человека, которые могут реаранжироваться для образования генов вариабельной области Т-клеточного рецептора, которые связаны с не относящимися к человеку (эндогенными) генными последовательностями константной области Т-клеточного рецептора. Остается необходимость в не относящихся к человеку животных, которые способные создавать разнообразный репертуар вариабельных последовательностей Т-клеточного рецептора человека. Существует потребность в не относящихся к человеку животных, которые способны к реаранжировке большинства или всех функциональных сегментов вариабельной области Т-клеточного рецептора, в ответ на представляющий интерес антиген, для образования полипептидов Т-клеточного рецептора, которые содержат полностью человеческие вариабельные домены.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусмотрены не относящиеся к человеку животные, например, грызуны, содержащие не относящиеся к человеку клетки, которые экспрессируют гуманизированные молекулы, выполняющие функции в клеточном иммунном ответе. Также предусмотрены не относящиеся к человеку животные, которые содержат нереаранжированные вариабельные генные локусы TCR. Предусмотрены системы in vivo и in vitro, которые содержат гуманизированные клетки грызуна, причем клетки грызуна экспрессируют одну или несколько гуманизированных молекул иммунной системы. Также предусмотрены нереаранжированные гуманизированные локусы TCR грызуна, которые кодируют гуманизированные белки TCR.

Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное (например, грызун, например, мышь или крыса), которое содержит в своем геноме (а) нереаранжированный вариабельный генный локус TCRα, содержащий по меньшей мере один сегмент Vα человека и по меньшей мере один сегмент Jα человека, функционально связанный с не относящейся к человеку (например, относящейся к грызуну, например, мыши или крысе) константной генной последовательностью TCRα, и/или (b) нереаранжированный вариабельный генный локус TCRβ, содержащий по меньшей мере один сегмент Vβ человека, по меньшей мере один сегмент Dβ человека и по меньшей мере один сегмент Ιβ человека, функционально связанный с не относящейся к человеку (например, относящейся к грызуну, например, мыши или крысе) константной генной последовательностью ΤCRβ.

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный вариабельный генный локус TCRα замещает эндогенный не относящийся к человеку (например, относящийся к грызуну) вариабельный генный локус TCRα на эндогенном вариабельном генном локусе TCRα. Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный вариабельный генный локус ΤCRβ замещает эндогенный не относящийся к человеку (например, относящийся к грызуну) вариабельный генный локус ΤCRβ на эндогенном вариабельном генном локусе ΤCRβ. Согласно одному варианту осуществления эндогенные не относящиеся к человеку (например, относящиеся к грызуну) сегменты Vα и Jα являются неспособными к реаранжировке для образования реаранжированной последовательности Vα/Jα. Согласно одному варианту осуществления эндогенные не относящиеся к человеку (например, относящиеся к грызуну) сегменты Vβ, Dβ и Jβ являются неспособными к реаранжировке для образования реаранжированной последовательности Vβ/Dβ/Jβ. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит такую делецию, что геном животного не содержит функциональный сегмент Vα и функциональный сегмент Jα. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное содержит такую делецию, что геном животного не содержит функциональный эндогенный сегмент Vβ, функциональный эндогенный сегмент Dβ и функциональный эндогенный сегмент Jβ. Согласно одному варианту осуществления животное содержит делецию всех функциональных эндогенных сегментов Vα и Jα. Согласно одному варианту осуществления грызун содержит делению всех функциональных эндогенных сегментов Vβ, Dβ и Jβ. Согласно некоторым вариантам осуществления сегменты Vα и Jα человека реаранжируются для образования реаранжированной последовательности Vα/Jα. Согласно некоторым вариантам осуществления сегменты Vβ, Dβ и Jβ человека реаранжируются для образования реаранжированной последовательности Vβ/Dβ/Jβ. Таким образом, согласно различным вариантам осуществления не относящееся к человеку животное (например, грызун) экспрессирует Т-клеточный рецептор, содержащий вариабельную область человека и не относящуюся к человеку (например, относящуюся к грызуну) константную область на поверхности Т-клетки.

Согласно некоторым аспектам Т-клетки не относящегося к человеку животного проходят развитие Т-клеток в тимусе для образования одинарных позитивных в отношении CD4 и CD8 Т-клеток. Согласно некоторым аспектам не относящееся к человеку животное содержит нормальное соотношение CD3+ Т-клеток селезенки к общему количеству спленоцитов. Согласно различным вариантам осуществления не относящееся к человеку животное производит популяцию центральных и эффекторных Т-клеток памяти в периферических органах.

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный вариабельный генный локус TCRα у описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного содержит 61 сегмент Jα человека и 8 сегментов Vα человека. Согласно другому варианту осуществления нереаранжированный вариабельный генный локус TCRα у не относящегося к человеку животного содержит полный репертуар сегментов Jα человека и полный репертуар сегментов Vα человека.

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный вариабельный генный локус ΤCRβ у описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного содержит 14 сегментов Jβ человека, 2 сегмента Dβ человека и 14 Vβ сегментов человека. Согласно другому варианту осуществления нереаранжированный вариабельный генный локус ΤCRβ у не относящегося к человеку животного содержит полный репертуар сегментов Jβ человека, полный репертуар сегментов Dβ человека и полный репертуар сегментов Vβ человека.

Согласно дополнительному варианту осуществления описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное (например, грызун) дополнительно содержит нуклеотидные последовательности вариабельных сегментов TCRα человека на гуманизированном локусе TCRα. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное (например, грызун) дополнительно содержит по меньшей мере один из сегментов Vδ, Dδ и Jδ человека, например, полный репертуар сегментов Vδ, Dδ и Jδ человека на гуманизированном локусе TCRα.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное сохраняет эндогенный не относящийся к человеку локус TCRα и/или TCRβ, причем локус представляет собой нефункциональный локус.

Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун выбран из мыши и крысы. Согласно одному варианту осуществления грызун представляет собой мышь.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, содержащей в своем геноме (а) нереаранжированный вариабельный генный локус TCRα, содержащий репертуар сегментов Jα человека и репертуар сегментов Vα человека, функционально связанный с не относящейся к человеку (например, относящейся к мыши или крысе) константной генной последовательностью TCRα, и/или (b) нереаранжированный вариабельный генный локус ΤCRβ, содержащий репертуар сегментов Jβ человека, репертуар сегментов Dβ человека и репертуар сегментов Vβ человека, функционально связанный с не относящейся к человеку (например, относящейся к мыши или крысе) константной генной последовательностью TCRβ. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит полный репертуар сегментов Vα человека. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит полный репертуар сегментов Vβ человека. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит полный репертуар сегментов Vα человека и сегментов Jα человека. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит полный репертуар сегментов Vα человека и сегментов Vβ человека. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит полный репертуар сегментов Vα человека, сегментов Jα человека, сегментов Vβ человека, сегментов Dβ человека и сегментов Jβ человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит по меньшей мере один эндогенный сегмент Vα мыши и по меньшей мере один эндогенный сегмент Jα мыши, причем эндогенные сегменты являются неспособными к реаранжировке для образования реаранжированной последовательности Vα/Jα, а также содержит по меньшей мере один эндогенный сегмент Vβ мыши, по меньшей мере один эндогенный сегмент Dβ мыши и по меньшей мере один эндогенный сегмент Jβ мыши, причем эндогенные сегменты являются неспособными к реаранжировке для образования реаранжированной последовательности Vβ/Dβ/Jβ.

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный вариабельный генный локус TCRα, который содержит сегменты вариабельной области TCRα человека замещает вариабельный гены TCRα мыши на эндогенном вариабельном локусе TCRα мыши, и нереаранжированный вариабельный генный локус TCRβ, который содержит сегменты вариабельной области ΤCRβ человека замещает вариабельные гены TCRβ мыши на эндогенном вариабельном локусе TCRβ мыши.

Согласно одному варианту осуществления сегменты Vα и Jα человека реаранжируются для образования реаранжированной последовательности Vα/Jα человека, и сегменты Vβ, Dβ и Jβ человека реаранжируются для образования реаранжированной последовательности Vβ/Dβ/Jβ человека. Согласно одному варианту осуществления реаранжированная последовательность Vα/Jα человека функционально связана с последовательностью константной области TCRα мыши. Согласно одному варианту осуществления реаранжированная последовательность Vβ/Dβ/Jβ человека функционально связана с последовательностью константной области ΤCRβ мыши. Таким образом, согласно различным вариантам осуществления мышь экспрессирует Т-клеточный рецептор на поверхности Т-клетки, причем Т-клеточный рецептор содержит вариабельную область человека и константную область мыши.

Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит репертуар сегментов вариабельной области TCRδ человека (например, сегменты Vδ, Jδ и Dδ человека) на гуманизированном локусе TCRα. Согласно одному варианту осуществления репертуар сегментов вариабельной области TCRδ человека представляет собой полный репертуар сегментов вариабельной области TCRδ человека. Согласно одному варианту осуществления сегменты вариабельной области TCRδ человека находятся на эндогенном локусе TCRα. Согласно одному варианту осуществления сегменты вариабельной области TCRδ человека замещают эндогенные сегменты вариабельной области TCRδ мыши.

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированная мышь экспрессирует Т-клеточный рецептор, содержащий вариабельную область человека и константную область мыши на поверхности Т-клетки. Согласно одному аспекту Т-клетки мыши проходят развитие Т-клеток в тимусе для образования одинарных позитивных в отношении CD4 и CD8 Т-клеток. Согласно одному аспекту мышь содержит нормальное соотношение CD3+ Т-клеток селезенки к общему количеству спленоцитов; согласно одному аспекту мышь производит популяцию центральных и эффекторных Т-клеток памяти к представляющему интерес антигену.

Также предусмотрены способы получения описанных в настоящем документе генетически модифицированных не относящихся к человеку животных (например, грызунов, например, мышей или крыс).

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения гуманизированного грызуна (например, мыши или крысы), предусматривающий замещение сегментов вариабельной области TCRα и ΤCRβ грызуна, но не константных генов грызуна, переаранжированными сегментами вариабельной области TCRα и ΤCRβ человека на эндогенных локусах TCR грызуна. Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает замещение сегментов вариабельной области TCRα грызуна (Vα и/или Jα) сегментами вариабельной области TCRα человека (Vα и/или Jα), причем сегменты вариабельной области TCRα функционально связаны с не относящимся к человеку геном константной области TCR для образования гуманизированного локуса TCRα; и замещение сегменты вариабельной области ΤCRβ грызуна (Vβ и/или Dβ и/или Jβ) сегментам вариабельной области ΤCRβ человека (Vβ и/или Dβ и/или Jβ), причем сегменты вариабельной области ΤCRβ функционально связаны с не относящимся к геном константной области TCR человека для образования гуманизированного локуса TCRβ. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный грызун представляет собой мышь, и зародышевая линия мыши содержит сегменты вариабельной области TCRα человека, функционально связанные с эндогенной константной последовательностью TCRα мыши на эндогенном локусе TCRα; и зародышевая линия мыши содержит сегменты вариабельной области ΤCRβ человека, функционально связанные с эндогенной константной последовательностью ΤCRβ мыши на эндогенном локусе TCRβ.

Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, мыши или крысы), которое экспрессирует Т-клеточный рецептор, содержащий относящуюся к человеку или гуманизированную вариабельную область и не относящуюся к человеку (например, относящуюся к грызуну) константную область на поверхности Т-клетки, предусматривающий: замещение у первого не относящегося к человеку животного эндогенного не относящегося к человеку вариабельного генного локуса TCRα нереаранжированным гуманизированным вариабельным генным локусом TCRα, содержащим по меньшей мере один сегмент Vα человека и по меньшей мере один сегмент Jα человека, причем гуманизированный вариабельный генный локус TCRα функционально связан с эндогенной не относящейся к человеку константной областью TCRα; замещение у второго не относящегося к человеку животного эндогенного не относящегося к человеку вариабельного генного локуса ΤCRβ нереаранжированным гуманизированным вариабельным генным локусом ΤCRβ, содержащим по меньшей мере один сегмент Vβ человека, по меньшей мере один сегмент Dβ человека и по меньшей мере один сегмент Jβ человека, причем гуманизированный вариабельный генный локус TCRβ функционально связан с эндогенной константной областью ΤCRβ; и скрещивание первого и второго не относящегося к человеку животного для получения не относящегося к человеку животного, которое экспрессирует Т-клеточный рецептор, содержащий относящуюся к человеку или гуманизированную вариабельную область и не относящуюся к человеку константную область.

Согласно одному варианту осуществления способа эндогенные не относящиеся к человеку (например, относящиеся к грызуну) сегменты Vα и Jα являются неспособными к реаранжировке для образования реаранжированной последовательности Vα/Jα, и эндогенные не относящиеся к человеку (например, относящиеся к грызуну) сегменты Vβ, Dβ и Jβ являются неспособными к реаранжировке для образования реаранжированной последовательности Vβ/Dβ/Jβ. Согласно одному варианту осуществления способа сегменты Vα и Jα человека реаранжируются для образования реаранжированной последовательности Vα/Jα, и сегменты Vβ, Dβ и Jβ человека реаранжируются для образования реаранжированной последовательности Vβ/Dβ/Jβ. Согласно одному варианту осуществления способа нереаранжированный гуманизированный вариабельный генный локус TCRα содержит 61 сегмент Jα человека и 8 сегментов Vα человека, и нереаранжированный гуманизированный вариабельный генный локус TCRβ содержит 14 сегментов Vβ человека, 2 сегмента Dβ человека и 14 сегментов Jβ человека. Согласно другому варианту осуществления способа нереаранжированный гуманизированный вариабельный генный локус TCRα содержит полный репертуар сегментов Jα человека и полный репертуар сегментов Vα человека, и нереаранжированный гуманизированный вариабельный генный локус TCRβ содержит полный репертуар сегментов Vβ человека, полный репертуар сегментов Dβ человека и полный репертуар сегментов Jβ человека.

Согласно одному аспекту способа Т-клетки не относящегося к человеку животного (например, грызуна) проходят развитие Т-клеток в тимусе для образования одинарных позитивных в отношении CD4 и CD8 Т-клеток. Согласно одному аспекту не относящееся к человеку животное (например, грызун) содержит нормальное соотношение CD3+ Т-клеток селезенки к общему количеству спленоцитов. Согласно одному аспекту не относящееся к человеку животное (например, грызун) производит популяцию центральных и эффекторных Т-клеток памяти к представляющему интерес антигену.

Согласно некоторым вариантам осуществления замещение описанного в настоящем документе эндогенного не относящегося к человеку вариабельного генного локуса TCRα проводят в единственной ES клетке и единственную ES клетку вводят в зародыш не относящегося к человеку (например, относящегося к грызуну, например, мыши или крысе) для получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного (т.е. первого не относящегося к человеку животного, например, первого грызуна); и замещение описанного в настоящем документе эндогенного не относящегося к человеку вариабельного генного локуса TCRβ проводят в единственной ES клетке и единственную ES клетку вводят в зародыш не относящегося к человеку (например, относящегося к грызуну, например, мыши или крысе) для получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного (т.е. второго не относящегося к человеку животного, например, второго грызуна). Согласно одному варианту осуществления первого грызуна и второго грызуна скрещивают для получения потомства, причем потомство содержит в своей зародышевой линии гуманизированный вариабельный локус TCRα и гуманизированный вариабельный локус TCRβ.

Согласно одному варианту осуществления способа не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна, например, мышь. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения генетически модифицированной мыши.

Также в настоящем документе предусмотрены клетки, например, выделенные Т-клетки (например, цитотоксические Т-клетки, Т-хелперы, Т-клетки памяти и т.д.), полученные от описанных в настоящем документе не относящихся к человеку животных (например, грызунов, например, мышей или крыс). Также предусмотрены ткани и зародыши, полученные от описанных в настоящем документе не относящихся к человеку животных.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения вариабельного домена TCR человека, предусматривающий генетическую модификацию грызуна, описанного в настоящем документе, для введения гуманизированного локуса TCRα и/или гуманизированного локуса ΤCRβ, содержание грызуна в условиях, достаточных для образования Т-клетки, причем Т-клетка экспрессирует вариабельный домен TCRα человека /или вариабельный домен ΤCRβ человека.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен TCR человека, который связывает представляющий интерес эпитоп, предусматривающий воздействие на описанное в настоящем документе не относящееся к человеку животное представляющего интерес эпитопа, содержание не относящегося к человеку животного в условиях, достаточных для того, чтобы животное презентировало представляющий интерес эпитоп гуманизированному TCR животного, и идентификацию нуклеиновой кислоты животного, которая кодирует полипептид вариабельного домена TCR человека, который связывает представляющий интерес эпитоп.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения гуманизированного рецептора TCR. Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения вариабельного домена TCR человека. Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен TCR человека.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен TCR человека или его фрагмент, для получения антигенсвязывающего белка. Согласно одному варианту осуществления антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен TCR, содержащий вариабельный домен TCRα человека и/или вариабельный домен TCRβ человека, который связывает представляющий интерес антиген.

Согласно одному аспекту предусмотрено применение описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного для получения не относящейся к человеку клетки, которая экспрессирует на своей поверхности гуманизированный Т-клеточный рецептор.

Согласно одному аспекту предусмотрен гуманизированный Т-клеточный рецептор от описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Согласно одному аспекту предусмотрена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельный домен TCR человека или его фрагмент, полученная у описанного в настоящем документе не относящегося к человеку животного.

Любой из описанных в настоящем документе вариантов осуществления и аспектов может использоваться совместно друг с другом, если иное не указано или не очевидно из контекста. Другие варианты осуществления станут очевидными специалистам в настоящей области техники из обзора последующего подробного раскрытия. Последующее подробное раскрытие включает в себя иллюстративные представления различных вариантов осуществления настоящего изобретения, которые не ограничивают заявленное настоящее изобретение. Прилагаемые фигуры составляют часть настоящего описания изобретения и вместе с описанием служат исключительно для иллюстрации вариантов осуществления, а не для ограничения настоящего изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано взаимодействие у мыши между молекулой TCR и молекулой МНС: на левой панели показана Т-клетка (сверху) мыши от гуманизированной в отношении TCR, содержащая Т-клеточный рецептор с вариабельными доменами TCR человека и константными доменами TCR мыши, которая распознает антиген (серый кружок), презентированный посредством МНС I класса антигенпрезентирующей клеткой (внизу); на правой панели показано то же для МНС II класса. Комплексы МНС I и МНС II показаны вместе со своими соответствующими корецепторами, CD8 и CD4. Относящиеся к мыши области показаны черным цветом и относящиеся к человеку области показаны белым цветом.

На фиг. 2 показана (без соблюдения масштаба) общая организация локуса TCRα мыши (верхняя панель, первый локус) и человека (верхняя панель, второй локус). На нижней панели показана стратегия замещения сегментов вариабельной области TCRα у мыши (закрашенные символы) сегментами вариабельной области TCRα человека (незакрашенные символы) на эндогенном локусе мыши на 14 хромосоме; гуманизированный локус TCRα с сегментами Vα и Jα человека показан с константной областью мыши и энхансером мыши; в показанном варианте осуществления локус TCRδ удален в ходе гуманизации.

На фиг. 3 показана (без соблюдения масштаба) поэтапная стратегия гуманизации локуса TCRα мыши, причем генные сегменты вариабельной области TCRα последовательно добавляют выше против хода транскрипции от исходного участка гуманизации подвергнутого делеции локуса мыши (MAID 1540). Последовательность мыши показана закрашенными символами; последовательность человека показана незакрашенными символами. MAID относится к идентификационному номеру (ID) модифицированного аллеля. TRAV = сегмент Vα TCR, TRAJ = сегмент Jα TCR (hTRAJ = TRAJ человека), TRAC = домен Cα TCR, TCRD = TCRδ.

На фиг. 4 представляет собой подробное описание (без соблюдения масштаба) поэтапной стратегии гуманизации на локусе TCRα. На фиг. 4А показана делеция сегментов V и J TCRα мыши; на фиг. 4В показана стратегия вставки 2 сегментов V и 61 сегмента J человека в подвергнутый делеции локус TCRα мыши; на фиг. 4С показана стратегия вставки дополнительных сегментов V человека, дающей в результате в общем 8 сегментов V и 61 сегмент J человека; на фиг. 4D показана стратегия вставки дополнительных сегментов V человека, дающей в результате в общем 23 V и 61 J сегмент человека; фиг. 4Е показана стратегия вставки дополнительных сегментов V человека, дающая в результате 35 V и 61 J сегмент человека; фиг. 4F показана стратегия вставки дополнительных сегментов человека, дающая в результате 48 V и 61 J сегмент человека; и фиг. 4G показана стратегия вставки дополнительных сегментов человека, дающая в результате 54 V и 61 J сегмент человека. MAID относится к идентификационному номеру модифицированного аллеля.

На фиг. 5 показан (без соблюдения масштаба) один вариант осуществления стратегии гуманизации локуса TCRα мыши, при которой последовательности TCR□δ человека (TCRδ Vs, TCRδ Ds, TCRδ Js, TCRδ enh (энхансер) и константную последовательность TCRδ (С)) также замещают на гуманизированном локусе TCRα. Последовательность мыши показана закрашенными символами; последовательность человека показана незакрашенными символами. LTVEC относится к большому нацеливающему вектору; hTRD = TCRδ человека.

На фиг. 6 показана (без соблюдения масштаба) общая организация локусов TCRβ мыши (верхняя панель, первый локус; на 6 хромосоме мыши) и человека (верхняя панель, второй локус; на 7 хромосоме человека). На нижней панели показана стратегия замещения сегментов вариабельной области TCRβ у мыши (закрашенные символы) сегментами вариабельной области ΤCRβ человека (незакрашенные символы) на эндогенном локусе мыши на 6 хромосоме мыши. Гуманизированный локус ΤCRβ, содержащий сегменты Vβ, Dβ и Jβ человека, показан с константными областями мыши и энхансером мыши; согласно показанному варианту осуществления гуманизированный локус сохраняет гены трипсиногена мыши (сплошные прямоугольники); и согласно показанному конкретному варианту осуществления единственный сегмент V мыши сохраняют против хода транскрипции 5' от генов трипсиногена мыши.

На фиг. 7 показана (без соблюдения масштаба) поэтапная стратегия гуманизации локуса ΤCRβ мыши, причем генные сегменты вариабельной области TCRβ последовательно добавляют к подвергнутому делеции вариабельному локусу TCRβ мыши. Последовательность мыши показана закрашенными символами; последовательность человека показана незакрашенными символами. MAID относится к идентификационному номеру модифицированного аллеля. TRBV или TCRBV = сегмент V TCRβ.

На фиг. 8 показано подробное описание поэтапной стратегии гуманизации на локусе TCRβ. На фиг. 8А показана стратегия делеции сегментов V ΤCRβ мыши; на фиг. 8В показана стратегия вставки 14 сегментов V сегментов в подвергнутый делеции локус ΤCRβ; на фиг. 8С показана стратегия вставки 2 D и 14 J сегментов в локус ΤCRβ (i), с последующей делецией сайта loxP (ii), дающей в результате 14 V, 2 D и 14 J сегментов человека; на фиг. 8D показана стратегия вставки дополнительных сегментов V человека, дающая в результате 40 V, 2 D и 14 J сегментов человека; и на фиг. 8Е показана стратегия вставки дополнительных сегментов V человека, дающей в результате 66 V, 2 D и 14 J сегментов человека; на фиг. 8F показано замещение сегмента V мыши ниже по ходу транскрипции от энхансера мыши, дающее в результате 67 V, 2 D и 14 J сегментов человека. Согласно этому конкретному варианту осуществления один сегмент V мыши сохраняют 5' от генов трипсиногена мыши.

На фиг. 9 показана репрезентативные гистограммы анализа FACS для процентного содержания клеток селезенки (где ось Y представляет собой количество клеток, ось X представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции, и гейт показывает частоту встречаемости CD3+ Т-клеток в пределах отдельной популяции лимфоцитов), окрашенных антителом к CD3 у мыши дикого типа(WT); мыши, гомозиготной в отношении подвергнутого делении локуса TCRα (первая верхняя панель; MAID 1540 из фиг. 3); мыши, гомозиготной в отношении подвергнутого делеции локуса TCRα и содержащей 8 сегментов Vα человека и 61 сегмент Jα человека (вторая верхняя панель; MAID 1767 из фиг. 3 или гуманизированной в отношении TCRα мыши); мыши, гомозиготной в отношении подвергнутого делеции локуса ΤCRβ за исключением одного вышележащего и одного нижележащего сегментов Vβ мыши (первая нижняя панель; MAID 1545 из фиг. 7); мыши, гомозиготной в отношении подвергнутого делеции локуса ΤCRβ с одним вышележащим и одним нижележащим сегментами Vβ мыши и содержащей 14 сегментов Vβ человека, 2 сегмента Dβ человека и 14 сегментов Jβ человека (вторая нижняя панель; MAID 1716 из фиг. 7 или гуманизированной в отношении TCRβ мыши); и мыши, гомозиготной в отношении делеций как локусов TCRα, так и локусов ΤCRβ (за исключением указанных двух сегментов Vβ мыши) и содержащей 8 сегментов Vα человека и 61 сегментов Jα человека на эндогенном локусе TCRα, а также 14 сегментов Vβ человека, 2 сегмента Dβ человека и 14 сегментов Jβ человека на эндогенных локусах ΤCRβ (MAID 1767/1716 или гуманизированной в отношении TCRα/β мыши).

На фиг. 10 представляет собой репрезентативный контурный график FACS клеток тимуса мыши от WT, гомозиготной гуманизированной TCRα (1767 НО; hTCRα); гомозиготной гуманизированной ΤCRβ (1716 НО; hΤCRβ); и гомозиготной гуманизированной TCRα/β мыши (1716 НО 1767 НО; hTCRα/β), окрашенных антителом к CD4 (ось Υ) и антителом к CD8 (ось X) (верхняя панель), и антителом к CD44 (ось Υ) и антителом к CD25 (ось X) (нижняя панель). График FACS на верхней панели позволяет различить двойные негативные (DN), двойные позитивные (DP), CD4 одинарные позитивные (CD4 SP), и CD8 одинарные позитивные (SP CD8) Т-клетки. График FACS на нижней панели позволяет различить различные стадии двойных негативных Т-клеток в ходе развития Т-клеток (DN1, DN2, DN3 и DN4). 1716 и 1767 относятся к номерам MAID, как показано на фигурах 3 и 7.

На фиг. 11 показана или частота встречаемости (верхняя панель), или абсолютное количество (нижняя панель) DN, DP, CD4 SP и CD SP Т-клеток в тимусе или мышей WT, или hTCRα (1767 НО); hTCRβ (1716 НО); или hTCRα/β (1716 НО 1767 НО) мышей (n=4).

На фиг. 12 представляет собой репрезентативный анализ FACS клеток селезенки мыши WT, hTCRα (1767 НО); hTCRβ (1716 НО); или hTCRα/β (1716 НО 1767 НО) мышей: на левой панели представлен анализ одинарных Т-клеток на основании окрашивания