Способы лечения заболеваний, ассоциированных с s. aureus

Способы лечения заболеваний, ассоциированных с s. aureus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении представлены способы предупреждения и/или лечения бактериемии и сепсиса, ассоциированных с S. aureus, и способы предупреждения и/или лечения пневмонии, ассоциированной с S. aureus, у пациентов с ослабленным иммунитетом с помощью антител к альфа-токсину S. aureus (антител к АТ).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Staphylococcus aureus (S. aureus) является главной причиной смертности и заболеваемости во всем мире, вызывая ряд разнообразных инфекций, начиная от легких инфекций кожи и мягких тканей и заканчивая тяжелыми инвазивными заболеваниями, такими как эндокардит, остеомиелит и некротическая пневмония (Lowy FD, N Engl J Med, 339(8): 520-32 (1998); Klevens et al., JAMA 298(15): 1763-71 (2007). S. aureus обычно классифицируют как метициллинрезистентные (MRSA) либо метициллинчувствительные (MSSA). В нескольких сообщениях было показано, что инфекции, вызываемые S. aureus, приводят в результате к серьезным последствиям вне зависимости от состояния резистентности (Fowler et al., Arch Intern Med. 163(17):2066-72 (2003); de Kraker et al., PLoS Med. Oct; 8(10):e1001104 (2011).

Применение антибиотиков является стандартом лечения для лечения заболевания, вызываемого S. aureus. Несмотря на внедрение новых антибиотиков против S. aureus, появление новых механизмов резистентности требует новых подходов для предупреждения или лечения заболеваний, вызываемых S. aureus. До эры антибиотиков в клинической практике применяли пассивное введение иммунных сывороток инфицированным пациентам для лечения бактериальных инфекций (Keller and Stiehm, Clin Microbiol Rev 13(4):602-14 (2000)). В настоящее время аналогичные способы применяют для лечения некоторых бактериальных заболеваний, опосредованных токсинами (например, ботулизма, дифтерии, столбняка) (Keller and Stiehm, Clin Microbiol Rev 13(4):602-14 (2000); Arnon et al., N. Engl. J. Med. 354: 462-471 (2006). Альфа-токсин (AT) S. aureus является ключевой детерминантой вирулентности (среди многих других внеклеточных факторов), как было показано в нескольких моделях заболеваний, вызываемых S. aureus (например, дермонекроза, пневмонии, сепсиса, эндокардита и мастита) при сравнении штаммов S. aureus с дефицитом экспрессии AT с изогенными родительскими штаммами дикого типа (Bramley et al., Infect Immun. 57(8):2489-94 (1989); Bayer et al., Infect. Immun. 65: 4652-4660 (1997); Kernodle et al., Infect. Immun. 65: 179-184 (1997); Bubeck Wardenburg et al., Infect Immun. 75(2):1040-4 (2007); Bubeck Wardenburg et al., J Exp Med. 205(2):287-94 (2008); Kobayashi et al., J Infect Dis. 204(6):937-41 (2011)).

AT представляет собой цитолитический порообразующий токсин размером 33 кДа, вырабатываемый 90% штаммов S. aureus и, как считается, является основным фактором вирулентности. Он секретируется как мономер и связывается со специфичным рецептором ADAM-10 на мембранах клеток-мишеней (Wilke and Bubeck Wardenburg, PNAS 107(30):13473-8 (2010); Inoshima et al., Nat Med 17(10):1310-4 (2011). AT олигомеризуется в гептамерную препору и претерпевает конформационное изменение, которое приводит в результате к образованию трансмембранного β-цилиндра и последующему лизису клетки (Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991; Song et al., 1996). Тромбоциты, а также эпителиальные, эндотелиальные и иммунные клетки (например, лимфоциты и макрофаги) подвержены AT-лизису, что позволяет предположить, что повреждение ткани и ускользание от иммунологического надзора обусловлены непосредственным влиянием токсина (Bhakdi and Tranum-Jensen, Microbiol Rev. 55(4):733-51 (1991); Ragle and Bubeck Wardenburg, Infect Immun. 77(7):2712-8 (2009); Tkaczyk et al., Clin Vaccine Immunol 19(3):377-85 (2012)). В сублитических концентрациях AT, как также было показано, оказывает значительные цитотоксические эффекты (Grimminger et al., J Immunol. 159(4):1909-16 (1997); Wilke and Bubeck Wardenburg, PNAS 107(30):13473-8 (2010); Inoshima et al., Nat Med 17(10):1310-4 (2011)). Связывание и олигомеризация AT на мембранах макрофагов активирует инфламмасому NLRP3, которая наряду с другими стафилококковыми патогенассоциированными молекулярными паттернами (PAMP) индуцирует секрецию IL-1β и вызывает гибель клетки (Craven et al., PLoS One 4(10) (2009); Kebaier et al., J Infect Dis 205(5):807-17 (2012). Повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов (например, IL-1β) является отличительным признаком острого повреждения легких (Goodman et al., Cytokine Growth Factor Rev. 14(6):523-35 (2003)).

В сублитических концентрациях AT также активирует ADAM-10-опосредованный протеолиз E-кадгерина, присутствующего в адгезионных межклеточных контактах, что приводит к нарушению целостности эпителия и способствует повреждению эпителия, которое наблюдается при пневмонии и инфекциях кожи и мягких тканей (Inoshima et al., Nat Med 17(10):1310-4 (2011); Maretzky et al., PNAS 102(26):9182-7 (2005); Inoshima et al., J Invest Dermatol. 132(5):1513-6 (2012). AT оказывает свои цитотоксические эффекты посредством прямой и опосредованной активности с созданием благоприятных условий для бактериального роста и инвазивного заболевания. Вследствие этого целенаправленное ингибирование AT может предупреждать или ограничивать развитие заболевания, ассоциированного с S. aureus. Эту гипотезу подтверждают другие исследования, в которых продемонстрировано уменьшение тяжести заболевания, вызываемого S. aureus, в мышиных моделях инфекции после активной или пассивной иммунизации, направленной против AT (Menzies and Kernodle, Infect Immun 64(5):1839-41(1996); Bubeck Wardenburg et al., J Exp Med. 205(2):287-94 (2008); Ragle and Bubeck Wardenburg, Infect Immun. 77(7):2712-8 (2009); Kennedy et al., J Infect Dis. 202(7):1050-8 (2010); Tkaczyk et al., Clin Vaccine Immunol 19(3):377-85 (2012)).

Антитело к АТ, содержащее вариант Fc-участка, и его исходное антитело LC10 представляют собой человеческие высокоаффинные mAb к АТ (ранее раскрытые в предварительной заявке на патент США № 61/440581 и в международной заявке № PCT/US 2012/024201 (опубликованной под номером WO 2012/109205), содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки, и в Tkaczyk et al., Clinical and Vaccine Immunology, 19(3): 377 (2012).

Бактериемия и септический шок составляют большую часть инвазивных заболеваний, вызываемых Staphylococcus aureus (Klevens, et al., JAMA, 298(15): 1763-71 (2007). Предполагается, что AT является важным фактором вирулентности при сепсисе, вызываемом S. aureus, и обуславливает повреждение эндотелия при сепсисе (Powers, et al., J. Infect Dis. 206(3):352-6 (2012). Взаимодействие AT с его рецептором на эндотелиальных клетках делает возможным опосредование токсином повреждения сосудов путем прямого лизиса клеток или активации ADAM-10-опосредованного протеолиза плотных соединений эндотелиальных клеток (там же). Оба механизма будут повышать проницаемость сосудов, что является отличительным признаком бактериального сепсиса.

Хотя пассивная иммунизация моноклональными антителами к АТ, как было показано, приводит в результате к значительному повышению выживаемости в мышиной модели стафилококковой пневмонии, как описано в предварительной заявке на патент США № 61/440581 и в международной заявке № PCT/US 2012/024201, неизвестно, являются ли антитела к АТ эффективными для повышения выживаемости у млекопитающих с ослабленным иммунитетом, имеющих заболевания, ассоциированные с S. aureus. Уяснение данного вопроса является весьма важным, так как у индивидов с ослабленным иммунитетом, в частности у индивидов, страдающих нейтропенией, имеется повышенный риск инфекций, вызываемых S. aureus (Andrews and Sullivan, Clin Microbiol Rev. 16(4):597-621 (2003); Bouma et al., Br J Haematol. 151(4):312-26 (2010)).

В настоящем изобретении впервые представлена демонстрация того, что антитела к АТ являются эффективными в профилактике сепсиса и пневмонии у индивидов с ослабленным иммунитетом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе представлены способы предупреждения или уменьшения тяжести сепсиса, ассоциированного с S. aureus, у субъекта-млекопитающего, включающие введение субъекту эффективного количества выделенного антитела к альфа-токсину S. aureus (антитела к АТ) или его антигенсвязывающего фрагмента. Также представлены способы уменьшения бактериальной нагрузки S. aureus в кровотоке или сердце субъекта-млекопитающего, включающие введение субъекту эффективного количества выделенного антитела к альфа-токсину S. aureus (антитела к АТ) или его антигенсвязывающего фрагмента. Также представлены способы уменьшения агглютинации бактерий S. aureus и/или формирования очагов тромбоэмболического поражения у субъекта-млекопитающего, включающие введение субъекту эффективного количества выделенного антитела к альфа-токсину S. aureus (антитела к АТ) или его антигенсвязывающего фрагмента. Также представлены способы предупреждения или уменьшения тяжести пневмонии, ассоциированной с S. aureus, у субъекта-млекопитающего с ослабленным иммунитетом, включающие введение субъекту эффективного количества выделенного антитела к альфа-токсину S. aureus (антитела к АТ) или его антигенсвязывающего фрагмента.

В различных способах, описанных в данном документе, бактериальная нагрузка S. aureus в кровотоке или сердце субъекта надлежащим образом уменьшается, а в дополнительных вариантах осуществления у субъекта уменьшаются агглютинация бактерий S. aureus и/или формирование очагов тромбоэмболического поражения.

В подходящем случае субъектом-млекопитающим в различных способах, описанных в данном документе, является человек.

В различных способах выделенное антитело к АТ или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из Fv, Fab, Fab' и F(ab')2. В других вариантах осуществления антитело является антителом полной длины. В еще нескольких дополнительных вариантах осуществления антитело содержит вариант Fc-участка.

В вариантах осуществления различных способов, описанных в данном документе, выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с полипептидным альфа-токсином Staphylococcus aureus и содержат

(a) CDR1 VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 10, 13 или 69;

(b) CDR2 VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 или 75;

(c) CDR3 VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 или 78;

(d) CDR1 VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 4;

(e) CDR2 VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 5, 73 или 77; и

(f) CDR3 VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 или 74.

В вариантах осуществления CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL для применения в различных способах, описанных в данном документе, соответствуют аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2 и 3; SEQ ID NO: 10, 11, 12, 1, 2 и 3; SEQ ID NO: 13, 14, 15, 4, 5 и 6; SEQ ID NO: 7, 17, 18, 1, 2 и 3; SEQ ID NO: 7, 8, 16, 1, 2 и 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1, 2 и 64; SEQ ID NO: 7, 8, 66, 1, 2 и 64; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 и 68; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 и 64; SEQ ID NO: 7, 8, 78, 1, 2 и 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1, 2 и 68; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 и 68; SEQ ID NO: 7, 8, 72, 1, 73 и 74; SEQ ID NO: 69, 75, 71, 1, 2 и 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 2 и 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 77 и 74; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 77 и 74.

В дополнительных вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 или 62, и (iii) содержит вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 или 63. В подходящем случае выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID NO 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 или 62 и вариабельный домен легкой цепи с SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 или 63.

В дополнительных вариантах осуществления различных способов, описанных в данном документе, VH и VL соответствуют аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 20 и 19; SEQ ID NO: 22 и 21; SEQ ID NO: 24 и 23; SEQ ID NO: 26 и 25; SEQ ID NO: 28 и 27; SEQ ID NO: 41 и 42; SEQ ID NO: 43 и 44; SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 49 и 50; SEQ ID NO: 51 и 52; SEQ ID NO: 51 и 52; SEQ ID NO: 53 и 54; SEQ ID NO: 55 и 56; SEQ ID NO: 57 и 58; SEQ ID NO: 59 и 60; SEQ ID NO: 61 и 58; SEQ ID NO: 62 и 58; SEQ ID NO: 62 и 63; SEQ ID NO: 79 и 63.

В еще нескольких дополнительных вариантах осуществления различных способов выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают в себя антитело к АТ, содержащее вариант Fc-домена, где антитело включает в себя VH-IgG1-YTE, соответствующий SEQ ID NO: 80, и/или VL-каппа, соответствующий SEQ ID NO: 81.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1. Профилактика с помощью LC10 улучшает выживаемость в модели IV-заражения смертельной дозой. Мышей (по 10 в каждой группе) подвергали пассивной иммунизации с помощью LC10 (45 и 15 мг/кг) или изотипического контроля (R347, 45 мг/кг) за 24 часа до IV контрольного заражения с помощью SF8300 (3×10⁸ CFU). Выживаемость отслеживали в течение 14 дней. Данные являются репрезентативными для 4 независимых экспериментов. Статистическую значимость оценивали с помощью логарифмического рангового критерия (Мантеля-Кокса): *p-значение = 0,0005; **p-значение = 0,0043).

Фигура 2. Профилактика с помощью LC10 уменьшает бактериальную нагрузку в сердце. Мышей подвергали пассивной иммунизации с помощью LC10 (45 и 15 мг/кг) или изотипического контроля (R347, 45 мг/кг) за 24 часа до IV контрольного заражения с помощью SF8300 (2,98e8 CFU). Через четырнадцать часов после инфицирования сердца инфицированных животных собирали и обрабатывали для подсчета CFU. Статистический анализ проводили с применением непарного двустороннего t-критерия Стьюдента: *p-значение = 0,0028; **p-значение = 0,0082).

Фигура 3. Профилактика с помощью LC10 уменьшает интенсивность стафилококковой бактериемии. Мышей подвергали пассивной иммунизации с помощью LC10 (45 и 15 мг/кг) или изотипического контроля (R347, 45 мг/кг) за 24 часа до IV контрольного заражения с помощью SF8300 (3×10⁸ CFU). В разные моменты времени после инфицирования кровь собирали посредством пункции сердца и высевали на чашки для подсчета CFU. Статистический анализ проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Данные считались статистически отличными от таковых для R347, если *p-значение <0,05.

Фигура 4. Подсчет общего числа лейкоцитов и дифференциальный подсчет лейкоцитов. Мышам C57BL6/J вводили 6 разных доз CPM (мг/кг) в день 0 и день 3. Брали образы крови в каждый момент времени от 5 мышей из каждой группы в дни 0, 1, 4 и 6. Анализ с подсчетом общего числа лейкоцитов и дифференциальным подсчетом лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов) проводили при помощи автоматического гематологического анализатора Sysmex.

Фигура 5. Титрование дозы бактерий. Осуществляли контрольное IN-заражение пяти мышей с ослабленным иммунитетом с помощью 50 мкл суспензии бактерий в фазе логарифмического роста (доза в диапазоне от 1×10⁷ до 2×10⁸ CFU) через 24 часа после второй дозы CPM (день 4). Выживаемость животных отслеживали в течение периода 7 дней.

Фигура 6. LC10 повышает выживаемость у животных с ослабленным иммунитетом. Животным, которым инъецировали CPM, вводили LC10 (45 или 15 мг/кг) или R347 (45 мг/кг) за 24 часа до IN-инфицирования с помощью 50 мкл суспензии бактерий SF8300 (5×10⁷ CFU). Выживаемость животных отслеживали в течение 5 дней. Статистическую значимость определяли с помощью логарифмического рангового критерия, и * означает статистически значимое различие по сравнению с животными, обработанными с помощью R347 (p<0,0001).

Фигура 7. Подсчет общего числа лейкоцитов и дифференциальный подсчет лейкоцитов. Мышам C57BL/6 давали 2 дозы CPM (150 мг/кг и 100 мг/кг) в дни -4 и -1 соответственно. Образцы крови от 5 мышей собирали в дни -4, -3, -1, 0, 2 и 3. Результаты подсчета общего числа лейкоцитов и дифференциального подсчета лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов) определяли при помощи автоматического гематологического анализатора Sysmex.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Выражения «полипептид», «пептид», «белок» и «белковый фрагмент» используются взаимозаменяемо в данном документе по отношению к полимеру из аминокислотных остатков. Выражения применимы к полимерам на основе аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к полимерам на основе встречающихся в природе аминокислот и к полимерам на основе не встречающихся в природе аминокислот.

Выражение «аминокислота» относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые выполняют функцию, аналогичную таковой у встречающихся в природе аминокислот.

Как используется в данном документе, «рекомбинантный» предполагает обозначение белка, полученного с помощью клеток, которые в своем природном состоянии не содержат эндогенную копию ДНК, способную к экспрессии белка. Клетки вырабатывают рекомбинантный белок по той причине, что они были генетически изменены путем введения соответствующей выделенной последовательности нуклеиновой кислоты.

Как используется в данном документе, «антитело» и «иммуноглобулин» применяются взаимозаменяемо в наиболее широком смысле и включают моноклональные антитела (например, моноклональные антитела полной длины или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность) и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с массой приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, при этом среди тяжелых цепей разных изотипов иммуноглобулина количество дисульфидных связей различается. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет расположенные с равными интервалами дисульфидные мостики между цепями. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым расположен ряд константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на своем другом конце. Выражения «константный» и «вариабельный» применяют в функциональном значении.

Константный домен легкой цепи расположен на одном уровне с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи расположен на одном уровне с вариабельным доменом тяжелой цепи. Определенные аминокислотные остатки, как полагают, образуют зону контакта между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепи (Clothia, et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)). Выделяют пять классов человеческих иммуноглобулинов на основании строения их тяжелых цепей, и они называются IgG, IgM, IgA, IgE и IgD. Классы антител IgG и IgA дополнительно делят на подклассы, а именно IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, а также IgA1 и IgA2. Тяжелые цепи в антителах IgG, IgA и IgD содержат три домена константного участка, которые обозначают CH1, CH2 и CH3, а тяжелые цепи в антителах IgM и IgE содержат четыре домена константного участка - CH1, CH2, CH3 и CH4. Таким образом, тяжелые цепи содержат один вариабельный участок и три или четыре константных участка. Структура и функция иммуноглобулинов рассматриваются, например, в Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).

Обозначения «V_H» или «VH» относятся к вариабельному участку тяжелой цепи иммуноглобулина, в том числе Fv, scFv, dsFv или Fab.

Обозначения «V_L» или «VL» относятся к вариабельному участку легкой цепи иммуноглобулина, в том числе Fv, scFv, dsFv или Fab.

Выражение «антигенсвязывающий фрагмент» относится к части интактного антитела и относится к вариабельным участкам интактного антитела, определяющим антигены. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают, без ограничения, Fab, Fab', F(ab')2, Fv и одноцепочечные Fv-фрагменты, линейные антитела, одноцепочечные антитела и полиспецифические антитела, образованные из антигенсвязывающих фрагментов.

Выражения «одноцепочечный Fv» или «scFv» относятся к антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи обычного двухцепочечного антитела были соединены с образованием одной цепи. Выражения включают связывающие молекулы, которые состоят из одного вариабельного домена легкой цепи (V_L) или его части и одного вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) или его части, где каждый вариабельный домен (или его часть) получен из одинаковых или различных антител. Молекулы scFv, как правило, содержат линкер scFv, расположенный между V_H-доменом и V_L-доменом. Молекулы scFv известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США № 5892019, Ho, et al., Gene 77:51-59 (1989); Bird, et al., Science 242:423-426 (1988); Pantoliano, et al., Biochemistry 30:10117-10125 (1991); Milenic, et al., Cancer Research 51:6363-6371 (1991); Takkinen, et al., Protein Engineering 4:837-841 (1991), все из которых настоящим включены посредством ссылки во всей своей полноте.

АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ФРАГМЕНТЫ И АНТИТЕЛА К АЛЬФА-ТОКСИНУ S. AUREUS

Антитело к альфа-токсину S. aureus (также называемое антителом к AT S. aureus или антителом к АТ) или его антигенсвязывающий фрагмент, как применяется в данном документе, иммуноспецифически связывается с одним или несколькими эпитопами, специфичными для белка, пептида, субъединицы, фрагмента, части, олигомеров альфа-токсина или любой их комбинации, и обычно не связывается специфически с другими полипептидами. Выражение «олигомеры» или «олигомеры альфа-токсина» относятся к ассоциации мономеров альфа-токсина (например, из 2 мономеров, 3 мономеров, 4 мономеров, 5 мономеров, 6 мономеров или 7 мономеров), образующей функциональную пору (например, из 7 мономеров альфа-токсина). Эпитоп может содержать по меньшей мере один антителосвязывающий участок, который содержит по меньшей мере одну часть белкового альфа-токсина. Выражение «эпитоп», как используется в данном документе, относится к детерминанте белка, способной связываться с антителом. Эпитопы обычно включают химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты и/или боковые цепи из сахаров, и обычно характеризуются конкретными характеристиками трехмерной структуры, так же как и конкретными химическими характеристиками (например, зарядом, полярностью, основностью, кислотностью, гидрофобностью и т. п.). Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. В некоторых вариантах осуществления распознавание эпитопа препятствует образованию активного гептамера (например, ингибирует олигомеризацию мономеров альфа-токсина в активный гептамерный комплекс).

В определенных вариантах осуществления эпитоп состоит из по меньшей мере части белкового альфа-токсина, который вовлечен в образование гептамерного комплекса гептамера альфа-токсина. Определенный эпитоп может содержать любую комбинацию из от по меньшей мере одной аминокислотной последовательности длиной по меньшей мере 3 аминокислотных остатка до полной определенной части из смежных аминокислот белкового альфа-токсина. В некоторых вариантах осуществления эпитоп состоит из от по меньшей мере 4 аминокислотных остатков, по меньшей мере 5 аминокислотных остатков, по меньшей мере 6 аминокислотных остатков, по меньшей мере 7 аминокислотных остатков, по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, по меньшей мере 9 аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, по меньшей мере 11 аминокислотных остатков, по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, по меньшей мере 13 аминокислотных остатков, по меньшей мере 14 аминокислотных остатков или по меньшей мере 15 аминокислотных остатков до полной определенной части из смежных аминокислот белкового альфа-токсина. В некоторых других вариантах осуществления эпитоп содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 смежных или несмежных аминокислотных остатков. В дополнительных вариантах осуществления аминокислотные остатки, содержащиеся в эпитопе, вовлечены в образование гептамерного комплекса альфа-токсина.

Таким образом, в конкретных вариантах осуществления выделенные/очищенные антигенсвязывающие фрагменты и антитела к альфа-токсину иммуноспецифически связываются с молекулой, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 39, и/или с молекулой, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 40. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты и антитела к альфа-токсину также связываются с гомологами или ортологами альфа-токсина из различных видов или с вариантами аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, где гистидин в положении 35 замещен лейцином или замещен другими аминокислотами, соответствующими мутациям H35, известным специалисту в данной области.

Вариабельные участки

В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент или антитело к альфа-токсину получают из исходного антитела. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент или антитело к альфа-токсину содержатся в исходном антителе. Как используется в данном документе, выражение «исходное антитело» относится к антителу, которое кодируется аминокислотной последовательностью, применяемой для получения варианта или производного, определенных в данном документе. Исходный полипептид может содержать нативную последовательность антитела (т. е. встречающуюся в природе, в том числе встречающийся в природе аллельный вариант) или последовательность антитела с ранее существовавшими модификациями аминокислотной последовательности (такими как другие вставки, делеции и/или замены) во встречающейся в природе последовательности. Исходное антитело может быть гуманизированным антителом или человеческим антителом. В конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты и антитела к альфа-токсину являются вариантами исходного антитела. Как используется в данном документе, выражение «вариант» относится к антигенсвязывающему фрагменту или антителу к альфа-токсину, которые отличаются по аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности «исходного» антигенсвязывающего фрагмента или антитела к альфа-токсину вследствие добавления, делеции и/или замены одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности исходного антитела.

Антигенсвязывающая часть антитела содержит один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном (например, альфа-токсином). Было показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут выполнять фрагменты антитела полной длины (т. е. антигенсвязывающие фрагменты). Примеры «антигенсвязывающих фрагментов», охватываемые выражением «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирном участке; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент, который состоит из VH-домена; и (vi) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR). Хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, часто кодируются отдельными генами, их можно соединить с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который обеспечивает возможность получения из них одной белковой цепи, в которой VL- и VH-участки спариваются с образованием моновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Fv (scFv)). Такие одноцепочечные антитела также охватываются выражениями «антитело» и «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Эти антигенсвязывающие фрагменты можно получить с использованием известных методик, а фрагменты можно подвергнуть скринингу в отношении связывающей активности таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие фрагменты можно получить с помощью методик рекомбинантных ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов.

Антигенсвязывающие фрагменты и антитела к альфа-токсину по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент или антитело к альфа-токсину содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 или 62. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент или антитело к альфа-токсину содержат VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 или 63. В еще одном варианте осуществления антигенсвязывающий фрагмент или антитело к альфа-токсину содержат VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 или 62, и VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 или 63. См. таблицу 7 для получения представления о последовательностях VH и VL, представленных в данном документе, которые могут присутствовать в любой комбинации для образования антигенсвязывающего фрагмента или антитела к альфа-токсину или могут присутствовать в комбинации для образования mAb по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления VH выбран из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 или 62. В различных вариантах осуществления VL выбран из SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 или 63. Некоторые нуклеотидные последовательности VH и VL представлены в таблице 8.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH и VL, где VH и VL имеют аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID NO: 20 и 19; SEQ ID NO: 22 и 21; SEQ ID NO: 24 и 23; SEQ ID NO: 26 и 25; SEQ ID NO: 28 и 27; SEQ ID NO: 41 и 42; SEQ ID NO: 43 и 44; SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 49 и 50; SEQ ID NO: 51 и 52; SEQ ID NO: 51 и 52; SEQ ID NO: 53 и 54; SEQ ID NO: 55 и 56; SEQ ID NO: 57 и 58; SEQ ID NO: 59 и 60; SEQ ID NO: 61 и 58; SEQ ID NO: 62 и 58; SEQ ID NO: 62 и 63; SEQ ID NO: 79 и 63.

В таблицах 1-7 представлены вариабельные участки тяжелой цепи (VH), вариабельные участки легкой цепи (VL) и участки, определяющие комплементарность (CDR), для определенных вариантов осуществления антител и антигенсвязывающих фрагментов, представленных в данном документе. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты и антитела к альфа-токсину содержат VH и/или VL с определенным процентом идентичности по отношению по меньшей мере к одной из последовательностей VH и/или VL, раскрытых в таблице 7. Как используется в данном документе, выражение «процент (%) идентичности последовательности», также включающее «гомологию», определено как процентная доля аминокислотных остатков или нуклеотидов в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам или нуклеотидам в эталонных последовательностях, таких как последовательность исходного антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не учитывает какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно получить, помимо ручного способа, с помощью алгоритмов поиска локальной гомологии, известных в данной области техники, или с помощью компьютерных программ, в которых применяются эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин).

В конкретных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с альфа-токсином и содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 или 62, и содержат вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 или 63, где антитело обладает активностью ингибирования связывания одного или нескольких мономеров альфа-токсина друг с другом (например, ингибирует олигомеризацию).

Участки, определяющие комплементарность

Несмотря на то, что вариабельный домен (VH и VL) содержит антигенсвязывающий участок, вариабельность распределяется по вариабельным доменам антител неравномерно. Она сосредоточена в сегментах, называемых участками, определяющими комплементарность (CDR), в вариабельных доменах как легкой цепи (VL или VK), так и тяжелой цепи (VH). Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными участками (FR). Каждый из вариабельных доменов нативной тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, по большей части принимающих конфигурацию β-листа, соединенных тремя CDR, которые образуют петли, объединяющие структуру бета-листа и в некоторых случаях образующие ее часть. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг с другом с помощью FR и вместе с CDR из другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего центра антител (см. Kabat et al., выше). Три CDR тяжелой цепи обозначают VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, а три CDR легкой цепи обозначают VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3. В данном документе используется система нумерации по Kabat. Соответственно VH-CDR1 начинается примерно с аминокислоты 31 (т. е. примерно через 9 остатков от первого цистеинового остатка) содержит примерно 5-7 аминокислот и заканчивается на следующем сериновом остатке. VH-CDR2 начинается с пятнадцатого остатка от конца CDR-H1, содержит примерно 16-19 аминокислот и заканчивается на следующем глициновом остатке. VH-CDR3 начинается примерно с тридцатого аминокислотного остатка от конца VH-CDR2, содержит примерно 13-15 аминокислот и заканчивается на последовательности M-D-V. VL-CDR1 начинается примерно с остатка 24 (т. е. после цистеинового остатка), включает примерно 10-15 остатков и заканчивается последовательностью Y-V-S. VL-CDR2 начинается примерно с шестнадцатого остатка от конца VL-CDR1 и включает примерно 7 остатков. VL-CDR3 начинается примерно с тридцать третьего остатка от конца VH-CDR2, содержит примерно 7-11 остатков и заканчивается на последовательности T-I-L. Следует отметить, что CDR среди разных антител значительно различаются (и по определению не будут проявлять гомологию с консенсусными последовательностями по Kabat).

Антигенсвязывающие фрагменты и антитела к альфа-токсину по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один антигенсвязывающий домен, который содержит по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR1, CDR2 или CDR3). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент или антитело к альфа-токсину содержит VH, который содержит по меньшей мере один CDR VH (например, CDR-H1, CDR-H2 или CDR-H3). В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент или антитело к альфа-токсину содержит VL, который содержит по меньшей мере один CDR VL (например, CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3).

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с полипептидным альфа-токсином Staphylococcus aureus, содержат (a) CDR1 VH, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 7, 10, 13 или 69 или содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков по сравнению с таковой; (b) CDR2 VH, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 или 75 или содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков по сравнению с таковой; и (c) CDR3 VH, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 или 78 или содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков по сравнению с таковой.

В конкретных вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, содержащие аминокислотные последовательности, идентичные SEQ ID NO: 7, 8 и 9; SEQ ID NO: 10, 11 и 12; SEQ ID NO: 13, 14 и 15; SEQ ID NO: 7, 17 и 18; SEQ ID NO: 7, 8 и 16; SEQ ID NO: 7, 8 и 65; SEQ ID NO: 7, 8 и 66; SEQ ID NO: 7, 8 и 67; SEQ ID NO: 7, 8 и 78; SEQ ID NO: 69, 70 и 71; SEQ ID NO: 7, 8 и 72; SEQ ID NO: 69, 75 и 71; SEQ ID NO: 69, 75 и 76 или SEQ ID NO: 69, 70 и 71 или содержащие 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков в каждом CDR по сравнению с таковыми.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с полипептидным альфа-токсином Staphylococcus aureus, содержат (a) CDR1 VL, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1 или 4 или содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков по сравнению с таковой; (b) CDR2 VL, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 2, 5, 73 или 77 или содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков по сравнению с таковой; и (c) CDR3 VL, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 или 74 или содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков по сравнению с таковой.

В конкретных вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, содержащие аминокислотные последовательности, идентичные SEQ ID NO: 1, 2 и 3; SEQ ID NO: 4, 5 и 6; SEQ ID NO: 1, 2 и 64; SEQ ID NO: 1, 2 и 68; SEQ ID NO: 1, 73 и 74 или SEQ ID NO: 1, 77 и 74 или содержащие 1, 2 или 3 замены аминокислотных остатков в каждом CDR по сравнению с таковыми.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с полипептидным альфа-токсином Staph