Способ получения препарата эубиотика лактобактерин

Способ получения препарата эубиотика лактобактерин

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биологически активных препаратов из микробов-антагонистов.

Существуют препараты на основе микробов-антагонистов, объединенных под общим названием эубиотики. Это широко известные и применяемые препараты - колибактерин, лактобактерин, бификол, бифидумбактерин и др. В настоящее время получают признание комплексные - поликомпонентные биопрепараты, включающие как несколько видов микроорганизмов, так и различные вещества с защитным или стимулирующим свойствами (Иммунобиологические препараты. Сб. науч. трудов. Московский НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. – Москва. - 1989 г.). Все эти препараты выпускают лиофильно высушенными, что продлевает их срок хранения и улучшает возможность доставки потребителю (Громова О.А. Антибиотики и эубиотики / Под ред. С.А. Лебедевой. - Иваново, 1991 г.).

Однако в настоящее время известно, что часть лиофильно высушенной культуры лактобактерий из состава препарата Лактобактерин гибнет, не обладая возможностью восстановить свои способности к активным репаративным процессам. Перевод этой части популяции бактериальных клеток к пролиферации способен усилить действие препарата и уменьшить риск потери жизнеспособности входящих в его состав бактериальных клеток. Увеличение количества жизнеспособных клеток в составе препарата будет способствовать успешному преодолению естественных барьеров теплокровного организма (желудочный сок, желчь, ферменты пищеварительного сока), которые также могут негативно воздействовать на степень активности препарата. Поэтому и создаются комплексные бактерийные препараты, способствующие повышению количества активного действующего начала препарата-эубиотика (Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. - М.: Медицина, 1984 г.).

Существует стандартная методика получения препаратов эубиотиков: клетки выращивают в достаточном объеме (не менее 10 /мл), отделяют от жидкой среды центрифугированием, затем суспендируют осадок в стерильном криопротекторе (20% снятое молоко или 24% раствор сахарозы, 10% декстран и т.д.). Суспензию бактерий наливают в ампулы. Ампулы замораживают в течение часа при температуре t=-60÷-65°С, затем высушивают в вакууме 2-3⋅10^-2 мм рт.ст. в течение 18 часов. По окончании высушивания ампулы запаивают (Методы общей бактериологии. Т. 1 / Под ред. Ф. Герхардта. - М.: Мир, 1983 г.). Известны способы получения комплексных бактерийных препаратов. Так, предложен способ получения эубиотика - биоспорина - заявка №96123690/13 от 18.12.96 6 А61К 35/74. Поберий И.А., Харченко А.Т., Кузнецов В.В., Филин В.А., Доронин А.Н., Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., где авторы предлагают получать глубинные нативные или концентрированные культуры эубиотиков (Bacillus subtilis и B.licheniformis), стабилизировать культуру сухим обезжиренным молоком, сахарозо-желатиновой защитной средой с последующей лиофилизацией в ампулах. Предложены также способы соединения микроорганизма с основой (патент №2017486 Григорьев А.В. 1994 г. (5 А61К 31/00) Способ получения комплексного бактерийного препарата), где в качестве основы предлагается использовать активированный уголь в виде порошка с размером частиц 30 мкм или использовать лактозу в качестве стимулятора (патент на изобретение №2123343, БИ N 16, ч. 1, с. 34 Алин Б.И., Красильникова О.Б., Ворончихин А.А., Ким Г.Б., Чупринина Р.П., 1998 г.).

Наиболее близким к заявляемому способу, выбранным в качестве прототипа, является способ получения лактобактерина (патент №2200566, опубликовано 20.03.2003, Бюл. №8. Несчисляев В.А., Фадеева И.В. Способ получения лактобактерина). Данный способ предусматривает следующие этапы в технологии получения препарата Лактобактерин:

1. Накопление бактериальной биомассы Lactobacillus acidophilus сахарозо-желатиновой среде.

2. Добавка обезжиренного молока как дополнительного компонента защитной среды в состав бактериальной суспензии перед высушиванием с последующей расфасовкой в стерильные ампулы.

3. Лиофильная сушка.

Однако препарат, получаемый при использовании данной технологии, отличается довольно низкой биологической активностью, что выражается в необходимости оптимизации способа получения препарата и повышение его биологической активности путем дополнительного введения лактобактерий вида L.acidophilus. Поэтому мы предлагаем способ получения активного препарата Лактобактерин, где в качестве стимулятора выступают фармакологические формы высшего съедобного гриба шиитаке (Lentinus edodes), а именно натуральный сок, порошок.

Шиитаке - высший съедобный гриб, относящийся к классу Basidiomycetes, культивируется в мире в промышленных масштабах (Псурцева Н.В., Белова Н.В. Биотехнология, 1994. - N 7. - с. 35-39). Данный гриб используется в качестве основы лекарственных препаратов, обладающих карциностатическим, противоэкзэматозным действием (патент Японии (IP) №60-23392). Известно противоопухолевое действие препаратов мицелия и питательной среды, в которой выращивали мицелий гриба (ЕПВ Европейский патент №0088151). Кроме того, в медицине базидиальные грибы используются как продуценты антибиотических субстанций. Особо заслуживает внимания обнаруженный факт, что наблюдается вирицидная активность и в отношении ретровирусов (СПИД). Активные вещества высших базидиальных грибов представлены терпенойдами, пуринами, хинонами, пиримидинами, производными фенолов (Феофилова Е.П. Прикладная биохимия и микробиология, 1998, том 34, N 2. - с. 131-138).

Данные о биологически активных компонентах, содержащихся в грибах шиитаке, представлены в сборнике научных трудов "Окружающая среда и здоровье человека", Иваново, 1998 г. Биокомпоненты гриба шиитаке обнаруживают иммуномодулирующее действие (Immunopotentiating activity of the water-soluble lignin rich fraction prepared from LEM - the extract of the solid culture medium of Lentinus edodes mycelia / Yamamoto Y., Shirono H., Kono K., Ohashi Y. // Biotechnol Biochem. - 1997. - Vol. 61, N11. - P. 1909-1912; Wang GL, Lin ZB The immunomodulatory effect of lentinan // Yao Hsueh Hsueh Pao 1996. - N2, Vol. 31. - P. 86-90; An in vivo study of hepatic and splenic interleukin-1 beta mRNA expression following oral PSK or LEM administration / Morinaga H, Tazawa K, Tagoh H, Muraguchi A, Fujimaki M // Jpn J. Cancer Res. - 1994. - Vol. 85, N 12. - P. 1298-1303).

Выявлена иммуномодулирующая активность и у сока плодовых тел данного гриба (Сотникова Н.Ю., Куликова (Милькова) Е.В., Мартенова А.А., Кузнецов О.Ю. Влияние биокомпонентов гриба Lentinus edodes на иммунокомпетентные клетки in vitro у женщин с вагинальным кандидозом / Тезисы 3-й научной международной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 18-20 Мая 1999 г. - с. 137.).

Технический результат заключается в разработке способа получения препарата эубиотика Лактобактерин, содержащего L.acidophilus, с большим терапевтическим эффектом за счет увеличения количества жизнеспособных клеток и присутствия в его составе природных биологически активных компонентов, оказывающих положительное воздействие на различные системы и органы макроорганизма.

Сок получали путем механического измельчения плодовых тел гриба, из полученной биомассы выжимали сок, который подвергался стерилизации путем ультрафильтрации, например, с использованием каолиновых свечей Шамберлана с размером пор 0,12 мкм (Муравьев И.А. Технология лекарственных форм. М.: Медицина. - 1998 г.). Порошок гриба шиитаке получали путем высушивания свежих грибов при температуре 70°С до влажности 10-12% и размалывали до размера частиц 0,2-1,0 мм, а затем стерилизовали вместе с питательной средой лактобакагар (производство ФГУН ГНЦПМиБ г. Оболенск) в автоклаве при температуре 121±1°С в течение 15 минут.

Основные этапы предлагаемого технологического процесса по заявляемому способу: выращивание биомассы L.acidophilus, получение концентрированной биомассы путем центрифугирования, декантация надосадочной жидкости; в биомассу добавляют сахарозо-желатозо-молочную защитную среду и стимулятор роста лактобактерий - фармакологические формы высшего съедобного гриба шиитаке (Lentinus edodes), а именно стерильный натуральный сок или порошок в объеме 2,5% от объема защитной среды, расфасовка в ампулы; лиофильная сушка препарата, его маркировка.

Была проведена сравнительная оценка колониеобразующей способности лактобактерий из состава препарата Лактобактерин при посеве на питательную среду - лактобакагар и среду лактобакагар с добавлением стерильного сока или порошка высшего съедобного гриба шиитаке. Для этого биомассу лактобактерий из препарата Лактобактерин высевали на питательную среду из разведения препарата на физиологическом растворе 10³. В опыте в препарат вносили стерильный сок или порошок гриба в объеме 2,5% от объема среды; в качестве контроля использовались разведения препарата без внесения стимулятора (сок или порошок гриба шиитаке). Результаты представлены в таблице.

При внесении сока в среду в меньшей концентрации (менее 2,5% от объема защитной среды) стимулирующий эффект на лактобактерий был выражен незначительно. При увеличении концентрации более 2,5% стимулирующий эффект не изменялся, судя по количеству КОЕ/мл лактобактерий, поэтому считаем нецелесообразным увеличивать дозу стимулятора, так как эффект не изменяется, но увеличивается его расход. При внесении различных фармакологических форм гриба шиитаке достоверно (р<0,05) увеличивается число колониеобразующих единиц лактобактерий с 5,24±0,49 КОЕ* 10³/мл в контроле до 7,32±0,47 КОЕ*10³/мл с соком, а с порошком до 7,66±0,42 КОЕ* 10³/мл. Процент увеличения КОЕ*10³/мл L.acidophilus с добавлением сока по сравнению с контролем составляет 39,7%; порошок с контролем - 46,2%.

Оценивая полученные результаты, считаем, что предлагаемый способ получения активного препарата Лактобактерин значительно повысит терапевтическое действие препарата за счет повышения регенераторной способности лактобактерий после лиофилизации.

Способ получения препарата эубиотика Лактобактерин, включающий получение биомассы бактерий Lactobacillus acidophilus, добавление сахарозо-желатозо-молочной защитной среды, расфасовку в стерильные ампулы, лиофильную сушку, отличающийся тем, что в биомассу на стадии расфасовки в стерильные ампулы добавляют в качестве стимулятора роста лактобактерий фармакологические формы высшего съедобного гриба шиитаке (Lentinus edodes), а именно стерильный натуральный сок или порошок в объеме 2,5% от объема защитной среды.