Способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды

Способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области физики в целом и к области биологии, используется в области экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер.

Результативность природоохранных мер зависит от своевременного получения достоверных данных экологического мониторинга для оценки и диагностики, т.е. распознавания причин имеющегося на дату исследования экологического состояния окружающей среды.

Как известно, оценку экологического состояния окружающей среды выполняют различными способами, с использованием различных репрезентативных показателей среды, например - физических, химических, биологических, геологических.

Известно, что одним из высокоинформативных способов оценки экологической обстановки является способ биоиндикации, то есть выявление реакции живых организмов на изменение условий среды их обитания, например - загрязнение или очищение среды обитания.

Далее в тексте используется термин Согласно [ru.wikipedia.org/…/] - это живое тело, обладающее совокупностью свойств, отличающих его от неживой материи, в том числе обменом веществ, самоподдерживанием своего строения и организации, способностью воспроизводить их при размножении, сохраняя наследственные признаки.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Sladechek V. System of water quality from the biological point of view (Система оценки качества воды…) Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol, 1973. - P. 179-191] [1]. Краткой сущностью известного технического решения является заключение об экологическом состоянии окружающей среды, которое делают на основе изучения обитающих в исследуемой среде живых организмов (видов-индикаторов), определяемых визуально и путем вручную выполняемых манипуляций.

Недостатком известного технического решения является высокая трудоемкость и сложность определения видов-индикаторов с одновременным использованием оптических приборов, справочников-определителей, необходимость привлечения специалистов высокой квалификации.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий / под ред. С.Я. Цалолихина. - СПб.: Изд. «Наука», 1994. - 394 с.] [2]. Сущностью известного технического решения является способ идентификации вида-индикатора на основе выявления и анализа морфологических признаков индикаторного организма.

Недостатками известного способа являются существенная времязатратность осуществления идентификации вида-индикатора и зависимость результатов оценки по морфологическим признакам от квалификации и субъективности эксперта. Кроме того, известный способ обладает недостаточной разрешающей способностью и достоверностью результатов из-за существования видов-двойников, имеющих схожее внешнее строение и существующего в природе гетероморфного жизненного цикла некоторых живых организмов, то есть происходящего в течение жизни изменения внешнего вида определяемого организма.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс. http://www.polismed.com/articles-immunofermentnyjj-analiz-ifa-elisa-sut-princip-metoda-i-ehtapy-issledovanija.html] [3]. Сущностью известного технического решения является метод иммуноферментного анализа (ИФА), который используют для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций в растениях, животных, человеке и других материалах путем выявления свойственных этим возбудителям уникальных антигенов к маркерным белкам.

Недостатком известного технического решения является то, что известный метод не используют для оценки экологического состояния окружающей среды.

Наиболее близким к заявленному техническому решению по совпадающим признакам и назначению, выбранным заявителем в качестве прототипа, является изобретение по патенту RU №2451084 «Способ оценки экологического состояния водоемов» [4]. Сущностью прототипа является способ оценки экологического состояния водоемов, включающий отбор проб обитающих в водоеме планктонных организмов, определение уровня загрязнения окружающей среды путем их (планктонных организмов) анализа и оценку результатов анализа, характеризующийся тем, что определение уровня загрязнения осуществляют путем определения последовательностей любого консервативного и любого вариабельного генов планктонного организма из пробы с последующим молекулярным филогенетическим анализом для выявления эволюционных отношений исследуемого организма с сапробионтами, и оценку результатов выполняют следующим образом:

при высоком (более или равно 70%) значении бутстреп-поддержки кластера (полученного в результате филогенетического анализа консервативного гена), включающего исследуемый планктонный организм и устойчивые сапробионты, делают выводы:

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов ксено- или ксеноолигосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в благополучном экологическом состоянии и угроза негативного, в том числе антропогенного, воздействия отсутствует;

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов олиго- или олигомезосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в нестабильном (в переходном от благополучного к неблагополучному состоянию) экологическом состоянии, имеется несущественная негативная, в том числе антропогенная нагрузка, при этом природное сообщество обладает способностью или сохраняет способность к самовосстановлению и не нуждается в осуществлении дополнительных природоохранных мероприятий;

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов мезо- и/или мезополисапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в неблагополучном состоянии, испытывают существенную негативную, в том числе антропогенную нагрузку, при этом естественной способности природного сообщества к самовосстановлению недостаточно и исследуемая среда нуждается в осуществлении природоохранных мероприятий;

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов полисапробных водоемов делают вывод о наличии локальной экологической катастрофы и предпринимают безотлагательные восстановительные меры;

- при низком (менее 70%) значении бутстреп-поддержки кластера, полученного в результате молекулярного филогенетического анализа консервативного гена, выполняют молекулярный филогенетический анализ вариабельного гена и анализируют кластер, включающий исследуемый планктонный организм и устойчивые сапробионты, и делают выводы:

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов ксено- или ксеноолигосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в благополучном экологическом состоянии и угроза негативного, в том числе антропогенного, воздействия отсутствует;

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов олиго- или олигомезосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в нестабильном (в переходном от благополучного к неблагополучному состоянию) экологическом состоянии, имеется несущественная негативная, в том числе антропогенная нагрузка, при этом природное сообщество обладает способностью или сохраняет способность к самовосстановлению и не нуждается в осуществлении дополнительных природоохранных мероприятий;

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов мезо- и/или мезополисапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в неблагополучном состоянии, испытывают существенную негативную, в том числе антропогенную нагрузку, при этом естественной способности природного сообщества к самовосстановлению недостаточно и исследуемая среда нуждается в осуществлении природоохранных мероприятий.

- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов полисапробных водоемов делают вывод о наличии локальной экологической катастрофы и предпринимают безотлагательные восстановительные меры.

Недостатками прототипа являются:

- используемый видовой состав организмов в пробе определяют визуально (с использованием микроскопа), на основе выявления морфологических (внешних) признаков, вследствие чего результат определения вида существенно зависит от субъективных факторов, например - остроты зрения, цветоощущения, квалификации, опыта, эмоционального состояния, степени усталости исследователя - эксперта. Кроме того, визуальный метод (работа с микроскопом) определения видового состава организмов в пробе является весьма трудозатратным, времязатратным процессом, сопровождается усталостью органов зрения эксперта со снижением внимательности, отрицательно влияющей на качество результатов наблюдения. Результат определения видового состава организмов в пробе по прототипу в немалой степени зависит от индивидуальности эксперта, и, как следствие, является субъективным. Субъективность результатов определения видов организмов в пробе снижает достоверность оценки экологической обстановки, сопровождается неумышленными ошибками, что нередко приводит к необходимости повторной биоиндикации с дополнительной затратой времени, с привлечением высококвалифицированных специалистов - биологов, химиков, врачей, дорогостоящего оборудования и реактивов. Как следствие, происходит нерациональная затрата времени - с увеличением количества анализов, возрастанием времени для достоверной диагностики экологической обстановки и принятия правильного решения для проведения оздоровительных мероприятий. В итоге природоохранные мероприятия выполняются со значительным запаздыванием;

- необходимость исследования генов для каждого организма, взятого из пробы, что существенно повышает трудоемкость процесса. Увеличение объема работ сопровождается возрастанием вероятности случайных ошибок. Ошибки сказываются на точности и достоверности результатов оценки экологического состояния исследуемой окружающей среды;

- прототип применим для оценки экологического состояния окружающей среды только при наличии водоемов в оцениваемой среде, то есть прототип применим ограниченно.

Целью заявленного технического решения является повышение точности и достоверности результатов экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер посредством замены материалов локальных аналитических исследований с субъективными результатами оценки специалистов (людей) на результаты объективных инструментальных исследований, обеспечение возможности выполнения оценки экологического состояния окружающей среды менее квалифицированными специалистами, уменьшение трудоемкости работ, повышение производительности труда, сокращение сроков оценки уровня загрязнения и качества диагностики состояния окружающей среды - повышение качества факторов, в совокупности способствующих повышению результативности природоохранной деятельности и сохранению благоприятной среды обитания.

Техническим результатом заявленного технического решения является способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды путем замены материалов локальных аналитических исследований с субъективными результатами оценки специалистов (людей) на результаты объективных инструментальных исследований.

Цели и технический результат достигают способом применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды, включающий отбор из оцениваемой среды проб организмов с последующим анализом этих проб, характеризующимся тем, что при анализе идентификацию видового состава организмов из пробы осуществляют с применением маркерных белков живых организмов, обитающих в водной среде, а оценку экологического состояния окружающей среды производят в соответствии с идентифицированным видовым составом индикаторных организмов и их соотношением в пробе, то есть иммуноферментным анализом определяют количество маркерных белков каждого из индикаторных организмов в пробе, к которым получены антитела, суммируют количество маркерных белков, содержащихся в пробе индикаторных организмов, рассчитывают частоту встречаемости индикаторных организмов в пробе путем деления количества маркерного белка каждого организма на суммарное количество маркерных белков всех организмов в пробе, последующего суммирования произведений частоты встречаемости каждого индикаторного организма на его индикаторный вес и получают суммарный индикаторный вес (СИВ) организмов в пробе, по которому оценивают экологическое состояние окружающей среды; при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают слабозагрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают умеренно загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий.

Ниже заявителем приведены предварительные пояснения к Примерам конкретного осуществления заявленного технического решения.

Заявители ограничились Примерами с преимущественным использованием обитателей водной среды - планктона и зообентоса потому, что экологическое состояние находящегося на местности водоема безоговорочно, достоверно, в необходимом для восстановления нарушенного состояния окружающей среды объеме, отражает и характеризует экологическое состояние окружающей водоем неводной среды - прибрежной и примыкающей к ней почвы, растительности и обитателей почвы, окружающего воздуха и обитателей воздушной и наземно-воздушной среды. Характеризует потому, что водоем на местности является местом сбора атмосферных осадков (например - несущих информацию о воздушной среде дождей, снега, пыли, частиц воды в тумане), стоков талых и иных стекающих в водоем вод, опадающей листвы растений, смытых или сбитых насекомых - всех поступлений в водоем, несущих с собой (в водоем) влияющие на окружающую среду вещества. Все эти поступления (дождь, пыль, стоки, оседающий на водоем туман, талые воды и т.д.) из окружающей водоем среды сначала впитывают характеризующую отдельные составляющие окружающей среды информацию, например - в виде наличия (или отсутствия) неблагополучия среды. Затем, стекая, опадая, оседая в водоем, влияют на содержание водной среды и естественно - влияют на обитателей этой водной среды. По этой причине водоем является местом сбора и наиболее полной концентрации всей информации об окружающей водоем среде. А обитатели водоема, например - планктонные организмы, являются наиболее удобными модельными объектами исследования, оптимальным образом и полно характеризующими экологическое состояние окружающей среды. Руководствуясь этим бесспорным фактором, заявители ограничились количеством примеров и привели в качестве Примеров использование планктонных организмов - вездесущих обитателей водоемов.

Использование в качестве индикаторных организмов обитателей водной среды имеет информативное преимущество по сравнению с использованием обитателей других сред, которые отражают состояние только воздушной или только почвенной составляющей окружающей среды. Таким образом, использование индикаторных организмов - обитателей неводной среды менее информативно, а результаты оценки менее достоверны по сравнению с оценкой экологического состояния окружающей среды с использованием обитателей водоема. Например, использование муравьев позволяет оценить экологическое состояние преимущественно суши, использование пчел - преимущественно экологическое состояние суши и воздушной среды. Но использованием муравьев и пчел невозможно оценить экологическое состояние водной составляющей окружающей природной среды. Обитатели водной среды несут наиболее полную и достоверную информацию об экологическом состоянии окружающей среды. Поэтому заявитель ограничился Примерами с использованием индикаторных организмов из приоритетной водной среды. При использовании обитателей неводных сред, например - почв, водно-воздушной и наземно-воздушной, порядок действий аналогичен действиям, описанным в Примерах 1, 2, 3, 4, 5.

При отсутствии в регионе водоемов пробу составляют из организмов - обитателей этого региона, например, приспособившихся к самым суровым местным условиям постоянных обитателей пустынь - ящериц, змей, скорпионов, насекомых, растительности. Полное отсутствие индикаторных организмов для использования в качестве пробы на исследуемой местности, например - на вершинах гор высотой более 7 км, интерпретируют как полное отсутствие природных условий жизни на местности, не представляющее интерес как место обитания живых существ.

При этом применение иных, кроме обитателей водоема, видов индикаторных организмов - обитателей окружающей среды, например - почвенной, воздушно-водной, воздушно - наземной сред, как в отдельности, так и в любом их сочетании также позволяет оценивать экологическое состояние окружающей среды по заявленному техническому решению.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг 4.

На Фиг. 1 приведена Таблица 1, в которой показан суммарный индикаторный вес зоопланктонных организмов (СИВ) по белку CO1.

На Фиг. 2 приведена Таблица 2, в которой показан суммарный индикаторный вес зоопланктонных организмов (СИВ) из озера Малое Глубокое по белку CO1.

На Фиг. 3 приведена Таблица 3, в которой показан суммарный индикаторный вес зообентосных организмов (СИВ) по белку CO1.

На Фиг. 4 приведена Таблица 4, в которой показан суммарный индикаторный вес фитопланктонных организмов (СИВ) по белку rbcL.

Далее заявителем приведены примеры конкретного осуществления заявленного технического решения.

Пример 1 с использованием присутствующих в международной базе данных аминокислотных последовательностей маркерных белков CO1 зоопланктонных организмов.

1.1 Для оценки экологического состояния окружающей среды в исследуемом регионе из расположенного там (в регионе) водоема известным способом [Винберг Г.Г. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева // Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1982. - 33 с.] [5], например - с использованием марлевого сачка - вылавливают и отбирают пробу зоопланктонных организмов. Пробу размещают в центрифугируемой пробирке, например - емкостью 50 мл, подвергают центрифугированию (например, на центрифуге СМ-6МТ), планктон отделяют от воды и анализируют, как описано ниже.

Следует отметить, что количество и разнообразие попавших в пробу видов зоопланктонных организмов на достоверность результата не влияет. Полное отсутствие зоопланктонных организмов в пробе интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Этот случай в Примере 1 не рассматривают.

1.2 С применением маркерных белков определяют видовой состав зоопланктонных организмов в пробе, например - по фрагменту вариабельного митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1).

1.2.1 Создают выборку аминокислотных последовательностей вариабельного митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1) из международной базы данных, например - TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для индикаторных видов зоопланктонных организмов, например - из списка В. Сладечека [1].

Случай, когда аминокислотные последовательности маркерных белков индикаторных видов зоопланктонных организмов отсутствуют в международной базе данных, например - TrEMBL/SwissProt, рассмотрен в Примере 2.

1.2.2 Осуществляют множественное выравнивание, например - с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков, например - цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1) и идентифицируют вариабельные участки аминокислотных последовательностей маркерного белка каждого вида индикаторных организмов, например - для белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1) один участок, например - длиной 10-20 аминокислотных остатков (далее по тексту - а.о.), например - а.о. в позиции 30-45 (NVIMDEQIYNMMVTAP) для Dissotrocha macrostyla gi|557477094| (индикаторный вес = 1,0), а.о. в позиции 152-162 (MGNLRTFGMTG) для Macrocyclops albidus gi|490344166| (индикаторный вес = 2,0), а.о. в позиции 157-170 (VSYVLSLEYLTLFS) для Rotaria neptunia gi|109892318| (индикаторный вес = 3,8). Индикаторный вес определяют по Сладечеку [1].

1.2.3 Получают антитела, специфически распознающие вариабельные участки маркерного белка каждого вида из организмов в пробе, например - для белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее - CO1), например - для индикаторного организма Dissotrocha macrostyla (индикаторный вес = 1,0) - вариабельный участок NVIMDEQIYNMMVTAP, для Macrocyclops albidus (индикаторный вес = 2,0) - участок MGNLRTFGMTG, для Rotaria neptunia (индикаторный вес = 3,8) - участок VSYVLSLEYLTLFS. Для применения с удовлетворяющей практику достоверностью результатов оценки достаточно использование не менее трех индикаторных организмов, к маркерным белкам которых получают антитела - по одному организму, однозначно характеризующему зону сапробности водоема, например - олиго-, бетамезо-, поли- сапробный. К выбранному полипептидному участку маркерного белка CO1 зоопланктонного организма, например - NVIMDEQIYNMMVTAP для Dissotrocha macrostyla (олигосапробный), получают антитело по методике производителя антител, например - фирмы ООО Биалекса (Россия). Антитела получают с использованием стандартных моделей исследования животных, например - кролика (http://www.bialexa.ru/).

1.2.4 Полученные антитела накапливают в хранилище, например - в холодильнике при температуре минус 30°С, хранят и создают базу данных антител к маркерным белкам организмов. Базу данных используют для оценки экологической ситуации, причем - без потребности выполнения работ по пунктам 1.2.1-1.2.3. Созданная база данных маркерных белков зоопланктонных организмов применима для многократного использования при оценке экологического состояния среды в любом регионе мира. Таким образом, уменьшение объема обязательно выполняемых работ способствует повышению производительности труда при оценке экологического состояния окружающей среды в любом регионе мира.

1.2.5 Полученную пробу зоопланктонных организмов гомогенизируют в дистиллированной воде при соотношении вода : проба по объему 1:1 (один к одному), например - путем растирания (организмов) в ступе с чистым толченым стеклом, и получают гомогенат. Далее выполняют центрифугирование содержимого емкости с полученным гомогенатом, например - в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, и получают супернатант (надосадок). Супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом). Действия, описанные далее, выполняют раздельно для каждого антитела к маркерному белку организма, полученного на этапе 1.2.3.

1.2.6 Далее известным методом иммуноферментного анализа (ИФА) [Van Weemen B.K., Schuurs А.Н. (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 (3): 232-236. doi:10.1016/0014-5793(71)80319-8. PMID 11945853] [6] определяют количество (в нанограммах - нг) маркерных белков индикаторных зоопланктонных организмов в пробе, к которым были получены антитела, например - белок CO1 Dissotrocha macrostyla - 0,40 нг; белок CO1 Macrocyclops albidus - 0,05 нг; белок CO1 Rotaria neptunia - 0,05 нг. Суммарное Σ количество маркерных белков содержащихся в пробе индикаторных зоопланктонных организмов Σ=(0,40+0,05+0,05) нг=0,50 нг.

1.2.7 Рассчитывают частоту f встречаемости того или иного индикаторного зоопланктонного организма в пробе. Для расчета (частоты встречаемости) количество маркерного белка каждого зоопланктонного организма делят на суммарное количество маркерных белков всех зоопланктонных организмов в пробе.

1.2.8 Например - частота встречаемости Dissotrocha macrostyla f=0,40/(0,40+0,05+0,05)=0,40/0,50=0,80=0,8; частота встречаемости Macrocyclops albidus f=0,05/(0,40+0,05+0,05)=0,05/0,50=0,10; частота встречаемости Rotaria neptunia f=0,05/0,50=0,10=0,1.

1.3 Осуществляют оценку сапробности водоема путем суммирования произведений частоты встречаемости каждого индикаторного зоопланктонного организма на его индикаторный вес [1] и получают суммарный индикаторный вес зоопланктонных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема - например, у приведенных в Таблице 1 на Фиг. 1 видов зоопланктонных организмов суммарный индикаторный вес (далее СИВ) организмов в пробе равен:

СИВ=0,80×1,00+0,10×2,00+0,10×3,80=0,80+0,20+0,38=1,38.

1.4 Оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса зоопланктонных организмов в пробе СИВ=1,38 (Таблица 1). Суммарный индикаторный вес организмов в пробе СИВ=1,38 (в диапазоне 0,5<СИВ<1,5) соответствует о-b (олиго-бета) сапробности водоема [1], то есть водоем находится в состоянии переходном от чистого к умеренно-загрязненному. По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют (оценивают) чистой и благополучной, в настоящее время не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий.

ПРИМЕР 2 с использованием отсутствующих в международной базе данных аминокислотных последовательностей маркерных белков CO1 индикаторных видов зоопланктонных организмов.

2.1 Рассматривают случай, когда аминокислотные последовательности маркерных белков организмов, например - зоопланктонных, отсутствуют в базе данных, например -международной базе данных TrEMBL/SwissProt (http://www.uniprot.org/). То есть необходимо экспериментально получить нуклеотидные последовательности гена CO1 организмов с последующей трансляцией их в аминокислотные последовательности маркерного белка CO1 организмов.

2.2 Для оценки экологического состояния из исследуемого водоема известным способом [5], например - с использованием марлевого сачка, вылавливают и отбирают пробу зоопланктонных организмов. В качестве емкости для помещения пробы используют центрифугируемую пробирку, например - емкостью 50 мл. Количество и разнообразие попавших в пробу видов планктонных организмов на достоверность результата не влияет. Полное отсутствие планктонных организмов в пробе в определенной ситуации интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Этот случай в Примере 2 не рассматривают.

2.3 Определяют видовой состав зоопланктонных организмов в пробе - например, по вариабельному митохондриалъному гену цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее по тексту - CO1).

2.3.1 Для этого пробу зоопланктонных организмов просматривают при увеличении, например - под микроскопом Axio Lab.A1 (Carl Zeiss) и бинокуляром МБС-10, выделяют отдельный организм.

2.3.2 Описанные далее действия выполняют раздельно для каждого организма в пробе. Каждый отдельный организм помещают в отдельную емкость, например - пробирку, содержащую, например - 50 микролитров 7% водного раствора ионообменной смолы Chelex и инкубируют, например - в течение 20 мин при температуре не менее плюс 90°С, например - при плюс 99°С. Получают очищенную ДНК в водном растворе. Далее выполняют центрифугирование содержимого емкости с отобранным организмом, например - в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, получают ДНК-содержащий супернатант (надосадок). Супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом).

2.3.3 Осуществляют полимеразную цепную реакцию (далее по тексту - ПЦР) с использованием супернатанта в качестве матрицы. ПЦР проводят, например - в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5-кратную реакционную смесь qPCRmix-HS (фирмы Евроген, Россия), бидистиллированную воду, 0,4 мМ прямого и обратного праймеров, например - 5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3' и 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3'. Амплификацию осуществляют, например, 35-кратным повторением стадий в следующей последовательности: денатурация (при плюс 95°С, 30 секунд), отжиг (+59°С, 30 сек) и элонгация (полимеризация при +72°С, 120 сек), - используя известную комбинацию праймеров - 5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3' и 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3' [Folmer О. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome с oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates / O. Folmer, M. Black, W. Hoeh, R. Lutz, R. Vrijenhoek // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. - 1994. - V. 3. - P. 294-299] [7]. Таким образом получают достаточное для дальнейших процедур количество определенного (конкретного) фрагмента ДНК митохондриального гена цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1). Фрагмент ДНК, например - CO1, является уникальным (единственным в своем роде) вариабельным фрагментом гена, свойственным каждому виду среди всех видов живых организмов, что обеспечивает высокодостоверное, с точностью 99,9%, определение конкретного организма до вида. При этом для практического применения достаточно определение организма с точностью не менее 90%, то есть определение организма по вариабельным фрагментам гена в полной мере обеспечивает потребную для промышленного применения достоверность результатов.

2.3.4 Продукты ПЦР детектируют и очищают, например - электрофорезом в горизонтальном 1% агарозном геле. В качестве электродного буферного раствора для электрофореза используют, например, однократный раствор 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диола уксусной кислоты и этилендиаминтетраацетатной кислоты с pH 8,1 (далее по тексту - ТАЕ). Для нанесения проб используют буферный красящий раствор, например - состава: 10 тМ Трис-HCl, рН 7,8, 50 тМ ЭДТА, 0,03% бромфенолового синего, 0,03% ксилен цианолового, 15% глицерина. Пробу с красителем смешивают в соотношении 4:1 (8:2 мкл). Электрофорез проводят, например - при силе тока 50 мА, гель просматривают в ультрафиолетовом свете, например - на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция). Проявляют ДНК (полученную в результате ПЦР, пункт 1.2.1), добавляя в агарозу флуоресцирующий в ультрафиолетовом свете бромистый этидий в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Проявленная ДНК становится видимой в ультрафиолетовом свете, что подтверждает наличие ДНК в пробе.

2.3.5 Продукты ПЦР-амплификации выделяют из агарозного геля, например - с помощью набора реактивов фирмы Eurogen (Новосибирск, РФ) по методике производителя, путем добавления в 200 мкл лизирующего раствора (из набора) 200 мкг агарозного геля, содержащего определенный фрагмент ДНК, например - митохондриальный ген цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1). Смесь лизирующего раствора и агарозного геля инкубируют в водяной бане при температуре плюс 55°С до полного растворения геля. Полученный раствор переносят в фильтрующую колонку, вставленную в собирательную колонку (из набора Eurogen, Новосибирск, РФ), и инкубируют при комнатной температуре в течение 120 сек. После этого раствор центрифугируют 60 сек при скорости вращения 5000 об/мин и сливают содержимое собирательной колонки. После центрифугирования в фильтрующей колонке остается смесь фрагмента ДНК с посторонними веществами. Смесь (остаток) промывают буферным раствором, например - известным Wash buffer.

2.3.6 Для промывания смеси фильтрующую колонку вставляют обратно в собирательную колонку, затем в фильтрующую колонку добавляют 50 мкл промывочного раствора и центрифугируют, например - в течение 60 сек при 8000 об/мин. Процедуру промывки повторяют не менее двух раз, до получения чистой ДНК. После промывания чистая ДНК остается на мембране фильтрующей колонки. Использованную собирательную колонку заменяют на чистую пробирку емкостью 1,5 мл. Фильтрующую колонку с чистой ДНК вставляют в чистую пробирку. Затем ДНК элюируют добавлением 30 мкл буферного раствора (из набора) для элюции в фильтрующую колонку и буферным раствором смывают ДНК в пробирку. После выполнения всех вышеописанных процедур в пробирке получают раствор, содержащий определенный фрагмент ДНК отдельного организма, например - митохондриальный ген цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1).

2.3.7 Далее с помощью операции секвенирования определяют нуклеотидную последовательность (порядок расположения нуклеотидов) фрагмента ДНК. Операцию проводят, например, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей воду, ДНК, 5-кратный буферный раствор TMS, 2,5-кратный Ready Reaction Premix и 3.3 мМ праймеры. Операцию секвенирования осуществляют, например, 35-кратным повторением. Результат расшифровывают, например - с помощью автоматического генетического анализатора ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) согласно инструкциям производителя [Watts D. Automated fluorescent DNA sequencing on the ABI PRISM 310 Genetic Analyzer / D. Watts, J.R. MacBeath // Methods Mol Biol. 2001. - P. 167, 153-170] [8]. Получают сиквенсные хроматограммы.

2.3.8 Результаты секвенирования обрабатывают, например - программным пакетом Lasergene 5.03 (DNA STAR, Inc., США) и программным пакетом SeqMan для анализа сиквенсных хроматограмм, получают нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК отдельного организма, например - митохондриального гена цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1).

2.3.9 Затем проводят конвертацию (трансляцию) полученной нуклеотидной последовательности, например - гена CO1 зоопланктонного организма, в аминокислотную последовательность белка, например - белка CO1 зоопланктонного организма, с использованием стандартного генетического кода специализированной компьютерной программы, например - ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf).

2.3.10 Далее проводят такие же действия, как в Примере 1: п.п. 1.2.2-1.2.7; 1.3; 1.4, и оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса (СИВ) организмов в пробе.

Пример 3 с результатом сопоставления заявленного технического решения с результатами экспертной оценки экологического состояния водоема - озера Малое Глубокое и окружающей озеро природной среды. Оценка состояния озера и окружающей природной среды по материалам [Экология города Казани. - Казань: Изд-во АН РТ, 2005. - 527 с.] [9, Табл. 19, С. 126] - Благополучное (умеренно-загрязненное).

По заявленному способу с применением маркерных белков для определения видов индикаторных организмов, выполнена оценка экологического состояния озера Малое Глубокое, расположенного на территории г. Казани Республики Татарстан и окружающей озеро природной среды. Результат оценки по заявленному способу (с использованием маркерных белков) летом 2014 г. сопоставлен с оценкой экспертов-экологов, выполненной известным способом, где виды индикаторных организмов определены визуально, под микроскопом. Последовательность действий:

3.1 Отбирают пробы организмов из находящегося в оцениваемой окружающей среде озера Малое Глубокое.

3.2 Действуя вышеописанным путем (Пример 1), определяют индикаторные виды зоопланктона с применением маркерных белков CO1, рассчитывают частотное содержание и суммарный индикаторный вес (СИВ) индикаторных видов зоопланктона в пробе, см. Таблицу 2 на Фиг. 2.

3.3 Сначала оценивают экологическое состояние водоема на этой местности - озера Малое Глубокое по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса организмов в пробе СИВ=1,39 (Таблица 2 на Фиг. 2). Суммарный индикаторный вес организмов в пробе СИВ=1,39 (в диапазоне 0,5<СИВ<1,5) соответствует о-b (олиго-бета) сапробности водоема [1], то есть водоем находится в состоянии переходном от чистого к умеренно-загрязненному. По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, что полностью совпадает с экспертной оценкой и подтверждается тем, что местность является популярным местом отдыха.

ПРИМЕР 4 с использованием других (отличных от зоопланктона) индикаторных организмов - зообентоса.

Зообентос - совокупность донных животных, обитающих на грунте и в грунте морских и континентальных водоемов.

4.1. Для оценки экологического состояния региона из расположенного там (в регионе) водоема известным способом [Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зообентос и его продукция. / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева. - Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР. - 51 с.] [10], например - с использованием дночерпателя - отбирают пробу зообентосных организмов. Пробу размещают в центрифугируемой пробирке, например -емкостью 50 мл. Количество и разнообразие попавших в