Способы биологических исследований с использованием клеток для контроля качества нутрицевтических продуктов и лекарственных средств

Способы биологических исследований с использованием клеток для контроля качества нутрицевтических продуктов и лекарственных средств

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ЗАЯВЛЕНИЕ О ГОСУДАРСТВЕННОМ УЧАСТИИ

Изобретение было осуществлено при государственной поддержке в рамках гранта R01CA078411, присужденного Национальным институтом здоровья (США). Правительство США имеет определенные права на данное изобретение.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США 61/674180, поданной 20 июля 2012, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Варианты реализации настоящего изобретения относятся в целом к исследованию пищевых продуктов, нутрицевтических продуктов и лекарственных средств в отношении свойств, имеющих практическую значимость для здоровья человека или животных. Варианты реализации настоящего изобретения дополнительно включают усовершенствованные способы, в которых для количественной оценки активности указанных продуктов в качестве ингибиторов процесса инициации трансляции применяют клеточные методы исследований с применением новых клеточных линий.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Процесс инициации трансляции матричной РНК (мРНК) играет важную роль в регуляции размножения клеток и их злокачественной трансформации, поскольку экспрессия большинства регуляторных белков, управляющих онкогенезом и размножением клеток, контролируется на этапе трансляции (Flynn et al., 1996, Cancer Surv. 27:293; Sonenberg et al., 1998, Curr. Opin. Cell Biol. 10:268). По этой причине инициация трансляции является тщательно регулируемым клеточным процессом. Неэффективная отрицательная регуляция инициации трансляции может привести к индукции, возникновению и прогрессированию онкологического заболевания (Donze et al., 1995, Embo J. 14: 3828; Rosenwald, 1996, Bioessays 18: 243-50; De Benedetti et al., 2004, Oncogene 23: 3189-99; and Rosenwald, 2004, Oncogene 23:3230). В случае нарушения контроля процесса инициации трансляции, его ингибирование также может вызвать обращение фенотипов трансформированных клеток (Jiang et al., 2003, Cancer Cell Int. 3:2; Graff et al., 1995, Int. J. Cancer 60:255). Комплекс eIF2⋅GTP⋅Met-tRNA_i (также известный как тройной комплекс) является ключевым положительным регулятором процесса инициации трансляции. Уменьшение его доступности нарушает начало новых раундов трансляции белка. Несмотря на то, что трансляция многих онкогенных белков и других факторов роста клеток в значительной мере зависит от присутствия указанного тройного комплекса, это не относится к конститутивным генам (генам «домашнего хозяйства»), по этой причине пищевые продукты, нутрицевтические продукты и лекарственные средства, которые способствуют уменьшению концентрации, доступности или активности указанного тройного комплекса, потенциально могут представлять собой безопасные средства для профилактики и лечения заболеваний. Помимо этого экспрессия определенных генов-супрессоров опухолей и проапоптотических генов и/или белков по существу увеличивается в присутствии ингибиторов тройного комплекса или, в более общем смысле, в присутствии ингибиторов процесса инициации трансляции. В целом, снижение эффективности трансляции онкогенных белков, в особенности в комбинации с активированием генов-супрессоров опухолей и проапоптотических генов, как правило, предотвращает и/или подавляет развитие злокачественного фенотипа.

Эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), омега-3 полиненасыщенная жирная кислота (омега-3 ПНЖК), обнаруживается в больших количествах в жире, полученном из рыбы, особенно из рыбы диких популяций, обитающих в холодных океанических водах. Выращенная в искусственных условиях рыба обычно содержит гораздо более низкие концентрации омега-3 ПНЖК, по сравнению с рыбой диких популяций. Было обнаружено, что при введении жира морских видов рыб пациентам с раком предстательной железы происходит фосфорилирование белка eIF2α, что указывает на уменьшение доступности функционального белка eIF2 для образования тройного комплекса, этот вывод согласуется с результатами, полученными в ходе исследований на животных моделях и клеточных экспериментальных системах с использованием ЭПК и синтетических ингибиторов тройного комплекса. Соответственно, пищевые добавки, которые содержат ингибиторы процесса инициации трансляции, представляют собой продукты, привлекательные с коммерческой точки зрения, для лечения и/или профилактики онкологических заболеваний и/или пролиферативных заболеваний, при которых характерным патологическим отклонением является нарушение клеточной пролиферации. Такие пищевые добавки также могут действовать в качестве регуляторов процесса инициации трансляции и представляют собой продукты, привлекательные с коммерческой точки зрения, для лечения и/или профилактики болезней обмена веществ, таких как ожирение и диабет.

Рыбий жир, полученный из различных источников, широко доступен для потребителей в виде пищевого продукта или пищевой добавки. Жир, а также фракции или компоненты, полученные из жира, содержащиеся в различных производственных сериях, партиях, образцах или дозах продукта, могут различаться по качеству или эффективности, в зависимости от источников происхождения (например, климатических условий, видов рыб или условий выращивания, поставщиков) или условий обработки. Те же условия могут быть применимы к содержимому одной серии, партии, образца или дозы продукта. Другие пищевые продукты, нутрицевтические продукты или лекарственные средства, которые содержат природные или синтетические ингибиторы процесса инициации трансляции, могут различаться между собой по качеству или эффективности по аналогичным причинам.

В этой связи существует необходимость контроля и/или обеспечения качества физиологического или лечебного действия продукта на потенциальных потребителей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Производство пищевых добавок, обладающих лечебным/профилактическим действием в отношении заболеваний человека, представляет собой быстро развивающуюся отрасль индустрии с многомиллиардными оборотами во всем мире. Тем не менее, одной из основных нерешенных проблем в этой отрасли индустрии является недостаточный контроль качества продуктов, которые выделяют из природных источников, в целях гарантированного обеспечения специфичной биологической активности и эффективности, эквивалентности биологической активности среди различных препаратов, выделенных/полученных из одного и того же растительного/животного источника, и сопоставимой эффективности среди препаратов, выделенных из одного и того же вида растений или животных, но происходящих из различных географических регионов и/или индустриальных источников.

Ингибиторы, активаторы или другие виды модуляторов процесса инициации трансляции обладают широким спектром действия в качестве противоопухолевых и антипролиферативных средств, а также широким спектром действия в отношении энергетического баланса организма. Нутрицевтические продукты, содержащие ингибиторы, активаторы или другие виды модуляторов процесса инициации трансляции, включая, но не ограничиваясь ими, препараты рыбьего жира, можно применять для профилактики заболеваний человека, характеризующихся нарушением клеточной пролиферации, включая онкологические заболевания. Однако отсутствие в настоящее время биологических способов исследований, с помощью которых можно определить биологическую активность нутрицевтических продуктов такого рода, делает невозможным контроль их качества, эффективности и/или однородности между различными торговыми марками или источниками, либо между различными партиями или продуктами одной торговой марки или из одного и того же источника.

Соответственно, согласно некоторым примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложены способы контроля и/или обеспечения качества пищевых продуктов, нутрицевтических продуктов и лекарственных средств в отношении способности указанных продуктов модулировать инициацию трансляции мРНК, что позволит решить проблему, которая заключается в необходимости предоставить потребителям точную информацию, касающуюся возможной пользы таких продуктов для здоровья.

В настоящем изобретении предложены биологические способы исследований, специфичные в отношении процесса инициации трансляции, которые можно применять для количественной оценки биологической активности соединений, например, нутрицевтических продуктов, которые содержат ингибиторы, активаторы или модуляторы процесса инициации трансляции. Биологические способы исследований, специфичные в отношении процесса инициации трансляции, которые предложены в настоящей заявке, позволяют оценить качество (например, биологическую активность), эффективность и однородность партий нутрицевтических продуктов, которые содержат вещества, например, эндогенные вещества или добавки, которые действуют в качестве ингибиторов, активаторов или иных модуляторов процесса инициации трансляции.

Указанные биологические способы исследований обеспечивают точные и быстрые инструменты для определения степени, в которой данный образец пищевого продукта, нутрицевтического продукта или лекарственного средства может модулировать процесс инициации трансляции, и таким образом обеспечивать полезные свойства для человека или животного, которые потребляют такой продукт, или которому вводят такой продукт. Указанные биологические способы исследований в целом позволяют исследовать способность образца такого продукта ингибировать инициацию трансляции мРНК. Типичные биологические способы исследований, описанные в настоящей заявке, позволяют детектировать способность образца ингибировать образование, доступность или активность тройного комплекса, или посредством фосфорилирования eIF2α, или иным образом.

Согласно некоторым примерам вариантов реализации настоящего изобретения может быть проведено исследование способности образца продукта активировать трансляцию некоторых транскриптов мРНК. Активация трансляции таких транскриптов может указывать на наличие, концентрацию, доступность и/или активность ЭПК или других омега-3 ПНЖК, содержащихся в данном образце. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно детектировать способность образца активировать трансляцию некоторых транскриптов мРНК, 5'-нетранслируемая область (5'-НТО) которых содержит две или более открытых рамок считывания (ОРС). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно исследовать способность образца активировать трансляцию одного или более из ATF-4, BRCA1 мРНКb, CD59, ТСТР и GCN4, в качестве меры эффективности и/или способности такого образца обеспечивать полезные свойства для здоровья человека или животного, которые потребляют соответствующий продукт, или которым вводят соответствующий продукт. С помощью таких биологических способов исследований можно детектировать повышенную концентрацию, доступность или активность белков, полученных в результате активации трансляции таких мРНК. Степень, в которой увеличивается, активируется или иным образом модулируется трансляция маркерных белков, можно определить путем сравнения результатов исследований с контрольными величинами. Не желая быть связанными соответствием какой-либо конкретной теории, авторы полагают, что подобную активацию трансляции можно облегчить путем фосфорилирования eIF2α и/или посредством ингибирования тройного комплекса.

В соответствии с настоящим изобретением предложен способ оценки величины активности, имеющей практическую значимость, в образце пищевого продукта, нутрицевтического продукта или лекарственного средства путем детектирования полинуклеотидных продуктов генов, транскрипция которых увеличивается, активируется или иным образом модулируется в присутствии ЭПК или других омега-3 ПНЖК, содержащихся в данном образце.

Согласно некоторым вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ детектирования продуктов генов, транскрипция которых увеличивается, активируется или иным образом модулируется в присутствии ЭПК, других омега-3 ПНЖК или других полезных агентов. Такие транскрипты могут включать, но не ограничиваются ими, транскрипты, которые кодируют ATF-4, BiP, CHOP, Xpb-1 и синтетазы аминокислот. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы детектирования транскриптов мРНК, которые кодируют указанные белки, например, с помощью методов обратной транскрипции, амплификации нуклеиновых кислот (например, ПЦР или методов изотермической реакции амплификации, известных в данной области техники) или гибридизации нуклеиновых кислот. Увеличение, активацию или модуляцию иным образом транскрипции гена также можно обнаружить с использованием исследований на основе репортерных генов, например, таких, при которых в системе, которая обеспечивает транскрипцию ДНК промотор гена, представляющего интерес, функционально связан с репортерным геном до осуществления контакта с исследуемым или контрольным образцом. Степень, в которой транскрипция увеличивается, активируется или модулируется иным образом, определяют путем сравнения уровней транскрипции или величины активности репортерного гена, наблюдаемых в исследуемом образце, с теми, которые наблюдают для внешнего или внутреннего (например, двойная репортерная метка) стандарта или контроля.

Согласно некоторым примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ исследования пищевых продуктов, нутрицевтических продуктов и лекарственных средств в целях обнаружения (детектирования) белков, кодируемых продуктами генов, транскрипция которых увеличивается, активируется или модулируется иным образом в присутствии ЭПК, других омега-3 ПНЖК или других полезных агентов. Такие белки могут включать, но не ограничиваются ими, ATF-4, BiP, CHOP, Xbp-1 и синтетазы аминокислот. Для того чтобы определить эффективность исследуемого образца концентрации таких белков, наблюдаемые в присутствии исследуемого образца, могут быть сопоставлены с теми, которые наблюдают в присутствии стандартного или другого контрольного образца.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ определения однородности партии, состоящей из множества отдельных композиций, включающий этапы детектирования активности в отношении ингибирования, активирования или модулирования иным образом процесса инициации трансляции по меньшей мере одной из таких отдельных композиций, и сравнения величины активности в отношении ингибирования, активирования или модулирования иным образом процесса инициации трансляции по меньшей мере одной из отдельных композиций с соответствующей величиной стандарта для определения однородности партии.

Соответственно, согласно некоторым типичным вариантам реализации предложен способ определения наличия у вещества (например, вещества, полученного из рыбьего жира, и/или вещества, содержащего ЭПК) одного или более полезных биологических, нутрицевтических или лечебных свойств. Способ включает следующие этапы: обеспечение второго образца, содержащего вторую последовательность мРНК, имеющую по меньшей мере две открытые рамки считывания в 5'-НТО, причем вторая последовательность мРНК кодирует второй биомаркерный белок; приведение второго образца в контакт с веществом; и детектирование уровней трансляции первого и второго биомаркерных белков, причем уровень трансляции второго биомаркерного белка выше, чем уровень трансляции первого биомаркерного белка, в случае если вещество имеет одно или более полезных биологических, нутрицевтических или лечебных свойств. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения первый образец приводят в контакт со стандартным веществом или контрольным веществом. Согласно другим аспектам настоящего изобретения первая мРНК и вторая мРНК имеют идентичные последовательности. Согласно другим аспектам настоящего изобретения первый биомаркерный белок и второй биомаркерный белок представляют собой идентичные белки. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения первый и второй биомаркерные белки выбирают из группы, состоящей из продукта мРНКb гена восприимчивости к раку молочной железы 1 (BRCA1), фактора активации транскрипции 4 (ATF-4), опухолевого белка, регулируемого на этапе трансляции (ТСТР), протектина (CD59) и фактор общего контроля с постоянной репрессией 4 (general control nonderepressible 4, GCN4). Согласно другим аспектам настоящего изобретения этап детектирования уровней трансляции осуществляют с помощью одного или более методов, таких как Вестерн-блот, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноцитохимические методы анализа. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения образец представляет собой животную, клеточную или бесклеточную систему (например, системы на основе лизатов ретикулоцитов кролика), в которой, в зависимости от конкретного случая, может произойти транскрипция ДНК и/или трансляция мРНК. Клетки могут быть получены от человека, других млекопитающих (включая, но не ограничиваясь ими, мышей и крыс), кур и других птиц, или дрожжей. Бесклеточные системы включают цитоплазматические экстракты ретикулоцитов кролика, зародышей пшеницы или клеток млекопитающих, такие как экстракты клеток линии HeLa S100. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения 5'-НТО представляет собой природную или синтетическую последовательность. Согласно другим аспектам настоящего изобретения 5'-НТО функционально связана с последовательностью, которая кодирует репортерный белок. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения уровни трансляции определяют путем оценки одного или более видов активности репортерного белка. Согласно другим аспектам настоящего изобретения уровень трансляции второго биомаркерного белка составляет по меньшей мере 150% от уровня трансляции первого биомаркерного белка. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения оценивают активность омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) (например, эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК)) в веществе. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения указанное вещество представляет собой образец пищевого продукта, образец нутрицевтического продукта или образец фармацевтического препарата.

Согласно некоторым примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ определения наличия у вещества (например, вещества, полученного из рыбьего жира и/или вещества, содержащего ЭПК) одного или более полезных биологических, нутрицевтических или лечебных свойств. Указанный способ включает следующие этапы: обеспечение образца, включающего последовательность мРНК, которая имеет по меньшей мере две открытые рамки считывания в 5'-НТО, причем последовательность мРНК кодирует биомаркерный белок, приведение указанного образца в контакт с веществом, определение уровня трансляции указанного биомаркерного белка и определение уровня трансляции белка, представляющего собой внутренний стандарт, причем биомаркерный белок имеет более высокий уровень трансляции, чем уровень трансляции белка, представляющего собой внутренний стандарт, в случае если указанное вещество обладает одним или более полезными биологическими, нутрицевтическими или лечебными свойствами. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения белок, представляющий собой внутренний стандарт, кодируется последовательностью мРНК, которая имеет одну открытую рамку считывания (ОРС) в 5'-НТО, или не имеет ОРС в 5'-НТО. Согласно другим аспектам настоящего изобретения биомаркерный белок выбирают из группы, состоящей из продукта мРНКb гена BRCA1, ATF-4, ТСТР, CD59 и GCN4. Согласно другим аспектам настоящего изобретения этап детектирования уровня трансляции осуществляют с помощью одного или более методов, таких как Вестерн-блот, ИФА и иммуноцитохимические методы анализа. Согласно другим аспектам настоящего изобретения 5'-НТО представляет собой природную или синтетическую последовательность. Согласно другим аспектам настоящего изобретения 5'-НТО функционально связана с последовательностью, которая кодирует репортерный белок. Согласно другим аспектам настоящего изобретения уровни трансляции определяют, оценивая один или более видов активности репортерного белка. Согласно другим аспектам настоящего изобретения уровень трансляции биомаркерного белка составляет по меньшей мере 150% от уровня трансляции внутреннего стандарта. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения оценивают активность омега-3 ПНЖК (например, ЭПК) в веществе. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вещество представляет собой образец пищевого продукта, образец нутрицевтического продукта или образец фармацевтического препарата.

Согласно некоторым примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ детектирования способности вещества (например, вещества, полученного из рыбьего жира, и/или вещества, содержащего ЭПК) активировать биомаркерный ген на этапе транскрипции. Способ включает следующие этапы: обеспечение первой исследуемой системы (тест-системы), включающей последовательность мРНК, которая содержит область, кодирующую первый репортерный белок, функционально связанную с промотором первого биомаркера, обеспечение второй исследуемой системы (тест-системы), включающей вторую последовательность мРНК, которая содержит область, кодирующую второй репортерный белок, функционально связанную с промотором второго биомаркера, приведение указанной второй исследуемой системы в контакт с веществом, детектирование уровней транскрипции первой и второй последовательностей мРНК, сравнение уровней транскрипции первой и второй мРНК, определение того, является ли уровень транскрипции второй последовательности мРНК более высоким, чем уровень транскрипции первой последовательности мРНК, и идентификацию вещества как активатора биомаркерного гена в случае, если уровень транскрипции второй мРНК превышает уровень транскрипции первой мРНК, в том случае если вещество активирует биомаркерный ген на этапе транскрипции. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения первая и вторая исследуемые системы представляют собой системы на основе животных моделей, клеточные или бесклеточные системы. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения осуществляют контакт первой исследуемой системы со стандартным веществом или контрольным веществом. Согласно другим аспектам настоящего изобретения первая мРНК и вторая мРНК имеют идентичные последовательности, и/или первый репортерный белок и второй репортерный белок являются идентичными. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения уровни транскрипции определяют методом ПЦР в режиме реального времени (например, в условиях in vitro и in vivo (например, в клетках)). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения транскрипционную активность определяют путем детектирования активности одного или более репортерных белков. Согласно другим аспектам настоящего изобретения биомаркерный ген кодирует проапоптотический белок или белок-супрессор опухолей (например, CHOP, BiP, ATF-4, Xbp-1, синтетазу аминокислот или т.п.). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения уровень транскрипции второй последовательности мРНК составляет по меньшей мере 150% от уровня транскрипции первой последовательности мРНК. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения оценивают активность омега-3 ПНЖК (например, ЭПК) в веществе. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вещество представляет собой образец пищевого продукта, образец нутрицевтического продукта или образец фармацевтического препарата.

Согласно некоторым примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ изготовления продукта рыбьего жира, контролируемого по качеству. Способ включает следующие этапы: обеспечение первого образца, включающего первую последовательность мРНК, которая содержит по меньшей мере две открытые рамки считывания в 5'-нетранслируемой области указанной первой последовательности мРНК, причем первая последовательность мРНК кодирует первый биомаркерный белок, обеспечение второго образца, включающего вторую последовательность мРНК, которая содержит по меньшей мере две открытые рамки считывания в 5'-нетранслируемой области (НТО) указанной второй последовательности мРНК, причем вторая последовательность мРНК кодирует второй биомаркерный белок, приведение второго образца в контакте продуктом рыбьего жира,, сравнение уровней трансляции и определение детектирование уровней трансляции первого и второго биомаркерных белков, причем уровень трансляции второго биомаркерного белка является более высоким, чем уровень трансляции первого биомаркерного белка, в случае если продукт рыбьего жира обеспечивает одно или более полезных биологических, нутрицевтических или лекарственных свойств для субъекта, и выбор продукта рыбьего жира, который имеет более высокий уровень трансляции, в качестве продукта рыбьего жира, контролируемого по качеству. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения первый образец приводят в контакт со стандартным веществом или контрольным веществом. Согласно другим аспектам настоящего изобретения первая мРНК и вторая мРНК имеют идентичные последовательности. Согласно другим аспектам настоящего изобретения первый биомаркерный белок и второй биомаркерный белок являются идентичными (например, продукт мРНКb гена BRCA1, ATF-4, ТСТР, CD59 и GCN4).

Согласно некоторым примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ изготовления продукта рыбьего жира, контролируемого по качеству. Способ включает следующие этапы: обеспечение образца, включающего последовательность мРНК, которая содержит по меньшей мере две открытые рамки считывания в 5'-нетранслируемой области последовательности мРНК, причем последовательность мРНК кодирует биомаркерный белок, приведение образца в контакт с продуктом рыбьего жира, детектирование уровня трансляции биомаркерного белка, детектирование уровня трансляции белка, представляющего собой внутренний стандарт, сравнение и определение является ли уровень трансляции биомаркерного белка более высоким, чем уровень трансляции белка, представляющего собой внутренний стандарт, в случае если продукт рыбьего жира может обеспечить одно или более полезных биологических, нутрицевтических или лечебных свойств для субъекта, и выбор продукта рыбьего жира, который имеет более высокий уровень трансляции, в качестве продукта рыбьего жира, контролируемого по качеству. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения биомаркерный белок выбирают из группы, состоящей из продукта мРНКb гена BRCA1, ATF-4, ТСТР, CD59 и GCN4.

Согласно некоторым типичным вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ изготовления продукта рыбьего жира, контролируемого по качеству. Способ включает следующие этапы: обеспечение первой исследуемой системы (тест-системы), включающей последовательность мРНК, которая содержит область, кодирующую первый репортерный белок, функционально связанную с промотором первого биомаркера, обеспечение второй исследуемой системы (тест-системы), включающей вторую последовательность мРНК, которая содержит область, кодирующую второй репортерный белок, функционально связанную с промотором второго биомаркера, приведение второй исследуемой системы в контакт с продуктом рыбьего жира, детектирование уровней транскрипции первой и второй последовательностей мРНК, сравнение и определение является ли уровень транскрипции второй последовательности мРНК более высоким, чем уровень транскрипции первой последовательности мРНК, в случае если продукт рыбьего жира может обеспечить одно или более полезных биологических, нутрицевтических или лечебных свойств для субъекта, и выбор продукта рыбьего жира, который имеет более высокий уровень трансляции, в качестве продукта рыбьего жира, контролируемого по качеству. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения промотор биомаркера выбирают из группы, состоящей из промотора CHOP, промотора BIP, промотора ATF-4, промотора Xbp-1 или промотора синтетазы аминокислот и т.п., или других промоторов, индукция которых осуществляется аналогичным образом за счет ингибирования процесса инициации трансляции.

Согласно некоторым дополнительным примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложены способы детектирования транскриптов, концентрации которых в образце увеличиваются в результате активности омега-3 жирных кислот, с применением методов детектирования нуклеиновых кислот, такие как ПЦР в режиме реального времени. Дополнительно предложены способы детектирования в образце транскриптов, концентрации которых увеличиваются в результате активности омега-3 жирных кислот, путем детектирования активности репортерных белков, кодируемых генами, находящимися под контролем промоторов, которые активируется под действием омега-3 жирных кислот на этапе транскрипции. Дополнительно предложены способы детектирования повышенной эффективности трансляции транскриптов, которые имеют две или более открытых рамок считывания в их 5'-НТО. Дополнительно предложены способы изготовления пищевых продуктов, нутрицевтических продуктов и лекарственных средств, контролируемых по качеству, используя способы детектирования в образце транскриптов, концентрации которых увеличиваются в результате активности омега-3 жирных кислот.

Согласно некоторым дополнительным примерам вариантов реализации настоящего изобретения предложены способы детектирования эффективности композиции, обладающей ингибиторной активностью в отношении инициации трансляции, которые включают этапы приведения клеток, экспрессирующих eIF2α-WT, в контакт с указанной композицией в течение периода времени и при температуре, достаточных для ингибирования пролиферации указанных клеток, и определения степени ингибирования пролиферации указанных клеток, индуцированного указанной композицией, причем величина указанной активности указанной композиции пропорциональна степени ингибирования пролиферации указанных клеток, экспрессирующих eIF2α-WT.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Перечисленные выше и другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут более понятны из нижеследующего подробного описания типичных вариантов реализации, рассматриваемых во взаимосвязи с прилагаемыми чертежами, где:

На Фиг. 1 приведены результаты исследования, полученные с помощью метода Вестерн-блота, с использованием антител к общему белку eIF2α или антител к β-актину. Дорожка 1 соответствуют клеткам, трансдуцированным вектором pLVTHM без миРНК, дорожки 2 и 3 соответствуют клеткам, трансдуцированным вектором pLVTHM, содержащим кассеты eIF2α-WT и eIF2α-S51A ОРС и миРНК #1098.

На Фиг. 2 приведен график, показывающий результаты исследования уровней мРНК эндогенного eIF2α, определенных методом ПЦР в режиме реального времени в исходных клетках (Mat) и клетках, экспрессирующих рекомбинантный (REC) eIF2α-WT (GFP) и eIF2α-S51A/RFP или eIF2α-WT/RFP. Дорожка 1 соответствуют клеткам, трансдуцированным вектором pLVTHM без миРНК, дорожки 2 и 3 соответствуют клеткам, трансдуцированным вектором pLVTHM, содержащим кассеты eIF2α-WT и eIF2α-S51A ОРС и миРНК #1098.

На Фиг. 3 приведены результаты исследования, полученные с помощью метода Вестерн-блота. Клетки, указанные в подписи к Фиг.2, обрабатывали носителем или ЭПК, и клеточные лизаты помечали с применением антител к pS51-eIF2α (вверху) или антител к общему eIF2α (внизу). Rec = рекомбинантный, End = эндогенный eIF2α.

На Фиг. 4 показано графическое отображение результатов исследования устойчивости клеток, экспрессирующих eIF2α-S51A, к ингибированию клеточной пролиферации, индуцированному ЭПК, тогда как пролиферация исходных клеток РС-3 (Mat) или клеток РС-3, трансдуцированных рекомбинантным белком eIF2α/RFP и миРНК, чувствительна к ингибированию клеточной пролиферации, индуцированному ЭПК, и зависит от дозы кислоты.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было сделано парадоксальное наблюдение, что трансляция некоторых мРНК осуществляется более эффективно при недостатке тройного комплекса, а не при его избытке (Aktas et al., 2004, Journal of Nutrition 134(9): 2487S-2491S; Halperin and Aktas, международная публикация патентной заявки WO 2008/008333). Это наблюдение относится к молекулам мРНК, кодирующим фактор транскрипции ATF-4, который активирует на этапе трансляции многие гены раннего ответа на стресс, такие как проапоптотический С/ЕВР-гомологичный белок (CHOP) или шаперон иммуноглобулин-связывающий белок раннего ответа (BiP) (Harding et al., 2000, Mol. Cell 6:1099). Трансляция изоформы мРНК BRCA1, обозначенной мРНКb, также осуществляется более эффективно при недостатке тройного комплекса. Было обнаружено, что омега-3 полиненасыщенная жирная кислота, эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), активирует CHOP (номер доступа в GenBank S40706) и регулируемый глюкозой белок 78 (BiP, номер доступа RefSeq NM_005347) в раковых клетках и в опухолях, полученных от животных с моделями онкологических заболеваний или от пациентов, и что ЭПК увеличивала трансляцию мРНКb BRCA1 в линиях клеток рака молочной железы и опухолях животных.

Последовательности мРНК BRCA1 и мРНК, кодирующей фактор активации транскрипции 4 (ATF-4, номер доступа в RefSeq NM_001675), содержат несколько открытых рамок считывания (ОРС) в их 5'-нетранслируемой области (5-НТО). Не желая быть связанными соответствием какой-либо теории, авторы полагают, что дополнительные мРНК, которые содержат две или более ОРС в их 5'-НТО, были определены к настоящему моменту. Такие мРНК включают, но не ограничиваются ими, транскрипты мРНК генов, которые кодируют опухолевый белок, контролируемый на этапе транскрипции (ТСТР, номер доступа в RefSeq NM_003295.2), протектин (CD59) и фактор общего контроля с постоянной репрессией 4 (GCN4, номер доступа в RefSeq NC_00113). В соответствии с некоторыми типичными вариантами реализации может быть проведена количественная оценка способности образца пищи, нутрицевтического продукта или лекарственного средства повышать распространенность, концентрацию или биологическую активность белка, кодируемого транскриптом мРНК, имеющим несколько ОРС в 5'-НТО. В частности, может быть проведена количественная оценка способности такого образца вызывать увеличение распространенности, концентрации или активности одного или более из BRCA1, ATF-4, ТСТР, CD59 и GCN4.

Повышение эффективности транскрипции некоторых генов также происходит в присутствии ингибиторов тройного комплекса. Помимо генов, которые кодируют ATF-4, BiP и CHOP, гены, которые демонстрируют повышенную эффективность транскрипции в присутствии ингибиторов процесса инициации трансляции, включают гены, кодирующие Х-Вох-связывающий белок 1 (ХВР-1, номер доступа в RefSeq NM_001079539.1) и синтетазы аминокислот. Такие гены являются подходящими биомаркерами для проведения исследований ингибиторов процесса инициации трансляции, эффективность которых оценивают в соответствии с настоящим изобретением, например, ингибиторов, обнаруживаемых в рыбьем жире. Транскрипты таких генов можно детектировать и количественно оценивать их концентрации до и после воздействия образцов исследуемых пищевых продуктов, нутрицевтических продуктов или лекарственных средств на подопытных животных, клеточные или бесклеточные системы с использованием способов, известных в данной области техники, затем концентрации транскриптов могут быть сопоставлены, чтобы определить степень, в которой исследуемый образец усиливает транскрипцию маркерного гена. В другом варианте реализации концентрации транскриптов исследуемых биомаркеров могут быть сопоставлены с таковыми для контрольных транскриптов (например, конститутивных генов) или транскриптов, выделенных из животных моделей, клеточных или бесклеточных систем, после воздействия на них стандартных или контрольных веществ с известной величиной биологической активности. Аналогичным образом можно осуществлять детектирование и количественную оценку концентраций белковых продуктов, полученных в результате транскрипции биомаркерных генов, и их концентрации могут быть сопоставлены с теми, которые обнаруживаются в необработанных животных моделях, клеточных или бесклеточных системах либо в животных моделях, клеточных и бесклеточных системах после воздействия стандартных или контрольных веществ с известной величи