Способ получения изображения образца

Способ получения изображения образца

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способу получения изображения образца.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с известным способом отслеживания перемещения одиночной молекулы в образце молекулу возбуждают светом для испускания фотонов, а фотоны, испускаемые молекулой, обнаруживаются двумерным детектором, получающим изображение образца. Затем текущее положение молекулы определяют из пространственного распределения фотонов, обнаруженных детектором. При соответствующей плотности пикселей детектора текущее положение молекулы может быть определено из пространственного распределения фотонов с пространственным разрешением или точностью, превосходящей дифракционный предел. Тем не менее, это является предварительным условием отслеживания частицы с пространственной точностью за дифракционным пределом, при котором большое число фотонов обнаруживается для каждого положения молекулы, то есть до того как молекула изменяет свое положение. Это связано с тем, что большее число фотонов улучшает пространственную точность, достигнутую в определении положения молекулы, только если эта позиция остается неизменной в течение всего периода, в течение которого большее число фотонов испускается молекулой.

Пространственная точность задается радиусом Δr окружности вокруг положения молекулы, определенного из центра интенсивности распределения положений, в котором фотоны, испускаемые молекулой, обнаруживаются посредством двумерного детектора. Истинное положение молекулы локализуется в пределах этой окружности. Радиус Δr задается:

Δr=ПШПВ/N^1/2 (1)

и зависит от числа N обнаруженных фотонов и полной ширины на полувысоте максимума ПШПВ дифракционной картины.

Так как известный метод отслеживания движения одиночной молекулы требует огромного числа N фотонов для каждого положения молекулы в образце, молекула подвергается серьезному воздействию, что приводит к повышенному риску обесцвечивания молекулы. В процессе обесцвечивания молекула химически изменяется таким образом, что больше никаких фотонов не выдается молекулой после обесцвечивания. Кроме фотохимического обесцвечивания также возможно, что молекула, которая интенсивно и/или многократно возбуждалась для испускания фотонов, переходит в метастабильное темновое состояние. Из метастабильного темнового состояния молекула может вернуться через некоторое время. В метастабильном темновом состоянии, однако, молекула не испускает каких-либо фотонов, необходимых для непрерывного отслеживания молекулы.

Следовательно, существуют только некоторые молекулы, т.е. только некоторые так называемые флуоресцентные красители или флуорофоры, которые подходят для использования в известном способе. Многие флуорофоры обесцвечиваются слишком быстро и, следовательно, их движение или движение молекулы, отмеченной флуорофором, не может быть отслежено в течение длительного периода времени или на более длительном расстоянии, пройденном внутри образца.

В способе, описанном выше, положение молекулы определяют из распределения положений, в которых фотоны, испускаемые молекулой, обнаруживаются двумерным детектором. Такой подход называется локализацией. Другой подход для достижения высокого разрешения или точности в определении пространственного положения молекул, испускающих фотон, представляет собой, так называемую STED или RESOLFT флуоресцентную микроскопию. В этом случае пространственная область, в которой молекулы в образце эффективно возбуждаются для испускания фотонов, уменьшается до размера, меньшего, чем дифракционный предел. Таким образом, фотоны, испускаемые из образца, могут быть отнесены к этой конкретной пространственной области уменьшенного размера независимо от положения, в котором обнаружены фотоны, и независимо от количества обнаруженных фотонов. На практике, уменьшение пространственной области эффективного возбуждения молекул для испускания фотонов достигается путем применения сфокусированного пучка возбуждающего света, который совмещается с интерференционной картиной одного или более когерентных пучков подавляющего флуоресценцию света. Эта интерференционная картина содержит точку практически нулевой интенсивности в фокальной области пучка возбуждающего света. Для высоких абсолютных интенсивностей пучков подавляющего флуоресценцию света интенсивность подавляющего флуоресценцию света превышает интенсивность I_S насыщения в любом месте, кроме точки практически нулевой интенсивности так, что испускание фотонов молекулами в образце подавляется практически в любом месте, кроме точки практически нулевой интенсивности. Достигнутое пространственное разрешение или точность задается в виде:

Δr=λ/n sin α (1+I/I_S)^1/2) (2),

причем I - это максимальная интенсивность интерференционной картины в образце.

В STED флуоресцентной микроскопии подавление флуоресценции достигается за счет вынужденной эмиссии. В случае RESOLFT флуоресцентной микроскопии подавление флуоресценции достигается за счет временного переноса молекул в конформационное или состояние другого типа, в котором молекулы не способны к флуоресценции. Поскольку в STED флуоресцентной микроскопии требуются высокие абсолютные интенсивности подавляющего флуоресценцию света, риск обесцвечивания флуорофоров является относительно высоким. Для RESOLFT флуоресцентной микроскопии относительно низкие интенсивности подавляющего флуоресценцию света являются достаточными. Тем не менее, этот подход может быть применен только при использовании специальных флуорофоров, которые могут быть переключены в конформационное или состояние другого типа, в котором флуорофоры не способны флуоресцировать.

В целом, подходы, подобные STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии могли бы применяться для отслеживания перемещения частицы в образце, в котором частица отслеживается в области пространственно уменьшенного размера, где частица эффективно возбуждается для эмиссии светом флуоресценции. В этом случае критерием для частицы, находящейся в области пространственно уменьшенного размера могла бы быть максимальная скорость фотонов, испускаемых отслеживаемой частицей. Несмотря на то, что в соответствии с этим подходом для отслеживания могло бы потребоваться меньшее количество фотонов, чем для непрерывной локализации частицы, число частиц и маркеров, которые подходят для отслеживания перемещения на большие расстояния не могло бы быть в значительной степени увеличено. Кроме того, в STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии для получения света возбуждения и света для подавления флуоресценции должны быть применены различные световые пучки. Как правило, это требует дополнительных усилий, поскольку различные световые пучки имеют разные длины волн, и поскольку различные световые пучки должны быть тщательно пространственно выровнены.

Из DE 25 46 952 A1 известно, что оптическая система, основанная на так называемом затухающем полном отражении, может быть применена для отслеживания перемещений частиц в образце. В соответствии с DE 25 46 952 A1 на образец воздействует свет, побуждающий частицы испускать фотоны. Поскольку распределение интенсивности света, освещающего образец, не является однородным, а пространственно модулированным, перемещение частиц приводит к соответствующей флуктуации числа испускаемых фотонов. Таким образом, учитывая модуляцию распределения интенсивности, перемещение частицы может быть определено исходя из обнаруженной флуктуации испускаемых фотонов, то есть модуляции сигнала детектора. Однако, перемещение частицы, движущейся по траектории вдоль постоянной интенсивности света, не может быть отслежено. Кроме того, частица, на которую никогда или редко воздействует свет во время своего перемещения, не может быть отслежена вовсе. Таким образом, важно для отслеживания перемещений частиц в образце с помощью оптической системы, известной из DE 25 46 952 А1, чтобы на частицы часто воздействовал свет. Следовательно, риск обесцвечивания частиц или маркеров, маркирующих частицы эффективно не уменьшается, но должен быть принят во внимание.

Способ отслеживания перемещения одиночной молекулы в образце, содержащий признаки ограничительной части независимого пункта 1 формулы изобретения известен из WO 2013/072273 A1.

Существует потребность в способе получения изображения образца, основанном на частицах, которые движутся в образце.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения изображения образца. Способ содержит этапы: (I) предоставление света первого состава; (II) выбор частицы из первой группы частиц, которые побуждаются к испусканию фотонов под воздействием света первого состава; (III) формирование света первого состава, чтобы обеспечить распределение интенсивности света, содержащее пространственно ограниченный минимум; (IV) применение распределения интенсивности света к образцу так, что частица локализована в пространственно ограниченном минимуме распределения интенсивности света; (V) обнаружение фотонов, испускаемых частицей; отслеживание перемещения частицы с помощью минимума распределения интенсивности света посредством (VI) перемещения распределения интенсивности света относительно образца так, что скорость испускаемых частицей фотонов остается минимальной, и (VII) получение фактического положения минимума распределения интенсивности света в образце в качестве фактического положения частицы в образце; (VIII) определение времени пребывания частицы для каждой из множества частей образца; и (IX) отображение распределения времени пребывания в образце.

Выгодные дальнейшие разработки раскрытия изобретения следуют из формулы изобретения, описания и чертежей. Преимущества признаков и сочетаний множества признаков, упомянутых в этом описании служат только в качестве примеров и могут быть использованы в качестве альтернативы или совокупно без необходимости вариантов осуществления, соответствующих раскрытию изобретения, которые должны достичь этих преимуществ. Без изменения объема защиты, как это определено в прилагаемой формуле изобретения, нижеследующее имеет место в отношении раскрытия первоначальной заявки и патента: дополнительные признаки могут быть взяты из чертежей, в частности, из показанных конструкций и размеров множества компонентов относительно друг друга, а также из их относительного расположения и их функционального соединения. Сочетание признаков различных вариантов осуществления раскрытия изобретения или признаков различных пунктов формулы изобретения независимо от выбранных ссылок формулы изобретения также возможно, и при этом мотивировано. Это также относится к признакам, которые проиллюстрированы на отдельных чертежах, или о которых было упомянуто при их описании. Эти признаки также могут быть объединены с признаками различных пунктов формулы изобретения. Кроме того, возможно, что дополнительные варианты осуществления этого раскрытия не имеют всех признаков, упомянутых в формуле изобретения. Они могут даже не иметь всех признаков, упомянутых в независимых пунктах формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее, раскрытие изобретения дополнительно поясняется и описывается со ссылкой на предпочтительные примерные варианты осуществления, проиллюстрированные на чертежах.

Фиг. 1 иллюстрирует примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения варианта осуществления способа в соответствии с настоящим раскрытием изобретения, при этом прибор содержит один источник света, точечный детектор и камеру.

Фиг. 2 показывает другой примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения другого варианта осуществления способа в соответствии с настоящим раскрытием изобретения, при этом прибор содержит один источник света и камеру.

Фиг. 3 показывает частицу в области минимума распределения интенсивности для побуждения частицы испускать фотоны.

Фиг. 4 показывает интенсивность из распределения интенсивности в соответствии с фиг. 3, в зависимости от положения вдоль линии профиля, кроме того, показана результирующая скорость фотонов, испускаемых частицей в соответствии с фиг. 3.

Фиг. 5 показывает ситуацию после перемещения частицы из ее положения в соответствии с фиг. 3.

Фиг. 6 показывает ситуацию после того, как распределение интенсивности последовало за перемещением частицы.

Фиг. 7 показывает дополнительный примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения дополнительного варианта осуществления способа по настоящему раскрытию изобретения, при этом прибор содержит один источник света, включающий в себя источник белого света и селектор, а также три расположенных рядом точечных детектора.

Фиг. 8 показывает еще один примерный вариант осуществления прибора в соответствии с настоящим раскрытием изобретения для выполнения еще одного варианта осуществления способа по настоящему раскрытию изобретения, при этом аппарат содержит два источника света и четыре расположенных рядом точечных детектора.

Фиг. 9 показывает распределение интенсивности света и распределение интенсивности сигнала отключения, вмещенное в распределение интенсивности света в сечении по оси Х вдоль фокальной плоскости; а также

Фиг. 10 показывает эффективную функцию h_eff рассеяния точки, полученную из распределения интенсивности в соответствии с фиг. 9.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Частица, чье перемещение в образце отслеживается в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой одиночную молекулу, группу молекул, движущихся вместе, комплекс, квантовую точку, отражающую частицу золота или тому подобное.

Процессом, лежащим в основе эмиссии фотонов частицей, подверженной воздействию света, может быть флуоресценция. Тем не менее, многие другие процессы также могут быть использованы в качестве основы для испускания фотонов, например, рассеяние света.

Соответствующий процесс, вызывающий эмиссию фотонов, может быть связан со свойствами самой частицы, подлежащей отслеживанию, или маркера, в частности, красителя, маркирующего частицу, подлежащую отслеживанию.

В способе по настоящему изобретению распределение интенсивности света, прикладываемое к образцу, характеризуется наличием пространственно ограниченного минимума. Как и в случае с подавляющим флуоресценцию светом, используемым в STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии, это распределение интенсивности может быть сформировано с помощью интерференционной картины одного или более когерентных световых пучков, в которой пространственно ограниченный минимум представляет собой точку практически нулевой интенсивности интерференционной картины. Таким образом, может быть обеспечен минимум с малыми пространственными размерами. В частности, пространственные размеры минимума могут быть меньше, чем дифракционный предел.

В отличие от STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии, однако, свет, отображающий это конкретное распределение интенсивности, не используется для подавления флуоресценции. Вместо этого, он используется для побуждения отслеживаемой частицы к эмиссии фотонов, подлежащих обнаружению, в качестве измерительного сигнала. Кроме того, образец не сканируется с помощью минимума распределения интенсивности, а распределение интенсивности только непрерывно перемещается по отношению к образцу так, что скорость фотонов, испускаемых частицей и впоследствии обнаруживаемых, минимизируется. Сведенная к минимуму или минимальная скорость фотонов означает, что частица по-прежнему локализуется в положении минимума распределения интенсивности света. И наоборот, увеличивающаяся скорость фотонов означает, что частица стремится покинуть минимум распределения интенсивности света; и что положение минимума должно быть отрегулировано, чтобы отслеживать перемещение частицы.

В способе из настоящего изобретения фотоны или положения их обнаружения не используются для определения фактического положения частицы в образце. Таким образом, нет никакой необходимости получать большое число фотонов для каждого положения частицы в образце, чтобы определить соответствующее положение с высокой точностью. Вместо этого, фактическое положение минимума распределения интенсивности света в образце принимается в качестве фактического положения частицы в образце.

При подходящих условиях перемещение частицы может быть отслежено с пространственной точностью, которая значительно ниже дифракционного предела. Кроме малых размеров минимума и высокой точности в перемещении распределения интенсивности света эти подходящие условия включают достаточно резкое увеличение интенсивности света снаружи от минимума, а также достаточно быструю перенастройку положения минимума в ответ на возрастающую скорость фотонов.

Поскольку не требуется, чтобы частица испускала много фотонов в способе по настоящему изобретению, риск обесцвечивания частиц сильно снижается. Следовательно, даже частицы, которые склонны к обесцвечиванию, могут быть отслежены в течение более длительных периодов времени или на больших расстояниях, преодолеваемых частицей в образце. Кроме того, в отличие от методов, основанных на STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии, образец подвергается только воздействию распределения интенсивности, содержащему минимум. Таким образом, не нужно выставлять свет, в соответствие с другим пучком света, ни пространственно, ни в отношении его длины волны. Из-за этого, оптическая настройка для применения способа в соответствии с настоящим изобретением значительно менее сложна, чем у STED или RESOLFT флуоресцентного микроскопа.

Существует также еще одно отличие для STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии. В способе, согласно настоящему изобретению, распределение интенсивности света с минимумом необходимо только для того, чтобы иметь небольшую абсолютную интенсивность при условии, что свет уже вызывает эмиссию фотонов при низких интенсивностях. Тем более не требуется, чтобы насыщение возбуждения для эмиссии фотонов достигалось за пределами нулевой точки, чтобы достичь пространственной точности ниже дифракционного предела. Вместо этого, во многих случаях, является предпочтительным, чтобы возбуждение непрерывно возрастало с увеличением расстояния до нулевой точки. Последнее, но немаловажное, является признаком настоящего изобретения, состоящим в том, что число фотонов, испускаемых отслеживаемой частицей, сводится к минимуму и, таким образом, риск ее обесцвечивания также минимизируется.

Перемещение или отклонение распределения интенсивности относительно, то есть по отношению к образцу, для непрерывной минимизации скорости обнаруженных детектором фотонов может быть основано на методе проб и ошибок. То есть распределение интенсивности перемещают на экспериментальной основе небольшими шагами. Если перемещение вызывает уменьшение скорости обнаруживаемых фотонов, схожей со скоростью испускаемых фотонов, распределение интенсивности перемещают далее в том же направлении. В противном случае, т. е. если перемещение вызывает увеличение скорости обнаруживаемых фотонов, распределение интенсивности перемещают в другом направлении, например, в противоположном направлении. Различные подходящие алгоритмы и варианты осуществления, подобные тем, что указаны ключевыми словами "отслеживающий алгоритм" и "нечеткая логика", известны специалистам в области техники.

Из STED или RESOLFT флуоресцентной микроскопии известны различные методы для формирования распределения интенсивности подавляющего флуоресценцию света, содержащего минимум, см. например, Klar и др., PNAS, 97 (2000), Westphal и др., Phys. Rev. Lett. 94 (2005) и Donnert и др., PNAS, 103 (2003), раскрытие которого включено в данное описание по ссылке во всей ее полноте. Любой из этих методов может быть также использован в способе согласно настоящему изобретению для формирования распределения интенсивности света, побуждающего отслеживаемую частицу испускать фотоны. Чтобы дать лишь несколько примеров, фазовые фильтры, пространственные модуляторы света, 4Pi устройства, использующие противоположные линзы и тому подобное, могут использоваться для формирования распределения интенсивности света, содержащего минимум.

Для перемещения или отклонения распределения интенсивности света с минимумом относительно образца может быть применен сканер, как известно также из STED и RESOLFT флуоресцентной микроскопии. Например, такой сканер содержит акустооптические или электрооптические дефлекторы, вращающиеся зеркала, пьезоэлектрические приводы, с помощью которых образец регулируется по отношению к световым пучкам, или пьезоэлектрические приводы, которые приводят в действие линзы объектива и, с помощью которых световые пучки регулируются по отношению к образцу.

Альтернативно или дополнительно к отклонению распределения интенсивности света перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца также может быть выполнено путем сдвига образца относительно распределения интенсивности света, содержащего минимум. Перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца требует только относительного перемещения между распределением интенсивности света с минимумом и образцом. В частности, перемещение распределения интенсивности света с минимумом относительно образца в направлениях x и у может быть достигнуто путем отклонения распределения интенсивности света, а перемещение распределения интенсивности света с минимумом по отношению к образцу в направлении z может быть достигнуто путем сдвига образца. Направление z может быть направлением ортогональным к плоскости основной протяженности поверхности образца, по которой распределение интенсивности света применяется к образцу, а направления x и у могут простираться вдоль или параллельно этой плоскости основной протяженности.

В соответствии со способом из настоящего изобретения минимум распределения интенсивности света может быть пространственно ограничен в одном, двух или трех измерениях, т.е. минимум может простираться вдоль плоскости, вдоль линии или вокруг точки. Для отслеживания перемещения частицы распределение интенсивности затем перемещается или отклоняется относительно образца во всех направлениях этих измерений, в которых минимум ограничен. Движение в направлении, в котором минимум не ограничен, не будет приводить к уменьшению скорости фотонов, испускаемых частицей и, таким образом, не может быть эффективно использовано. Это также означает, что перемещение частицы в этом направлении не может быть отслежено. Следовательно, это направление, предпочтительно, ориентируется так, что перемещение частицы в этом направлении не ожидается. Во многих случаях перемещения частиц в образце так или иначе ограничены вдоль направления определенной структуры. В случае двумерного образца перемещение частицы в направлении третьего измерения исключается в принципе.

Уже упоминалось, что распределение интенсивности с минимумом может быть сформировано как интерференционная картина одного или более когерентных парциальных световых пучков, в которой пространственно ограниченный минимум является точкой практически нулевой интенсивности. Интерференционная картина может, например, быть образована из одного когерентного пучка путем модуляции его волновых фронтов или из множества наложенных друг на друга когерентных световых пучков.

В одном варианте осуществления способа из настоящего изобретения модуляцию волновых фронтов одного когерентного светового пучка динамически изменяют так, что только одно- или двумерно ограниченный минимум распределения интенсивности света является попеременно пространственно ограниченным в различных пространственных измерениях. Например, фазовое отношение может изменяться между первым и вторым фазовым отношением так, что минимум ограничен кольцом в плоскости x-y - в случае первого фазового отношения, и так, что минимум ограничен в направлении z - в случае второго фазового отношения. Подходящие распределения интенсивности света для ограничения минимума либо в направлении x и у, либо в направлении z, а также соответствующие модуляции волновых фронтов когерентного светового пучка описаны в J. Keller at al.: "Efficient fluorescence inhibition patterns for RESOLFT microscopy", Optics Express 3361, Vol. 15, No. 6 (2007), а также B. HArke et al., NanoLetters, 8, 1309 (2008), раскрытия которых включены в данное описание по ссылке во всей ее полноте. J. Keller и др. и B. Harke и др. используют свои модели для подавления флуоресценции. Такие же модели, однако, могут быть использованы в способе из настоящего изобретения для распределения интенсивности света, побуждающего частицу эмитировать фотоны. В другой разновидности этого варианта осуществления из настоящего изобретения разные последовательные фазовые отношения могут привести к минимумам линейного или плоскостного вида, которые ориентированы в разных направлениях. Эти минимумы могут быть описаны как вращающиеся полосы и содержать точку или линию в качестве их пространственного пересечения. Если быстро переключаться между такими фазовыми отношениями и если минимум скорости фотонов, испускаемых частицей, локализован либо отдельно для каждого фазового отношения, либо во всему изменению фазовых отношений, то перемещение частицы в образце может быть отслежено во всех трех измерениях.

В способе из настоящего изобретения свет может состоять из световых компонентов различных длин волн. Кроме того, свет может изменяться по длине волны, чтобы иметь возможность отслеживать различные частицы, принадлежащие к разным группам частиц. Во всех этих случаях, является преимуществом, если распределение интенсивности света формируется так, что пространственное положение его пространственно ограниченного минимума не изменяется при изменении длины волны света.

В способе из настоящего изобретения фотоны, испускаемые частицей, не обязательно должны обнаруживаться с помощью матрицы двухмерного детектора. Вместо этого достаточно использовать точечный детектор для обнаружения фотонов, так как отслеживание в первую очередь зависит от скорости этих фотонов. Текущее положение частицы в образце будет определяться исходя из текущего положения распределения интенсивности с минимумом относительно образца. Вывод об этом положении может быть сделан из положений тех устройств, с помощью которых распределение интенсивности перемещается относительно образца, например текущим положением сканера, используемого для перемещения распределения интенсивности. Положение распределения интенсивности относительно образца может также быть непосредственно определено с помощью, например, обнаружения испускаемых частицей фотонов камерой, получающей изображение образца, и путем оценки изображения распределения интенсивности света, состоящего из этих фотонов, в камере. В соответствии с принципами локализации это определение также позволяет достичь точности положения за дифракционным пределом.

Кроме того, камера, получающая изображение образца может быть использована для определения начального положения частицы путем освещения образца светом, побуждающим частицу эмитировать фотоны, без пространственно структурированного света. В случае, когда обнаруживаются две или более частиц, которые испускают фотоны, и которые не могут быть отслежены отдельно друг от друга, возможно фотохимическим способом обесцветить лишние частицы путем целенаправленного применения высоких интенсивностей света, в том виде как они, например, присутствуют в максимумах распределения интенсивности света, примыкающих к его минимуму. Такое обесцвечивание возмущающих частиц также может быть применено, если увеличение скорости обнаруживаемых фотонов происходит не из-за отслеживаемой переместившейся частицы, а из-за другой частицы подобного рода, пересекающей путь отслеживаемой частицы. Эта другая частица может, например, быть распознана через камеру посредством большого числа фотонов, испускаемых дополнительно вдали от минимума распределения интенсивности света.

Камера, получающая изображение образца, может быть также использована для определения направления перемещения частицы из положений, где фотоны, испускаемые частицей, обнаруживаются камерой. Для этого определения, также возможно, чтобы выполнялась локализация частиц, при этом локализация основывается на фотонах, испускаемых частицей, когда она покидает минимум распределения интенсивности света. Здесь, однако, не требуется, чтобы локализация выполнялась с высокой точностью. Таким образом, не требуется, чтобы частица испускала много фотонов, так как испускаемые фотоны используются только для определения направления, в котором минимум распределения интенсивности света, необходимо переместить, чтобы следовать за частицей. Тем не менее, испускаемые фотоны не требуются для достижения желаемой пространственной точности в отслеживании частицы. Вместо этого пространственная точность достигается за счет последовательной минимизации скорости фотонов, испускаемых частицей и, таким образом, за счет формы и/или расположения минимума распределения интенсивности света. Эта минимизация также может быть основана на методе проб и ошибок для повторной регулировки пространственно ограниченного минимума распределения интенсивности света.

Не требуется, однако, использовать полную камеру для определения направления перемещения частицы на основе положений, где фотоны, испускаемые частицей, обнаруживаются. Достаточная информация для такого определения является также доступной при использовании по меньшей мере двух расположенных рядом точечных детекторов для отслеживания частицы в одном измерении или по меньшей мере трех расположенных рядом точечных детекторов для отслеживания частицы в двух или трех измерениях. Аналогичная концепция используется в известных четырехквадрантных фотодиодах для определения положения лазерного пучка, например. Кроме того, в S.J. Sahl et al.: Fast molecular tracking maps nanoscale dynamics of plasma membrane lipids, PNAS, April 13, 2010, Vol. 107, No. 15, 6829-6834, раскрытие которой включено в настоящее описание по ссылке во всей ее полноте, раскрыто использование трех, расположенных рядом точечных детекторов, снабженных тремя входными поверхностями волокон, для отслеживания флуоресцентной частицы в стандартной процедуре молекулярного отслеживания. Эти точечные детекторы также могут быть использованы в способе из настоящего изобретения для обнаружения фотонов, испускаемых частицей.

Поскольку способ в соответствии с настоящим изобретением направлен на минимизацию скорости фотонов, испускаемых частицей, фон, который обнаруживается в дополнение к тем фотонам, которые являются объектом исследования, приобретает особое значение. Фон может быть, например, из-за света, который применяется к образцу, чтобы побудить частицы испускать фотоны, и который рассеивается на детекторе, или из-за автофлюоресценции образца. Для того чтобы минимизировать влияние фона, свет, побуждающий частицы испускать фотоны может быть применен к образцу в импульсах, и фотоны, испускаемые частицами могут быть обнаружены в течение ограниченного интервала времени после каждого из импульсов света. Этот временной интервал или окно может быть отрегулирован так, чтобы достичь максимального соотношения сигнал-шум. Другим подходом для снижения фона является выбор частицы так, чтобы она побуждалась испускать фотоны светом через многофотонный процесс. Тогда, фотоны, испускаемые частицей, имеют в значительной степени более короткую длину волны, чем свет, который применяется к образцу, и фон, благодаря этому свету может быть легко подавлен по длине волны. Кроме того, многофотонное возбуждение или поглощение ограничивается областью, окружающей частицу во всех трех измерениях. Многофотонное возбуждение не распространяется на увеличенном объеме образца, таким образом, сводя к минимуму нежелательное возбуждение (авто)флуоресценции. Это ограничение многофотонного возбуждения хорошо известно из микроскопии многофотонного флуоресцентного возбуждения.

В способе из настоящего изобретения свет для побуждения частицы испускать фотоны может быть выбран по длине волны из белого света. Изменяя этот выбор, могут быть отслежены различные частицы, принадлежащие к разным группам частиц. Источники света, обеспечивающие белый свет, как правило, известны. Они представляют собой, например, доступные от NKT Photonics, Дания. Эти источники света обеспечивают импульсы света практически постоянной интенсивности в расширенном диапазоне длин волн. Свет, используемый в способе из настоящего изобретения, может быть выбран из этого диапазона.

В одном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению фотоны, испускаемые отслеживаемой частицей, дополнительно анализируются для определения по меньшей мере одного параметра, выбранного из группы параметров, состоящей из длины волны, поляризации, абсолютной скорости, относительных чисел, обнаруженных расположенными рядом точечными детекторами, совпадения и момента времени после каждого импульса света. Это позволяет собрать дополнительную информацию или подробности об отслеживаемой частице. Эти подробности могут изменяться на треке частицы. Результирующие изменения в длине волны фотонов и момента времени фотонов после каждого импульса света можно проанализировать для мониторинга эти подробностей. В частности, может быть применен подобный метод, описанный в A. Schönle and S.W. Hell: Fluorescence nanoscopy goes multicolor, Nature Biotechnology, Vol. 25, No. 11, November 2007, 1243-1235, раскрытие которого включено в настоящее описание по ссылке во всей ее полноте. Анализ подробностей о частице в этом способе является высокочувствительным. Это связано с тем, что только одиночная частица отдает анализируемые фотоны, т. е. нет никакого разбавления фотонами от других частиц с другими подробностями. Это, в частности, обеспечивает точную классификацию отслеживаемой частицы на основе тонких отличий длины волны или других характеристик фотонов, испускаемых частицей.

Анализ фотонов, приходящих от частицы, также позволяет определить, содержит ли частица один или более светоизлучающих центров, и остаются ли эти светоизлучающие центры, вместе или отдельно друг от друга в какой-то момент времени. Так, например, могут контролироваться связи и комплексы с учетом их индивидуальных партнеров по связи или партнеров по комплексу, соответственно.

В способе из настоящего изобретения детектор, используемый для обнаружения фотонов, испускаемых частицей, также обнаруживает все фотоны, испускаемые другими частицами, принадлежащими к той же группе частиц, и также локализующимися в зоне обнаружения детектора. Способ из настоящего изобретения, тем не менее, будет работать должным образом только, если одиночная частица испускает все фотоны, обнаруженные и рассмотренные при скорости фотонов, сведенной к минимуму для отслеживания частицы. Чтобы подтвердить, что это условие выполняется, фотоны, испускаемые из зоны обнаружения детектора, т. е. из зоны, содержащей минимум распределения интенсивности света, могут быть проанализированы для определения одного или более из перечисленных выше параметров, и определенные параметры могут быть проверены на предмет соответствия одинарной частице, испускающей анализируемые фотоны. В частности, в этом контексте, параметр абсолютной скорости фотонов, испускаемых частицей, может также называться яркостью частицы. Если фотоны испускаются более чем одной частицей, все, кроме одной частицы должны быть выключенными или обесцвеченными, или другая частица должна быть выбрана в другой части образца.

Способ в соответствии с настоящим изобретением может быть применен для отслеживания переключаемой частицы, например переключаемой молекулы, причем свет для побуждения эмиссии фотонов может вызвать активацию переключаемой молекулы из состояния, в котором частица не может быть побуждена испускать фотоны, в состояние флуоресценции, в котором частица может бы