Способы лечения состояний, связанных с masp-2 зависимой активацией комплемента

Способы лечения состояний, связанных с masp-2 зависимой активацией комплемента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

Эта заявка заявляет приоритет предварительной заявки № 61/473698, поданной 8 апреля 2011 года, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ЗАЯВЛЕНИЕ, КАСАЮЩЕЕСЯ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, связанный с этой заявкой, предоставляется в текстовом формате вместо бумажной копии и настоящим включен посредством ссылки в эту спецификацию. Имя текстового файла, содержащего перечень последовательностей, представляет собой MP_1_0126_US2_SequenceListingasFiled.txt. Текстовый файл представляет собой файл размером 110 КB; был создан 30 марта 2012 года; и представляется с помощью EFS-Web с подачей спецификации.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Система комплемента обеспечивает механизм раннего действия для инициирования, усиления и регулирования иммунного ответа на микробную инфекцию и другие острые поражения (M.К. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, в Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Нью-Йорк) в организме человека и других позвоночных. Несмотря на то, что активация комплемента обеспечивает чрезвычайно важную первую линию обороны против возможных возбудителей заболеваний, активности комплемента, которые стимулируют защитный иммунный ответ, также могут представлять потенциальную угрозу для хозяина (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Imrnunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24: 219-228, 1994). Например, протеолитические продукты C3 и C5 привлекают и активируют нейтрофилы. Активированные нейтрофилы, несмотря на то, что являются совершенно необходимыми для защиты организма, действуют неизбирательно при своем высвобождении деструктивных ферментов, и могут вызывать повреждения органов. Кроме того, активация комплемента может привести к депозиции литических компонентов комплемента на близлежащих клетках-хозяевах, как и на микробных мишенях, приводя в результате к лизису клеток-хозяев.

Система комплемента также вовлечена в патогенез многих острых и хронических заболеваний, в том числе: инфаркт миокарда, инсульт, синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), реперфузионное повреждение, септический шок, подтекание капилляров, следующее за термическими ожогами, послекардиопульмональное обходное воспаление, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, миастения gravis и болезнь Альцгеймера. Почти при всех этих состояниях комплемент является не причиной, а одним из нескольких факторов, вовлеченных в патогенез. Тем не менее, активация комплемента может являться основным патологическим механизмом и представляет эффективный пункт для клинического управления при многих из этих болезненных состояний. Растущее понимание важности комплемент-опосредованного повреждения тканей при различных болезненных состояниях подчеркивает необходимость в эффективных комплемент-ингибирующих лекарственных препаратах. На сегодняшний день, экулизумаб (Solaris®), антитело против C5, является единственным комплемент-направленным лекарственным препаратом, который был одобрен для применения на людях. Кроме того, C5 представляет собой одну из нескольких эффекторных молекул, расположенных «ниже по течению» в системе комплемента, и блокада C5 не ингибирует активацию системы комплемента. Поэтому, ингибитор начальных стадий инициации активации комплемента мог бы иметь существенные преимущества по сравнению с ингибитором комплемента, действующим «ниже по течению».

В настоящее время общепризнано, что система комплемента может быть активирована при помощи трех различных путей: классического пути, лектинового пути и альтернативного пути. Классический путь обычно инициируется комплексом, который состоит из антител организма-хозяина, связанных с инородной частицей (т.е., антигеном) и, таким образом, требует предварительного воздействия антигена для формирования специфического гуморального ответа. Поскольку активация классического пути зависит от предварительного адаптивного иммунного ответа организма-хозяина, классический путь представляет собой часть приобретенной иммунной системы. В противоположность этому, как лектиновый, так и альтернативные пути являются независимыми от адаптивного иммунитета и являются частью естественной иммунной системы.

Активация системы комплемента приводит к последовательной активации зимогенов сериновой протеазы. Первой стадией при активации классического пути является связывание специфической узнающей молекулы, C1q, с антигенсвязывающими молекулами IgG и IgM. C1q связывается с проферментами сериновой протеазы C1r и C1s в виде комплекса, называемого C1. После связывания C1q с иммунным комплексом, происходит автопротеолитическое расщепление участка Arg-Ile в C1r, а затем C1r-опосредованное расщепление и активация С1s, который, таким образом, приобретает способность расщеплять C4 и C2. C4 расщепляется на два фрагмента, обозначенные как C4a и C4b, и, аналогично, C2 расщепляется на C2a и C2b. Фрагменты C4b способны образовывать ковалентные связи с соседними гидроксильными или аминными группами и образовывать C3-конвертазу (C4b2a) через нековалентное взаимодействие с C2a-фрагментом активированного C2. Конвертаза C3 (C4b2a) активирует С3 путем протеолитического расщепления на субкомпоненты C3a и C3b, приводя к образованию С5-конвертазы (C4b2a3b), который, путем расщепления C5, приводит к образованию мембраноатакующего комплекса (C5b в сочетании с С6, С7, С8 и C-9, также известного как «MAC»), который может нарушать клеточные мембраны, приводя к клеточному лизису. Активированные формы C3 и C4 (C3b и C4b) ковалентно размещаются на внешних поверхностях мишеней, которые распознаются рецепторами комплемента на многочисленных фагоцитах.

Независимо, первая стадия в активации системы комплемента через лектиновый путь также представляет собой связывание специфических распознающих молекул, которое следует за активацией ассоциированных проферментов сериновой протеазы. Однако, вместо связывания иммунных комплексов при помощи C1q, узнающие молекулы в лектиновом пути включают группу углевод-связывающих белков (маннан-связывающий лектин (MBL), H-фиколин, М-фиколин, L-фиколин и C-типа лектин CL-11), в совокупности именуемые лектинами. Смотри J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al,. Immunology 101:225-232 (2000)). Смотри также J. Luеt et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al., Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).

Ikeda et al. впервые продемонстрировали, что MBL, подобно C1q, может активировать систему комплемента через связывание с эритроцитами, покрытыми маннаном дрожжей, C4-зависимым образом (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 2.52:7451-7454, (3987)). MBL, член белкового семейства коллектинов, является кальций-зависимым лектином, который связывает углеводы с 3- и 4-гидроксильными группами, ориентированными в экваториальной плоскости пиранозного кольца. Выступающими лигандами для MBL, таким образом, являются D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, в то время как углеводы, не удовлетворяющие этому стерическому требованию, обладают недетектируемой для MBL аффинностью (Wets et al., Nature 360: 127-134, (1992)). Взаимодействие между MBL и моновалентными сахарами является крайне слабым, с константами диссоциации, как правило, в одноразрядном миллимолярном диапазоне. MBL достигает плотного, специфического связывания с гликановыми лигандами за счет авидности, т.е., за счет одновременного взаимодействия с несколькими моносахаридными остатками, расположенными в непосредственной близости друг от друга (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299: 129-136, (3992)). MBL распознает углеводные структуры, которые обычно декорируют микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, паразиты и некоторые вирусы. И наоборот, MBL не узнает D-галактозу и сиаловую кислоту, предпоследние и последние сахара, которые обычно декорируют «зрелые» сложные гликоконъюгаты, присутствующие на гликопротеинах плазматических и клеточных поверхностей клеток млекопитающих. Считается, что эта специфичность связывания стимулирует узнавание «чужеродных» поверхностей и помогает в защите от «самоактивации». Однако, MBL не связывается с высокой аффинностью с кластерами высокоманнозных «прекурсорных» гликанов на N-связанных гликопротеинах и гликолипидах, изолированных в эндоплазматическом ретикулуме и комплексе Гольджи клеток млекопитающих (Maynard et al., J. Biol. Chem 257:3788-3794, (1982)). Поэтому, поврежденные клетки являются потенциальными мишенями для лектинового пути активации через MBL-связывание.

Фиколины обладают типом лектинового домена, отличного от такового для MBL, который называется фибриноген-подобный домен. Фиколины связывают сахарные остатки Ca⁺⁺-независимым образом. В организме человека было выявлено три вида фиколинов (L-фиколин, М-фиколини и H-фиколин). Два сывороточных фиколина, L-фиколин и H-фиколин, совместно обладают специфичностью к N-ацетил-D-глюкозамину; при этом, H-фиколин также связывает N-ацетил-D-галактозамин. Различие в сахароспецифичности L-фиколина, H-фиколина, CL-11 и MBL означает, что разные лектины могут быть комплементарны и ориентированы на разные, хотя и перекрывающиеся, гликоконъюгаты. Эта концепция поддерживается недавним сообщением о том, что из известных лектинов лектинового пути лишь L-фиколин специфически связывается с липотейхоевой кислотой, глюкоконьюгатом клеточной стенки, обнаруженным во всех грамположительных бактериях (Lynch et al., J. Immunol. 172: 1198-1202, (2004)). Коллектины (т.е., MBL) и фиколины не обладают значительным сходством аминокислотных последовательностей. Однако, две группы белков обладают похожей доменной организацией и, подобно C1q, собраны в олигомерные структуры, которые максимально увеличивают возможности многосайтного связывания.

Концентрации MBL в сыворотке сильно варьируется в популяции здоровых людей, и это генетически контролируется полиморфизмом/мутациями как в промоторной, так и в кодирующей областях гена MBL. Как для белка острой фазы, экспрессия MBL также увеличивается во время воспаления. L-фиколин присутствует в сыворотке в концентрациях, аналогичных таковым для MBL. Таким образом, L-фиколиновая ветвь лектинового пути по силе сопоставима с плечом MBL. MBL и фиколины также могут функционировать в качестве опсонинов, которые позволяют фагоцитам нацеливаться на поверхности, декорированные MBL и фиколином (смотри Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunohiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J. Immunol, 174(1):418-25 (2005). Эта опсонизация требует взаимодействия этих белков с фагоцитарными рецепторами (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169: 1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)), тождественность которых не была установлена.

MBL человека формирует специфическое и высокоаффинное взаимодействие через свой коллагено-подобный домен с уникальными C1r/C1s-подобными сериновыми протеиназами, называемыми MBL-связанными сериновыми протеазами (MASP). На сегодняшний день, было описано три MASP. Во-первых, один фермент «MASP» был выделен и охарактеризован в качестве фермента, ответственного за инициирование каскада комплемента (т.е., расщепление C2 и C4) (Matsushita et al., J. Exp. Med. 176(6): 1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol 750:571-578, (1993)). Впоследствии было установлено, что активность МASP представляет собой, по сути, смесь двух протеаз: MASP-1 и MASP-2 (Tiel et al., Nature 386:506-510, (1997)). Однако было показано, что комплекс MBL-MASP-2 сам по себе достаточен для активации комплемента (Vorup-Jensen et al., J. Immunol 165:2093-2100, (2000)). Кроме того, только MASP-2 расщеплял C2 и C4 с высокой эффективностью (Ambrus et al., J. Immunol, 770: 1374-1382, (2003)). Поэтому, MASP-2 представляет собой протеазу, ответственную за активирование C2 и C4 для образования C3-конвертазы, C4b2a. В этом заключается существенное отличие от C1-комплекса классического пути, где скоординированное действие двух специфических сериновых протеаз (C1r и C1s) приводит к активации системы комплемента. Кроме того, была изолирована третья новая протеаза, MASP-3 (Dahl, М.Р., et al., Immunity 75: 127-35, 2001). MASP-1 и MASP-3 представляют собой продукты альтернативного сплайсинга одного и того же гена.

MASP разделяет идентичные доменные организации с таковыми C1r и C1s, ферментативными компонентами C1-комплекса (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). Эти домены включают N-концевой домен C1r/C1s/VEGF морского ежа/морфогенетического белка костей (CUB), домен, подобный эпидермальному фактору роста, второй CUB-домен, домены тандема комплемент-контролирующих белков и домен сериновой протеазы. Как и в случае C1-протеазы, активация MASP-2 происходит через расщепление связи Arg-Ile, прилегающей к домену сериновой протеазы, которая расщепляет фермент на дисульфидсвязанные цепи A и B, последняя состоит из домена сериновой протеазы.

MBL также может связываться с альтернативно-сплайсированной формой MASP-2, известной как MBL-ассоциированный белок массой 19 кДа (MAp19) или небольшой MBL-ассоциированный белок (sMAP), в которой отсутствует каталитическая активность MASP-2 (Stover, J. Immunol, 752:3481-90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). Map19 включает в себя первые два домена MASP-2, следующие после дополнительной последовательности из четырех уникальных аминокислот. Функция Map 19 непонятна (Degn et al, J. Immunol. Methods, 2011). Гены MASP-1 и MASP-2 расположены на 3 и 1 хромосомах человека, соответственно (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002)).

Несколько линий доказательства свидетельствуют о том, что существуют различные комплексы MBL-MASP, и большая часть MASP в сыворотке крови не образует комплексы с MBL (Thiel, et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). Как H-, так и L-фиколин связывается со всеми MASP и активирует лектиновый путь комплемента, как это делает MBL (Dahl et al., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol 168: 3502-3506, (2002)). Как лектиновый, так и классический пути образуют общую C3-конвертазу (C4b2a), и два пути сходятся на этой стадии.

Лектиновый путь, по общему мнению, играет большую роль в защите организма от инфекции в наивном организме-хозяине. Убедительные доказательства причастности MBL к защите организма исходят из анализа пациентов со сниженными сывороточными уровнями функциональных MBL (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). Такие пациенты проявляют восприимчивость к рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям. Эти симптомы, как правило, являются выраженными в начале жизни, во время наблюдаемого окна восприимчивости, поскольку титр производимых по материнской линии антител убывает, но развивается до полного спектра реакций антител. Этот синдром часто является результатом мутаций в нескольких сайтах в коллагеновой части MBL, которые препятствуют правильному формированию MBL-олигомеров. Однако, поскольку MBL может функционировать в качестве опсонина, независимого от комплемента, неизвестно, в какой степени повышенная восприимчивость к инфекции обусловлена нарушением активации комплемента.

В отличие от классического и лектинового путей, никаких инициаторов альтернативного пути не было обнаружено для осуществления функций распознавания, которые в двух других путях выполняют C1q и лектины. В настоящее время общепризнано, что альтернативный путь спонтанно подвергается низкому уровню оборотной активации, которая может легко усиливаться на чужеродных или других аномальных поверхностях (бактериях, дрожжах, клетках, зараженных вирусом, или поврежденной ткани), у которых отсутствуют надлежащие молекулярные элементы, которые удерживают спонтанную активацию комплемента под контролем. Существует четыре белка плазмы, непосредственно участвующих в активации альтернативного пути: C3, факторы B и D и пропердин.

Несмотря на то, что существуют многочисленные свидетельства причастности классического и альтернативного путей комплемента к патогенезу неинфекционных заболеваний человека, роль лектинового пути только начинают оценивать. Недавние исследования предоставляют доказательства того, что активация лектинового пути может быть ответственна за активацию комплемента и связанного с этим воспаления при ишемии/реперфузионном повреждении. Collard et al., (2000) сообщили, что культивируемые клетки эндотелия, подвергнутые окислительному стрессу, связывают MBL и демонстрируют депозицию C3 при экспозиции с человеческой сывороткой (Collard et al., Am. J. Pathol 156: 1549-1556, (2000)). Кроме того, обработка человеческой сыворотки блокирующими моноклональными антителами против MBL подавляла MBL-связывание и активацию комплемента. Это обнаружение было распространено на крысиной модели ишемии миокарда-реперфузии, в которой крысы, подвергнутые лечению блокирующим антителом, направленным против MBL крысы, показали значительно меньше повреждения миокарда при окклюзии коронарных артерий, чем у крыс, подвергнутых лечению контрольным антителом (Jordan et al., Circulation 104: 1413-1418, (2001)). Молекулярный механизм связывания MBL с васкулярным эндотелием после окислительного стресса неясен; недавние исследования позволили предположить, что активация лектинового пути после окислительного стресса может быть опосредована связыванием MBL с васкулярными эндотелиальными цитокератинами, а не с гликоконьюгатами (Collard et al., Am. J. Pathol, 159: 1045-1054, (2001)). Другие исследования непосредственно связали классический и альтернативный пути с патогенезом ишемии/реперфузионного повреждения, и роль лектинового пути в этой болезни остается спорной (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

Недавнее исследование показало, что MASP-1 (и, возможно, MASP-3) требуется для преобразования фактора D, фермента активациии альтернативного пути, из его зимогенной формы в его ферментативно активную форму (смотри Takahashi M. et al., J. Exp. Med 207(1):29-37 (2010)). Физиологическое значение этого процесса подчеркивается отсутствием функциональной активности альтернативного пути в плазме мышей с недостатком MASP-1/3. Протеолитическая генерация C3b из натавного C3 требуется для функционирования альтернативного пути. Поскольку C3-конвертаза (C3bBb) альтернативного пути содержит C3b в качестве неотъемлемой субъединицы, вопрос о происхождении первых C3b через альтернативный путь представлялся головоломной проблемой и стимулировал значительное количество исследований.

C3 принадлежит к семейству белков (наряду с C4 и α-2 макроглобулином), которые содержат редкую посттрансляционную модификацию, известную как тиоэфирная связь. Тиоэфирная группа состоит из глутамина, чья концевая карбонильная группа образует ковалентную тиоэфирную связь с сульфгидрильной группой цистеина, расположенного на расстоянии трех аминокислот. Эта связь является нестабильной, и электрофильный глутамилтиоэфир может реагировать с нуклеофильными частями, такими как гидрокси- или амино- группы и, таким образом, образовывать ковалентную связь с другими молекулами. Тиоэфирная связь является достаточно стабильной при изоляции в гидрофобном кармане интактного C3. При этом, протеолитическое расщепление С3 до C3a и C3b приводит в результате к экспозиции высокоактивной тиоэфирной связи на C3b и, после нуклеофильной атаки соседних частей, содержащих гидрокси- или амино- группы, C3b становится ковалентно связанным с мишенью. В дополнение к хорошо задокументированной роли в ковалентном присоединении C3b к мишеням комплемента, также полагают, что тиоэфир C3 играет ключевую роль в инициировании альтернативного пути. Согласно общепринятой «теории топтания на месте», альтернативный путь инициируется формированием конвертазы жидкой фазы, iC3Bb, которая образуется из C3 с гидролизованным тиоэфиром (iC3; C3(H₂O)) и фактором B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopatol. 7: 143-162, (1984)). C3b-подобный C3(H₂O) образуется из нативного C3 путем медленного спонтанного гидролиза внутреннего тиоэфира в белке (Pangburn, M.K., et al., J. Exp, Med. 154:856-867, 1981). Благодаря активности конвертазы C3(H₂O)Bb, молекулы C3b депонируются на поверхности мишени, инициируя тем самым альтернативный путь.

Об инициаторах активизации альтернативного пути известно очень мало. Считается, что активаторы включают клеточные стенки дрожжей (зимозан), много очищенных полисахаридов, эритроциты кролика, некоторые иммуноглобулины, вирусы, грибки, бактерии, опухолевые клетки животных, паразиты и поврежденные клетки. Единственное свойство, общее у этих активаторов, является наличие углеводов, однако сложность и разнообразие углеводных структур затрудняет установление общих молекулярных детерминант, которые распознаются. Общепризнано, что активация альтернативного пути контролируется с помощью тонкого баланса между ингибирующими регуляторными компонентами этого пути, такими как Фактор Н, Фактор I, DAF, и CR1 и пропердин, который представляет собой единственный положительный регулятор альтернативного пути (см. Schwaebie W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1): 17-21 (1999)).

В добавление к явно нерегулируемому механизму активации, описанному выше, альтернативный путь также может обеспечить эффективное усиление петли для C3-конвертазы (C4b2a) лектинового/классического пути, поскольку любой образованный C3b может принимать участие вместе с фактором B в формировании C3-конвертазы (C3bBb) дополнительного альтернативного пути. C3-конвертаза альтернативного пути стабилизируется за счет связывания с пропердином. Пропердин увеличивает время полужизни C3-конвертазы альтернативного пути в шесть-десять раз. Добавление C3b к C3-конвертазе альтернативного пути приводит к формированию C5-конвертазы альтернативного пути.

Все три пути (т.е., классический, лектиновый и альтернативный), как полагают, сходятся в C5, который расщепляется с образованием продуктов с несколькими провоспалительными действиями. Конвергентный путь был назван как терминальным путем комплемента. C5a представляет собой самый эффективный анафилатоксин, вызывающий изменения в гладких мышцах и сосудистом тонусе, а также сосудистой проницаемости, он также является эффективным хемотаксином и активатором как нейтрофилов, так и моноцитов. С5а-опосредованная клеточная активация может значительно усиливать воспалительные реакции путем индуцирования высвобождения нескольких дополнительных воспалительных медиаторов, включая цитокины, гидролитические ферменты, метаболиты арахидоновой кислоты и активные формы кислорода. Расщепление C5 приводит к образованию C5b-9, также известному как мембраноатакующий комплекс (MAC). Сейчас имеются убедительные доказательства того, что сублитическое депонирование MAC может играть важную роль в воспалении, в дополнение к своей роли в качестве литического порообразующего комплекса.

В дополнение к своей важной роли в иммунной защите, система комплемента способствует повреждению тканей при многих клинических состояниях. Таким образом, существует настоятельная необходимость разработки терапевтически эффективных ингибиторов комплемента для предотвращения этих неблагоприятных эффектов.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Это краткое изложение приводится для введения набора понятий в упрощенной форме, которые также приводятся ниже в Подробном описании. Это краткое изложение не предназначено для определения ключевых характеристик заявленного предмета рассмотрения, как не предназначено и для использования в качестве вспомогательного средства при определении объема заявленного предмета рассмотрения.

В одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ ингибирования неблагоприятных эффектов MASP-2-зависимой активации комплемента у живого субъекта. Способ включает в себя стадию введения субъекту, который в этом нуждается, количества MASP-2 ингибирующего агента, эффективного для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента. В другом аспекте изобретения, MASP-2-ингибирующий агент ингибирует активацию комплемента через лектин-зависимую MASP-2-систему без значительного ингибирования активации комплемента через классическую или C1q-зависимую систему, так, что C1q-зависимая система остается функциональной.

В некоторых вариантах осуществления этих аспектов изобретения, MASP-2-ингибирующий агент представляет собой антитело анти-MASP-2 или его фрагмент. В дополнительных вариантах осуществления, антитело анти-MASP-2 обладает ослабленными эффекторными функциями. В некоторых вариантах осуществления, MASP-2-ингибирующий агент представляет собой MASP-2-ингибирующий пептид или непептидный MASP-2-ингибитор.

В другом аспекте, настоящее изобретение предоставляет композиции для ингибирования неблагоприятных эффектов MASP-2-зависимой активации комплемента, содержащие терапевтически эффективное количество MASP-2-ингибирующего агента и фармацевтически приемлемый носитель. Также предоставляются способы изготовления лекарственного средства для применения при ингибировании неблагоприятных эффектов MASP-2-зависимой активации комплемента у живых субъектов, которые в этом нуждаются, содержащего терапевтически эффективное количество MASP-2-ингибирующего агента в фармацевтически приемлемом носителе. Также предоставляются способы изготовления лекарственных препаратов для применения при ингибировании MASP-2-зависимой активации комплемента для лечения каждого из состояний, болезней и расстройств, описанных в настоящем документе ниже.

Способы, композиции и лекарственные препараты по изобретению полезны для ингибирования неблагоприятных эффектов MASP-2-зависимой активации комплемента in vivo у субъектов-млекопитающих, включая людей, страдающих от острого или хронического патологического состояния или травмы, как изложено далее в настоящем документе.

В другом аспекте изобретения представляются способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего от или подверженного риску пароксизмальной ночной гемоглобинурии, включающие введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2 зависимой активации комплемента.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего от или подверженного риску развития фактор H-независимого атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS), включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2 зависимой активации комплемента.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ снижения вероятности того, что субъект с риском развития атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS) будет страдать от клинических симптомов, связанных с aHUS, включающий: (a) определение наличия у субъекта генетического маркера, как известно, связанного с aHUS; (b) периодический мониторинг субъекта на наличие или отсутствие по крайней мере одного симптома, выбранного из группы, включающей анемию, тромбоцитопению, почечную недостаточность и повышение уровня креатинина; и (c) введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента при определении наличия по крайней мере одного из анемии, тромбоцитопении, почечной недостаточности или повышения уровня креатинина, где композицию вводят в эффективном количестве и в течение достаточного периода времени для улучшения указанного одного или более симптомов.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего от или подверженного риску развития атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS), на фоне инфекции, включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-активации комплемента.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ лечения субъекта, страдающего от атипичного гемолитическиого уремического синдрома (aHUS), включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента, где введение MASP-2-ингибирующего агента осуществляется через внутривенный катетер или другим способом доставки при помощи катетера.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ уменьшения вероятности развития нарушения функции почек у субъекта с риском развития гемолитического уремического синдрома (HUS), включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ лечения субъекта, страдающего от гемолитического уремического синдрома (HUS), включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента, где введение MASP-2-ингибирующего агента субъекту осуществляется через внутривенный катетер или при помощи другого способа доставки с использованием катетера.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ лечения субъекта, страдающего от тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), или демонстрирует симптомы, согласующиеся с диагнозом ТТР, включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента, где введение MASP-2-ингибирующего агента субъекту осуществляется через внутривенный катетер или при помощи другого способа доставки с использованием катетера.

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ лечения субъекта, страдающего от рефракторной тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.

В другом аспекте изобретения, представлены способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего криоглобулинемией, включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.

В другом аспекте изобретения, представлены способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего от синдрома холодовой агглютинации, включающий введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.

В другом аспекте изобретения, представлены способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего глаукомой, включающие введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.

В другом аспекте изобретения, представлены способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта с риском развития или страдающего от острого лучевого синдрома, включающие введение субъекту композиции, содержащей количество MASP-2-ингибирующего агента, эффективное для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента. В некоторых вариантах осуществления, анти-MASP-2-ингибирующий агент представляет собой антитело анти-MASP-2. В некоторых вариантах осуществления, MASP-2-ингибирующий агент вводят профилактически субъекту перед воздействием облучения (например, перед началом лечения радиацией, или перед ожидаемым воздействием облучения). В некоторых вариантах осуществления, MASP-2-ингибирующий агент вводят в течение от 24 до 48 часов после облучения. В некоторых вариантах осуществления, MASP-2-ингибирующий агент вводят перед и/или после облучения в количестве, достаточном для улучшения одного или более симптомов, связанных с острым лучевым синдромом.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеупомянутые аспекты и многие присутствующие достоинства данного изобретения станут более легкими для оценки, так как становятся более понятными путем отсылки к нижеприведенному подробному описанию, когда рассматриваются вместе с сопровождающими чертежами, где:

ФИГУРА 1 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую геномную структуру МASP-2 человека;

ФИГУРА 2А представляет собой принципиальную схему, иллюстрирующую доменную структуру белка MASP-2 человека;

ФИГУРА 2В представляет собой принципиальную схему, иллюстрирующую доменную структуру белка Мар19 человека;

ФИГУРА 3 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую стратегию нокаута MASP-2 мыши;

ФИГУРА 4 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую конструирование минигена MASP-2 человека;

ФИГУРА 5A представляет результаты, которые демонстрируют, что MASP-2-недостаточность приводит к потере лектиновый-путь-опосредованной C4-активации, измеряемой по отсутствию C4b-депозиции на маннане, как описано в Примере 2;

ФИГУРА 5B представляет результаты, которые демонстрируют, что MASP-2-недостаточность приводит к потере лектиновый-путь-опосредованной C4-активации, измеряемой по отсутствию C4b-депозиции на зимозане, как описано в Примере 2;

ФИГУРА 5С представляет результаты, которые демонстрируют относительные уровни C4-активации образцов сыворотки, полученных от штаммов MASP-2+/-; MASP-2-/- и дикого типа, как определено по C4b-депозиции на маннане и на зимозане, как описано в Примере 2;

ФИГУРА 6 представляет результаты, которые демонстрируют, что добавление мышиного рекомбинантного MASP-2 к образцам сыворотки MASP-2-/- восстанавливает лектиновый-путь-опосредованную C4-активацию зависимым от концентрации белка образом, как определяют по C4b-депозиции на маннане, как описано в Примере 2;

ФИГУРА 7 представляет результаты, которые демонстрируют, что классический путь является функциональным в штамме MASP-2-/-, как описано в Примере 8;

ФИГУРА 8А представляет результаты, которые демонстрируют, что Fab2-антитело анти-MASP2 # 11 ингибирует образование С3-конвертазы, как описано в Примере 10;

ФИГУРА 8B представляет результаты, которые демонстрируют, что Fab2-антитело анти-MASP2 # 11 связывается к нативным MASP-2 крысы, как описано в Примере 10;

ФИГУРА 8С представляет результаты, которые демонстрируют, что Fab2-антитело анти-MASP-2 # 41 ингибирует расщепление C4, как описано в Примере 10;

ФИГУРА 9 представляет результаты, которые демонстрируют, что каждое из протестированных Fab2-антител анти-MASP-2, которые ингибировали образование C3-конвертазы, также, как было обнаружено, ингибируют расщепление C4, как описано в Примере 10;

На ФИГУРЕ 10 приведена диаграмма, иллюстрирующая рекомбинантные полипептиды, полученные из MASP-2 крысы, которые использовались для эпитопного картирования блокирующих Fab2-антител анти-MASP-2, как описано в Примере 11;

ФИГУРА 11 представляет результаты, которые демонстрируют связывание Fab2 анти-MASP-2 № 40 и № 60 с полипептидами MASP-2 крысы, как описано в Примере 11;

ФИГУРА 12 представляет результаты, которые демонстрируют освобождение от азота мочевины крови у мышей дикого типа (+/+) и MASP-2 (-/-) через 24 и 48 часов после реперфузии в модели ишемии почек/реперфузионного повреждения, как описано в Примере 12;

ФИГУРА 13А представляет результаты, показывающие базовые уровни белка VEGF в RPE-хороидальном комплексе, изолированном из мышей дикого типа (+/+) и MASP-2 (-/-), как описано в Примере 13;

ФИГУРА 13B представляет результаты, показывающие базовые уровни белка VEGF в RPE-хороидальном комплексе у мышей дикого типа (+/+) и MASP-2 (-/-) на 3 день после лазерно- индуцированного повреждения в модели макулярной дегенерации, как описано в Примере 13;

ФИГУРА 14 представляет результаты, показывающие средний объем хориоидальной неоваскуляризации (CNV) на седьмой день после лазерно-индуцированного повреждения у мышей дикого типа (+/+) и MASP-2 (-/-), как описано в Примере 13;

ФИГУРЫ 15A и 15B представляют кривые дозового эффекта для ингибирования C4b-депозиции (ФИГУРА 15А) и ингибирования активации тромбина (ФИГУРА 15В) после введения Fab2-антитела MASP-2 в нормальной сыворотке крови крыс, как описано в Примере 14;

ФИГУРЫ 16A и 16B представляют измеренную агрегацию тромбоцитов (выраженную в виде суммарной площади) у мышей MASP-2 (-/-) (ФИГУРА 16В) по сравнению с агрегацией тромбоцитов у мышей дикого типа, не получавших лечения, и мышей дикого типа, у которых путь комплемента ингибируется при помощи истощающего агента фактора яда кобры (CVF) и ингибитора терминального пути (C5aR-антагонист) (ФИГУРА 16А) в модели локализованной реакции Шварцмана диссеминированного внутрисосудистого свертывания, как описано в Примере 15;

ФИГУРА 17 графически иллюстрирует уровни азота мочевины крови (BUN), определенные у трансплантат-реципиентных WT-мышей (+/+) (B6) или трансплантат-реципиентных мышей MASP-2 (-/-), с почками от WT(+/+) доноров, как описано в Примере 16;

ФИГУРА 18 графически иллюстрирует процент выживания WT-мышей (+/+) и мышей MASP-2 (-/-) как функцию числа дней после микробной инфекции в модели перевязки слепой кишки и пункции (CLP), как описано в Примере 17;

ФИГУРА 19 графически иллюстрирует количество бактерий, определенных в WT-мышах (+/+) и мышах MASP-2 (-/-) после микробной инфекции в модели