Улучшенные способы применения рекомбинантных секретоглобинов человека

Улучшенные способы применения рекомбинантных секретоглобинов человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, способам получения, аналитическим способам и способам применения секретоглобинов, в том числе SCGB1A1 (СС10), SCGB3A1 и SCGB3A2. Были выявлены новые физиологические роли и терапевтические применения этих секретоглобинов. Конкретно, настоящее изобретение относится к новым способам применения rhCC10, rhSCGB3A2 и rhSCGB3A1 для предупреждения или отсрочки госпитализации вследствие тяжелых обострений заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после курса лечения. Настоящее изобретение также относится к новым способам получения и фармацевтическим композициям на основе rhSCGB3A2, которые являются стабильными и имеют противовоспалительные свойства. Более конкретно, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ предупреждения тяжелых обострений заболевания дыхательной системы с помощью введения rhCC10. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения бронхоэктаза и предупреждения обострений бронхоэктаза с помощью введения rhSCGB3A2. Еще более конкретно, настоящее изобретение представляет способ регрессии изменения структуры воздухоносных путей при хронических заболеваниях легких и предупреждения изменения структуры воздухоносных путей при острых повреждениях легких с помощью введения rhCC10, rhSCGB3A2 или rhSCGB3A1. Еще более конкретно, эти секретоглобины модифицируют изменение структуры воздухоносных путей косвенным путем с помощью восстановления нормального количества клеток Клара и ассоциированных с ними структур, которые называются нейроэпителиальными тельцами (также известные под названием NEB) или кластерами нейроэндокринных клеток (также известные под названием NEC), которые выявляют благодаря их иммунореактивности в отношении антител против CGRP1, в эпителии воздухоносных путей. Затем клетки Клара и другие CGRP1+ клетки секретируют эти секретоглобины и другие компоненты нормальной среды слизистой оболочки, которые способствуют гомеостазу и нормальному функционированию слизистой оболочки дыхательных путей и эпителия, которые в этом случае являются более устойчивыми к вдыхаемым неблагоприятным факторам без возникновения тяжелых обострений.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Природный 10 кДа белок клеток Клара человека (СС10), также известный как утероглобин, 16 кДа белок клеток Клара (СС16), секреторный белок клеток Клара (CCSP), бластокинин, белок-1 мочи и секретоглобин 1А1 (SCGB1A1) являются представителями семейства родственных белков, называемых секретоглобины, которые, как считается, существуют у всех позвоночных животных. Существуют два дополнительных секретоглобина, которые также экспрессируются при очень высоких уровнях в дыхательных путях, называемые SCGB3A1 и SCGB3A2 (Porter, 2002). Эти три белка; SCGB1A1, SCGB3A1 и SCGB3A2, в данном документе называются ''секретоглобинами дыхательной системы''. В таблице 1 показаны идентификаторы в Genebank и аминокислотные последовательности для каждого секретоглобина дыхательной системы.

Основным источником секретоглобинов дыхательной системы у млекопитающих является эпителий легких и трахеи, а именно бронхиолярные эпителиальные клетки воздухоносных путей, отличные от реснитчатых (прежде всего клетки Клара), и при этом они являются очень распространенными белками, которые продуцируются в локальной среде, во внеклеточной жидкости легких взрослых. Они также секретируются в назальном эпителии. Таким образом, секретоглобины дыхательной системы характеризуются высоким уровнем экспрессии как в верхних, так и в нижних дыхательных путях; причем верхние дыхательные пути включают носовые ходы и пазухи, а нижние дыхательные пути включают трахею, бронхи и альвеолы легких. Значительное количество секретоглобинов дыхательной системы также присутствует в сыворотке крови и моче, причем в большинстве случаев их получают из пульмональных источников. SCGB3A1 также экспрессируется в желудке, сердце, тонком кишечнике, матке и молочных железах, а SCGB3A2 характеризуется низким уровнем экспрессии в щитовидной железе (Porter, 2002). СС10 также продуцируется тканями репродуктивных органов (матка, семенные пузырьки), экзокринными железами (предстательная железа, молочная железа, поджелудочная железа), эндокринными железами (щитовидная железа, гипофиз, надпочечные железы и яичники), а также тимусом и селезенкой (Mukherjee, 1999; Mukherjee, 2007). Основная форма СС10 человека in vivo, которую можно выделить, представляет собой гомодимер, состоящий из двух идентичных мономеров из 70 аминокислот, причем значение изоэлектрической точки составляет 4,8. Его молекулярная масса составляет 15,8 кДа, хотя он мигрирует при анализе с помощью SDS-PAGE с получением наблюдаемой молекулярной массы приблизительно 10 кДа. Мономеры расположены в антипараллельной конфигурации, причем N-конец одного является смежным с С-концом другого, а в полностью окисленной форме димера мономеры соединены двумя дисульфидными связями (Mukherjee, 1999). Однако, in vivo молекулярная форма (мономер, димер или другой комплекс) SCGB3A2 в образцах, полученных от человека, еще не была описана. Все три секретоглобина дыхательной системы можно получить с помощью синтетических способов (Nicolas, 2005) или способов с использованием рекомбинантных ДНК (Mantile, 1993), хотя до настоящего времени не было сообщений с описанием успешного синтеза SCGB3A1 и SCGB3A2 человека и биохимической характеристикой этих белков in vitro.

СС10 представляет собой белок с противовоспалительным и иммуномодулирующим действием, который был описан в связи с разными взаимодействиями с другими белками, рецепторами и типами клеток (обзор в Mukherjee, 2007, Mukherjee, 1999 и Pilon, 2000). Более низкие уровни белка или мРНК СС10 были выявлены в образцах разных тканей и жидкостей при ряде клинических состояний, которые характеризуются некоторой степенью воспаления, в том числе астме (Lensmar, 2000; Shijubo, 1999; Van Vyve, 1995), пневмонии (Nomori, 1995), облитерирующем бронхите (Nord, 2002), саркоидозе (Shijubo, 2000), и у пациентов, которые страдают хроническим ринитом с рецидивирующим синуситом и назальным полипозом (Liu, 2004). При этих состояниях на эпителиальные клетки легких, основной источник эндогенных СС10 в организме, часто осуществляется неблагоприятное влияние, они истощаются или даже разрушаются (Shijubo, 1999).

Мыши, нокаутные (KO) по СС10, имели важное значение для определения роли СС10 в гомеостазе легких, размножении и определенных типах заболеваний почек. Существуют две линии мышей СС10 KO, для каждой из которых использовали разные конструкции для генного нокаута и разные исходные линии мышей. Одна нокаутная линия характеризуется несколькими выраженными фенотипическими характеристиками, в том числе, системным воспалением, слабой способностью к размножению (малый размер приплода), и летальным фенотипом почек, похожим на IgA-нефропатию у человека (Zhang, 1997; Zheng, 1999). Другая нокаутная линия не характеризуется этими выраженными фенотипическими характеристиками и является более жизнеспособной, что дает возможность проведения большего количества экспериментов (Stripp, 1997). Обе линии мышей СС10 KO характеризуются намного большей чувствительностью и существенно усиленными воспалительными реакциями на факторы, неблагоприятно влияющие на легкие, в моделях астмы, фиброза легких и канцерогенеза, бактериальных и вирусных инфекций и влияния кислорода и озона (Plopper, 2006; Lee, 2006; Yang, 2004; Wang, 2003; Harrod, 2002; Chen, 2001; Wang, 2001; Hayashida, 2000; Harrod, 1998). Восстановление функции CC10 y этих нокаутных мышей с применением рекомбинантного СС10 человека (rhCC10), как было продемонстрировано, ослабляет чрезмерные воспалительные реакции в легких в моделях с провокационной пробой на протяжении короткого периода времени с конечной точкой до 7 дней (Chen, 2001; Wang, 2003). Что в наибольшей степени касается настоящего изобретения, обе линии имеют фенотип эпителия воздухоносных путей, который характеризуется значительно сниженным количеством клеток Клара и ассоциированных структур, называемых нейроэпителиальными тельцами (NEB; Castro, 2000) или кластерами нейроэндокринных клеток (NEC; Hong, 2001; Reynolds, 2000), как выявлено с помощью положительного окрашивания на белок 1, связанный с геном кальцитонина (CGRP1). Это снижение количества клеток Клара и ассоциированных структур в 2-10 раз в воздухоносных путях возникает при отсутствии какого-либо типа повреждения у этих мышей KO.

Недоношенные дети, у которых возникает респираторный дистресс-синдром (RDS), имеют недостаточное количество нативного СС10. В клиническом исследовании одну дозу rhCC10 вводили в день рождения и опосредствовали сильные краткосрочные противовоспалительные эффекты на протяжении 3-7 дней в легких. Анализы фармакокинетики продемонстрировали, что избыток СС10 выводился на протяжении 48 часов после введения одной дозы. Несмотря на противовоспалительные эффекты, rhCC10 не предупреждает развитие бронхолегочной дисплазии у новорожденных (BPD) (Levine, 2005), как было определено с помощью клинических параметров, в том числе 1) затемнения на рентгенограмме грудной клетки через 28 дней после рождения или 2) использования дополнительного кислорода при гестационном возрасте 36 недель (РМА). rhCC10 не уменьшает период госпитализации или количество дней с применением аппарата искусственной вентиляции легких, несмотря на значительное снижение показателей воспаления легких, наблюдаемых с использованием жидкости, аспирированной из трахеи (TAF). Не наблюдали различия между группами с использованием плацебо, лечением низкими дозами и высокими дозами с конечной точкой 12 месяцев, как изложено в Levine et al. (2005).

У недоношенных детей с BPD наблюдается склонность к возникновению частых и тяжелых обострений заболевания дыхательной системы и при этом частота их повторной госпитализации в первые 1-2 года жизни является высокой. Тяжелые обострения заболевания дыхательной системы характеризуются одышкой, затрудненным дыханием, заложенностью носа и груди, чрезмерным образованием слизи и иногда респираторным дистрессом. Тяжелые обострения заболевания дыхательной системы наблюдаются, когда на пациентов осуществляется влияние факторов окружающего среды и инфекций при вдыхании пыли, дыма, аллергенов, загрязнителей, химических веществ, бактерий, грибов и вирусов.

Много категорий пациентов с хроническими заболеваниями дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, урогенитального тракта склонны к тяжелым обострениям под влиянием провоцирующего фактора окружающей среды. Аналогично, пациенты с заболеваниями иммунной системы, в том числе аутоиммунными и аллергическими заболеваниями, также склонны к тяжелым обострениям под влиянием провоцирующего фактора окружающей среды. Тяжелые или острые обострения считаются частыми, если они встречаются у пациента более чем 3 раза на год. Даже пациенты, у которых нет хронического заболевания, но которые подвергаются острому повреждению легких (ALI), после повреждения склонны к частым и тяжелым острым респираторным эпизодам, напоминающим тяжелые обострения заболевания дыхательной системы. Раздражители из окружающей среды, которые провоцируют обострения, включают, без ограничения, пыль, твердые частички, дым, аллергены, загрязнители, химические вещества, загрязняющие вещества, бактерии, грибы и вирусы, которые могут вдыхаться, попадать в пищеварительную систему, заглатываться, поглощаться через кожу или другим путем вступать в местный контакт с влажной слизистой оболочкой I поверхности организма пациента.

ОБЪЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Исходя из изложенного выше, предоставляется неисключительный перечень целей, достигаемых с помощью настоящего изобретения.

Основным объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhCC10 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A2 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A1 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhCC10 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A2 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A1 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере месяца после введения секретоглобина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего у пациентов, у которых, как правило, возникают повторные обострения хронических заболеваний.

Еще одним объектом настоящего изобретения является увеличение промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего на протяжении до 10 месяцев после терапии с помощью дозы или курса секретоглобина дыхательной системы у пациентов, у которых возникают повторные обострения хронических заболеваний.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего у пациентов, у которых возникают повторные обострения хронических заболеваний дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения тяжелого острого респираторного эпизода, напоминающего обострение, у пациента, который подвергался острому повреждению легких, но у которого хроническое заболевание дыхательной системы не было диагностировано до повреждения.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения тяжелого обострения после воздействия вдыхаемого раздражителя, способного провоцировать обострение, у восприимчивого пациента с хроническим заболеванием дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения аутоиммунного заболевания до следующего у пациентов, у которых возникают повторные обострения хронических аутоиммунных заболеваний.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего у пациентов, у которых возникают частые обострения хронических заболеваний дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения аутоиммунного заболевания до следующего у пациентов, у которых возникают частые обострения хронических аутоиммунных заболеваний.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина во время или после предыдущего обострения для предупреждения следующего обострения.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина с помощью внутривенной инъекции, интратрахеального вливания, ингаляции, интраназального вливания, пероральным путем, сублингвальным путем или с помощью крема, геля или суппозитория для анального или вагинального применения.

Дополнительным объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества секреторных эпителиальных клеток, отличных от реснитчатых, и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества секреторных эпителиальных клеток, отличных от реснитчатых, в дыхательных путях, в том числе верхних и нижних дыхательных путях, и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток Клара в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества NEB и NEC в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества одного или нескольких нативных секретоглобинов дыхательной системы, циркулирующих в крови.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества одного или нескольких нативных секретоглобинов дыхательной системы, обнаруженных в жидкости слизистой оболочки, которая выстилает воздухоносные пути дыхательной системы (ALF), носовых ходов, трахеи или легких, и/или в мокроте или индуцированной мокроте.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих секретоглобин, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих СС10, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих SCGB3A2, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих SCGB3A1, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества эпителиальных клеток, секретирующих СС10, в женском урогенитальном тракте и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки влагалища.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества эпителиальных клеток, секретирующих СС10, в желудочно-кишечном тракте, в том числе, во рту, горле, пищеводе, желудке, поджелудочной железе, желчных протоках, верхнем и нижнем отделе кишечника и толстой кишке, и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с N-концом ATA, отличным от нативного.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с изоэлектрической точкой, равной 6,7.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с изоэлектрической точкой, равной 6,3.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с комбинацией изоформ с изоэлектрическими точками, равными 6,3 и 6,7.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе рекомбинантного SCGB3A2 человека, синтезированного в виде слияния с другим белком.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе рекомбинантного SCGB3A2 человека, синтезированного в виде слияния с убиквитин-подобным белком.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких. Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких. Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.

Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Секретоглобины, которые экспрессируются в дыхательных путях, обеспечивают развитие клеток Клара и других эпителиальных клеток дыхательной системы и резидентных структур иммунной системы в функциональном эпителии дыхательной системы. Существуют три секретоглобина, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии в дыхательных путях человека, в том числе SCGB1A1 (также известный под названием СС10, утероглобин, CCSP, СС16 и т.п.), SCGB3A2 (также известный под названием UGRP1, HIN-2) и SCGB3A1 (также известный под названием UGRP2, HIN-1).

Настоящее изобретение в целом относится к применению секретоглобинов дыхательной системы для отсрочки и предупреждения тяжелых обострений хронических заболеваний, вызванных влиянием факторов окружающей среды, в частности, заболеваний дыхательной системы. На уровне ткани секретоглобины дыхательной системы опосредуют увеличение количества клеток, секретирующих секретоглобин, и ассоциированных структур в тканях дыхательной системы, которые можно измерять опосредованно по увеличению количества продуктов секреции секретоглобина в жидкостях организма. Например, введение rhCC10 опосредует увеличение количества клеток Клара, NEB и NEC с восстановлением эпителия воздухоносных путей дыхательной системы. На сегодняшний день эта гипотеза является единственной, которая согласуется с фенотипом эпителия воздухоносных путей у мышей СС10 KO и объясняет данные касательно недоношенных детей, связанные с очень сильной продолжительной защитой от тяжелых обострений заболевания дыхательной системы, но отсутствием предупреждения BPD новорожденных, что представляет собой тип фиброза легких.

Хотя rhCC10 не предотвращал развития BPD новорожденных, он обеспечивал продолжительную защиту от тяжелых обострений заболевания дыхательной системы, при которых требуется повторная госпитализация, при этом эту защиту наблюдали в 6 месяцев РМА, что является моментом времени, при котором возраст ребенка составил бы 6 месяцев после 40 недель беременности. Поскольку в исследование включали детей в 24-28 недель РМА, эта конечная точка представляет собой до 10 месяцев после одной дозы rhCC10.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Аминокислотные последовательности SCGB3A2 человека, выравнивание аминокислотных последовательностей SCGB3A2 человека со сравнением предполагаемого и фактического N-концов

Фиг. 2. SDS-PAGE очищенного rhSCGB3A2, SDS-PAGE очищенного rhSCGB3A2. Образцы, каждый из которых содержал 5 микрограмм, с 1 мМ DTT и без 1 мМ DTT, смешивали с буфером для образца, содержащим SDS, кипятили 5 минут и загружали на гель с 10-20% трицина. Осуществляли электрофорез и окрашивали Coomassie R250. Гель обесцвечивали и получали изображение с помощью цифровой фотокамеры.

Фиг. 3. Изоэлектрическое фокусирование очищенного rhSCGB3A2, изоэлектрическое фокусирование очищенного rhSCGB3A2 в сравнении с rhCC10 и UBL и Den-1. Образцы, каждый из которых содержал 5 микрограмм, загружали на гель Novex IEF. Осуществляли электрофорез и окрашивали Coomassie R250. Гель обесцвечивали и получали изображение с помощью цифровой фотокамеры. Стрелки указывают на основную и менее распространенную изоформу rhSCGB3A2 с N-концом ATA.

Фиг. 4. In vitro ингибирование sPLAr1 В с применением панели A rhSCGB3A2: субстрат UNIBIPY; без PLA2; без rhSCGB3A2. Панель В: субстрат UNIBIPY с PLA2; без rhSCGB3A2. Панель С: субстрат UNIBIPY с PLA2, а также с rhSCGB3A2. Пик №1 представляет собой субстрат на основе фосфолипида UNIBIPY, пик №2 представляет собой продукт после расщепления с использованием sPLA2.

Фиг. 5. Вестерн-блоттинг SCGB3A2 из TAF человека. Вестерн-блоттинг жидкости, аспирированной из трахеи, полученной от детей, в сравнении с очищенным rhSCGB3A2 с использованием поликлонального антитела кролика против rhSCGB3A2. Образцы, каждый из которых содержал 20 микролитров TAF, загружали на гель Novex с 10-20% трицина; причем rhSCGB3A2 представлен на дорожке 1 (5 нанограмм) и дорожке 8 (1 нанограмм). Гель обесцвечивали и получали изображение с помощью цифровой фотокамеры.

Фиг. 6. Стандартная кривая для конкурентного ELISA SCGB3A2 человека Конкурентный ELISA разрабатывали с помощью стандартных способов, используют для конкуренции с неконъюгированной мишенью в образце для связывания с доступными сайтами в лунке. Антителом кролика против rhSCGB3A2 покрывали 96-луночные планшеты Maxisorb (200 нг/лунка), далее лунки блокировали 5% сахарозы, 2,5% BSA в PBS, далее планшеты высушивали и хранили при 4°С Получали конъюгат пероксидазы хрена (HRP) и rhSCGB3A2 (набор Pierce - EZ-link Maleimide Activated HRP kit, №в каталоге 31494) и использовали в анализе с разведением 1:130000. Калибраторы (1-500 нг) получали с использованием rhSCGB3A2

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Три отдельных факта объединяли для создания данного изобретения; в том числе 1) продолжительная защита от тяжелых обострений заболевания дыхательной системы и повторной госпитализации с помощью одной дозы rhCC10, наблюдаемая у недоношенных детей, 2) фенотип эпителия воздухоносных путей у мышей СС10 KO и 3) свойства ''фактора роста'' у SCGB3A2 (Guha, 2012; Kurotani, 2008; Kurotani, 2008а; Inoue, 2008; Niimi, 2001). Несмотря на исследования на протяжении многих лет, нет единого взгляда на роль СС10 в эпителии дыхательной системы, кроме того, что он опосредует противовоспалительные эффекты. Недавняя неудача клинического исследования на модели аллергического ринита с провокационной пробой с помощью введения аллергена в полость носа продемонстрировала, что даже его противовоспалительные эффекты in vivo не являются одинаковыми против всех типов воспалительных заболеваний (Widegren, 2009). Также, несмотря на полное отсутствие СС10, клетки Клара все еще были выявлены в дыхательных путях обеих линий мышей СС10 KO. Хотя СС10 и SCGB3A2 являются подобными по структуре, и, таким образом, как полагают, имеют некоторые одинаковые функции, не сообщалось о стимуляции роста или развития эпителиальных клеток воздухоносных путей с помощью СС10, к тому же rhCC10, фактически, как хорошо известно, подавляет рост опухолевых клеток эпителиального происхождения (Kundu, 1996; Leyton, 1994), в том числе линии эпителиальных клеток воздухоносных путей А549 (Szabo, 1998).

Все же, авторы считают, что rhCC10, который вводили недоношенным детям в день рождения, стимулировал развитие клеток, секретирующих СС10, которые, в свою очередь, продуцировали нативные СС10, которые стимулировали развитие большего количества клеток, секретирующих СС10, и так далее. Конечным результатом был более нормальный и жизнеспособный эпителий дыхательной системы у детей, которых лечили с помощью rhCC10, которые были более выносливыми к неблагоприятным факторам окружающей среды (пыль, дым, аллергены, инфекция RSV, инфекция вирусом гриппа и т.п.) в сравнении с детьми, которых лечили с использованием плацебо. Одна доза rhCC10 в день рождения придавала 100% защиту от повторной госпитализации вследствие тяжелого обострения заболевания дыхательной системы по сравнению с 50% показателем повторной госпитализации, наблюдавшимся у детей, которых лечили с использованием плацебо.

Также авторы считают, что применение СС10 для стимуляции развития клеток, секретирующих СС10, в эпителии дыхательной системы также будет давать результат у взрослых с хроническими заболеваниями дыхательной системы, при кот