Способ непрерывной многостадийной очистки антител

Способ непрерывной многостадийной очистки антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к способу трехстадийной мелко и крупномасштабной хроматографической очистки белков, в особенности моноклональных антител, с применением четырех буферных растворов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Очистка антитела может быть одним из наиболее дорогостоящих аспектов биотехнологического производства. Моноклональные антитела (мАт) обычно очищают при помощи трехстадийного хроматографического процесса с использованием трех смол и определенной буферной системы в каждой стадии. Этот стандартный способ очистки включает стадию захвата, после которой следует стадия ионного обмена и заключительная стадия окончательной очистки, и обычно занимает 3-5 рабочих дней (включая фазы хранения и фазы открывания). В таких стандартных процессах эти три стадии выполняют в последовательности операций различных блоков, которые невозможно проводить в непрерывном режиме, поскольку между каждой стадией необходимо производить регулирование pH, молярной концентрации и концентрации белка. Такой стандартный процесс очистки схематически изображен на Фигуре 5. Таким образом, стандартные способы очистки обычно требуют применения множества различных буферов, а также множества единиц хранения между каждой прекращенной стадией. Такие стандартные способы очистки, таким образом, подвержены контаминации, техническим отказам и ошибкам, связанным с человеческим фактором. Кроме того, так как между каждой стадией требуется остановка для концентрирования элюата, регулирование pH и электропроводности и сохранение элюата до следующей стадии, и поскольку каждая стадия не может начинаться до завершения предыдущей, такие стандартные процессы очистки являются особенно длительными и дорогостоящими, как это можно видеть на Фигуре 7.

При увеличении титров клеточных культур и использовании в производстве клеточных культур большего объема последующая переработка и выделение продукта рассматривается в промышленности в качестве лимитирующего фактора. Это, в особенности, относится к производству моноклональных антител, где основное внимание смещено от объема партии к производственной мощности при последующей переработке. Кроме того, в доклинических и клинических исследованиях ранней фазы требуется большее количество антител, которые могут быть получены более быстро. Таким образом, в промышленности существует потребность в способе очистки антител, который можно вести в непрерывном режиме, а также в уменьшении времени, затрачиваемого на получение партий, в снижении риска контаминации, технических отказов и ошибок, связанных с человеческим фактором, и требований к масштабированию способа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения нашли новый способ очистки антител, включающий ограниченное количество стадий, выполняемых в непрерывном режиме, с использованием уменьшенного количества смол и буферов, и при этом позволяющий получать высокие выходы очищенных антител с превосходной степенью чистоты. Очищенные белки, таким образом, подходят для медицинского применения. Таким образом, способ может применяться при очистке белков для клинических испытаний и/или для выпуска на рынок фармацевтической композиции, включающей белок. Кроме того, данный способ не требует какой-либо межстадийной регулировки и, таким образом, может быть выполнен в закрытой системе, от сбора очищаемых белков до получения конечного продукта.

Коротко, данный способ включает только три хроматографических стадии, выполняемых в непрерывном режиме: одна стадия аффинной хроматографии, одна стадия хроматографии на мультимодальных смолах или катионообменной хроматографии и одна стадия анионообменной хроматографии (AEX). Эти три хроматографических стадии могут быть выполнены в любом порядке. Кроме того, было обнаружено, что все буферы, используемые в ходе этих трех стадий хроматографии, могут быть приготовлены из одного и того же исходного раствора. Указанные буферы предпочтительно включают бис-трис, например, в комбинации с NaCl, уксусной кислотой, водой и, необязательно, NH₄Cl. Поскольку нет никакой потребности в замене буфера, способ является легковыполнимым и очень подходящим для автоматизации и/или для выполнения в непрерывном режиме. Более конкретно, во всем процессе можно использовать только 4 буфера, что гарантирует совместимость между всеми стадиями и обеспечивает производство полного цикла и экономию при контроле качества, а также снижает потребности в хранении.

Способ согласно изобретению также позволяет уменьшить или исключить фазы открывания (то есть стадии, в которых систему очистки открывают для выполнения операций вручную, например, при подготовке хроматографической колонки для нового буфера, разбавлении образца или регулировании pH), что позволяет снизить риск контаминации и дает возможность работать при более низких требованиях к контролю среды. Кроме того, так как в каждой хроматографической стадии способа согласно изобретению могут использоваться смолы многократного применения или неожиданно могут многократно использоваться одноразовые мембранные адсорберы, последовательность из трех хроматографических стадий можно повторять до получения нужного количества без манипуляций, выполняемых человеком. В частности, все хроматографические стадии способа согласно изобретению могут быть выполнены с использованием смол, которые могут повторно использоваться по меньшей мере 100 раз, или с использованием мембранных адсорберов, которые могут повторно использоваться по меньшей мере 50 раз. Авторы изобретения действительно продемонстрировали, что можно было использовать один и тот же одноразовый мембранный адсорбер на протяжении по меньшей мере 50 циклов без потери стабильности. Продолжительность производственного цикла, таким образом, уменьшается, требования к масштабированию процесса минимизируются, и при этом можно снизить затраты на производственные операции и хранение, так как можно уменьшить объемы смол и буферов, и одноразовые мембранные адсорберы не требуется хранить после обработки партии. Поэтому способ изобретения обеспечивает быстрое рентабельное получение партий и уменьшает продолжительность занятости систем очистки, как это можно видеть на Фигурах 10 и 12, по сравнению с Фигурами 9 и 11. Таким образом, он подходит для масштабирования и очистки рекомбинантных белков от лабораторного до промышленного масштаба.

Определенная методика была разработана и применена для четырех различных антител. В этой методике неочищенный белковый элюент, полученный в конце первой хроматографической стадии, непосредственно переносили на вторую хроматографическую матрицу, в частности на вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, то есть без проведения какой-либо обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера, и белковый элюат, полученный в конце второй хроматографической стадии, также непосредственно переносят на третью хроматографическую матрицу, в частности на третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, то есть без проведения какой-либо обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера. Данный способ схематически изображен на Фигуре 6. Кроме того, в данной методике содержащий белок раствор наносят на первую хроматографическую матрицу, в частности на первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, в последовательных циклах (см. Пример 6), причем последовательные циклы начинают непосредственно после элюции предыдущей партии в первой хроматографической стадии, как можно видеть на Фигуре 8. Данная методика имеет преимущество, состоящее в том, что она является чрезвычайно быстрой (приблизительно 2 часа на последовательность), дает повышенный выход (больше 90%), более высокую чистоту и позволяет уменьшить используемые объемы буферов и смол в случае использования колонок, и уменьшить использование буферов и мощностей хранения в случае использования мембранных адсорберов. Кроме того, этот процесс обладает преимуществом чрезвычайной гибкости, поскольку размер используемых колонок и/или количество циклов можно легко адаптировать к количеству очищаемых белков. Кроме того, он может быть полностью автоматизированным, работать в непрерывном режиме, и при этом он не включает фазы открывания. Кроме того, он был успешно применен для четырех различных антител без необходимости оптимизации.

Таким образом, изобретение предоставляет способ очистки белка из раствора, включающий первую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание раствора через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание промывочного буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, и элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы, в особенности с первой хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании первого элюирующего буфера; вторую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание неочищенного белкового элюента через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, необязательно пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, и элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы, в особенности со второй хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании второго элюирующего буфера; и третью хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание белкового элюата через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, в режиме непрерывного потока, необязательно пропускание промывочного буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, и выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы, в особенности третьей хроматографической колонки или мембранного адсорбера.

Изобретение также предоставляет способ очистки белка из раствора, включающий первую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание части раствора через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание промывочного буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы, в особенности с первой хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании первого элюирующего буфера, и необязательно пропускание буфера для очистки через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер; вторую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание неочищенного белкового элюента через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, необязательно пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы, в особенности со второй хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании второго элюирующего буфера, и необязательно пропускание буфера для очистки через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер; третью хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание белкового элюата через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, в режиме пропускания непрерывного потока, необязательно пропускание промывочного буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы, в особенности третьей хроматографической колонки или мембранного адсорбера, и необязательно пропускание буфера для очистки через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер; последовательный повтор первой, второй и третьей хроматографических стадий с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой третьей хроматографической стадии.

В одном варианте осуществления изобретения каждый из буферов содержит бис-трис. В другом варианте осуществления каждый буфер содержит бис-трис, уксусную кислоту, NaCl, воду и необязательно NH₄Cl. Использование бис-трис буферов в способе изобретения особенно важно, поскольку это позволяет избежать регулирования pH между тремя хроматографическими стадиями и, таким образом, проводить способ в закрытой системе от первой до последней стадии.

В одном варианте осуществления одна из хроматографических матриц является матрицей с белком A. В одном варианте осуществления одна из хроматографических матриц является мультимодальной смолой или катионообменной хроматографической матрицей. В одном варианте осуществления одна из хроматографических матриц является анионообменной хроматографической матрицей.

В конкретном варианте осуществления способ изобретения включает белок A, хроматографическую матрицу, мультимодальную смолу или катионообменную хроматографическую матрицу и анионообменную хроматографическую матрицу, где указанные матрицы используют в любом порядке в трех хроматографических стадиях.

В одном варианте осуществления изобретения первая хроматографическая матрица является матрицей с белком A, вторая хроматографическая матрица является мультимодальной смолой или катионообменной хроматографической матрицей, и третья хроматографическая матрица является анионообменной хроматографической матрицей.

В одном варианте осуществления изобретения каждая хроматографическая матрица является хроматографической колонкой. В конкретном варианте данного варианта осуществления первая хроматографическая матрица является колонкой с белком A, вторая хроматографическая матрица является хроматографической колонкой с мультимодальной смолой, и третья хроматографическая матрица является анионообменной хроматографической колонкой.

В другом варианте осуществления изобретения каждая хроматографическая матрица является хроматографическим мембранным адсорбером. В конкретном варианте данного варианта осуществления первая хроматографическая матрица является мембранным адсорбером с белком A, вторая хроматографическая матрица является катионообменным мембранным адсорбером, и третья хроматографическая матрица является анионообменным мембранным адсорбером.

В одном варианте осуществления изобретения очищаемый белок является антителом. В другом варианте осуществления антитело является моноклональным антителом.

В одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию нанофильтрации после стадии (c) и/или стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии нанофильтрации. В другом варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию инактивации при низком pH после стадии (c), после стадии нанофильтрации и/или после стадии ультрафильтрации и диафильтрации. В одном варианте осуществления изобретения способ включает, перед стадией (a), стадию клеточной культуры в жидкой питательной среде, предпочтительно в биореакторе, с получением жидкой питательной среды, содержащей белок. Культивируемые клетки могут быть клетками млекопитающих, бактерий или дрожжей.

Изобретение, таким образом, также предоставляет интегрированный способ получения очищенного белка из жидкой питательной среды.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первый элюирующий буфер включает 20 мМ бис-трис и 20 мМ NaCl, доведенные до pH 3,7 уксусной кислотой; второй элюирующий буфер включает 20 мМ бис-трис, 45 мМ NaCl и 25 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 7,25 уксусной кислотой, или включает 20 мМ бис-трис, 80 мМ NaCl и 25 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 6,2 уксусной кислотой; уравновешивающий буфер включает 20 мМ бис-трис и 20 мМ NaCl, доведенные до pH 7,4 уксусной кислотой; и промывочный буфер включает 20 мМ бис-трис и 1 М NaCl, доведенные до pH 7,4 уксусной кислотой. В других вариантах осуществления изобретения буфер для очистки включает 0,1н гидроксид натрия.

В изобретении предложен набор, включающий мультимодальную смолу или катионообменную хроматографическую матрицу, матрицу с белком A и/или анионообменную хроматографическую матрицу; и по меньшей мере один буфер, включающий или состоящий из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl. В некоторых вариантах осуществления набор применяется для очистки белка из раствора с применением способа согласно изобретению.

В одном варианте осуществления набор включает хроматографическую колонку с мультимодальной смолой, колонку с белком A и/или анионообменную хроматографическую колонку; и по меньшей мере один буфер, включающий или состоящий из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В другом варианте осуществления набор включает катионообменный мембранный адсорбер, мембранный адсорбер с белком A и/или анионообменный мембранный адсорбер; и по меньшей мере один буфер, включающий или состоящий из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В изобретении также предложен набор, включающий мультимодальную смолу или катионообменную хроматографическую матрицу, матрицу с белком A и/или анионообменную хроматографическую матрицу; и инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера, включающего или состоящего из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl. В некоторых вариантах осуществления набор применяется для очистки белка из раствора с применением способа согласно изобретению.

В одном варианте осуществления набор включает хроматографическую колонку с мультимодальной смолой, колонку с белком A и/или анионообменную хроматографическую колонку; и инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера, включающего или состоящего из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В другом варианте осуществления набор включает катионообменный мембранный адсорбер, мембранный адсорбер с белком A и/или анионообменный мембранный адсорбер; и инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера, включающего или состоящего из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В изобретении также предложен способ приготовления уравновешивающего буфера, включающий создание 100 л раствора с конечной концентрацией 20 мМ бис-трис и 20 мМ NaCl; доведение pH раствора до 7,4 уксусной кислотой; и сбор 25 л раствора. В изобретении также предложен способ приготовления промывочного буфера, включающий сбор 25 л из 75 л раствора, оставшихся после приготовления уравновешивающего буфера, и добавление дополнительного количества 1 М NaCl к этим 25 л раствора. В изобретении также предложен способ приготовления элюирующего буфера, включающий сбор 25 л из 50 л раствора, оставшегося после приготовления уравновешивающего буфера, и доведение pH этих 25 л раствора до 3,7 уксусной кислотой. В изобретении также предложен способ приготовления элюирующего буфера, включающий добавление дополнительного количества 45 мМ NaCl и дополнительного количества 25 мМ NH₄Cl к 25 л раствора, оставшегося после приготовления уравновешивающего буфера, и доведение pH этих 25 л до 7,25 уксусной кислотой. Буферы, приготовленные способами, раскрытыми в настоящей заявке, могут применяться для очистки белка из раствора с применением способа согласно изобретению.

Также в настоящей заявке предложены выделенные белки, фармацевтические средства и фармацевтические композиции, полученные любым из способов, описанных в настоящей заявке.

Эти и другие признаки и преимущества раскрытого способа очистки будут более ясны из последующего подробного описания, рассматриваемого вместе с прилагаемой формулой изобретения. Следует отметить, что объем формулы изобретения определяется ее содержанием, а не определенным обсуждением признаков и преимуществ, изложенных в описании.

В рамках изобретения термины "включающий", "имеющий" и "содержащий" следует рассматривать как открытые термины (то есть означающие "включающий, но не ограниченный"), если не отмечено иное. Дополнительно, термин "включающий" охватывает "состоящий" (например, композиция, "включающая" X, может состоять исключительно из X или может включать что-либо дополнительное, например X+Y).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Следующее подробное описание вариантов осуществления раскрытого способа очистки может быть лучше всего понято при прочтении в сочетании со следующими чертежами.

На Фигуре 1 показано схема методики, используемой для приготовления буферов для способа очистки, раскрытого в Примерах 2-7.

На Фигуре 2 показаны графики, на которых представлены области максимальной эффективности второго элюирующего буфера для трех концентраций NH₄Cl.

На Фигуре 3 показаны графики, на которых представлен анализ тенденции изменения ВММ, выход, БКХ и ДНК в каждом из 15 циклов Примера 5.

На Фигуре 4 показаны графики, на которых представлен анализ тенденции изменения ВММ, НММ, БКХ и ДНК в каждом из 50 циклов Примера 8.

На Фигуре 5 показана схема различных стадий стандартного способа очистки белков. СВ: суммарный выход; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; EqB#2: второй уравновешивающий буфер; WB#2: второй промывочный буфер, ElB#2: второй элюирующий буфер; EqB#3: третий уравновешивающий буфер; WB#3: третий промывочный буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; регул. pH: регулирование pH; регул. конц.: регулирование концентрации; регул. электропр.: регулирование удельной электропроводности; проб.: отбор пробы; хран.: хранение; фильт.: фильтрация; нанофильт.: нанофильтрация; ФТП: фильтрация в тангенциальном потоке.

На Фигуре 6 показана схема различных стадий способа согласно изобретению. СВ: суммарный выход; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; ElB#2: второй элюирующий буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; проб.: отбор пробы; хран.: хранение; наноф.: нанофильтрация; ФТП: фильтрация в тангенциальном потоке.

На Фигуре 7 показана схема различных стадий стандартного способа очистки белков, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; EqB#2: второй уравновешивающий буфер; WB#2: второй промывочный буфер, ElB#2: второй элюирующий буфер; EqB#3: третий уравновешивающий буфер; WB#3: третий промывочный буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация.

На Фигуре 8 показана схема различных стадий способа согласно изобретению, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; ElB#2: второй элюирующий буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация.

На Фигуре 9 показана схема временного графика различных стадий стандартного способа очистки белков, включающего несколько циклов. В первой строке таблицы показано время в часах. Освет.: осветление; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Инакт. при низком pH: инактивация при низком pH; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Круг обозначает время завершения процесса.

На Фигуре 10 показана схема временного графика различных стадий способа согласно изобретению, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Круг обозначает время завершения процесса.

На Фигуре 11 показана схема временного графика различных стадий стандартного способа очистки белков, включающего несколько циклов. В первой строке таблицы показано время в часах. Освет.: осветление; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Инакт. при низком pH: инактивация при низком pH; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Указан расчетный уровень производительности процесса.

На Фигуре 12 показана схема временного графика различных стадий способа согласно изобретению, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; хр1: первая хроматографическая стадия; хр2: вторая хроматографическая стадия; хр3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Указан расчетный уровень производительности процесса.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ АСПЕКТОВ И ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Исходя из доступности смол смешанного типа (также называемых мультимодальными смолами) и хроматографических мембранных адсорберов, авторы изобретения разработали новый способ очистки, в котором используются только три хроматографических стадии. Другими словами, способ включает только три стадии, включающие пропускание через хроматографическую матрицу.

Изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание указанного раствора через первую хроматографическую матрицу;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы при использовании первого элюирующего буфера;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую матрицу;

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы при использовании второго элюирующего буфера; и

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую матрицу в режиме пропускания непрерывного потока;

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы;

где каждый из буферов включает бис-трис.

Более конкретно, каждая из двух первых хроматографических стадий выше может включать или состоять из:

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;

- пропускания раствора или неочищенного белкового элюента через хроматографическую матрицу (как указано выше);

- пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;

- необязательно, пропускание промывочного буфера через хроматографическую матрицу;

- необязательно, пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;

- элюирование неочищенного белкового элюента или белкового элюата с хроматографической матрицы при использовании элюирующего буфера (как указано выше),

где каждый из буферов включает бис-трис.

Изобретение также относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание части указанного раствора через первую хроматографическую матрицу;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы при использовании первого элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через первую хроматографическую матрицу;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую матрицу,

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы при использовании второго элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через вторую хроматографическую матрицу;

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую матрицу в режиме пропускания непрерывного потока,

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через третью хроматографическую матрицу;

последовательный повтор стадий (a), (b) и (c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и

сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой стадии (c);

где каждый уравновешивающий, промывочный и элюирующий буфер включает бис-трис.

В рамках изобретения выражение "хроматографическая матрица" относится к любому типу состоящих из частиц сорбционных сред, смол или другой твердой фазы, такой как мембрана, которые, в процессе очистки, действуют как абсорбент, обеспечивая отделение очищаемой молекулы от других молекул, присутствующих в смеси. Матрица, в частности матрицы, состоящих из смол, могут находиться в форме колонок или в форме мембранных адсорберов.

В рамках изобретения "мембранный адсорбер" относится к плоскому листу из акрилового полимера, несущего ионные группы и включающего присоединенные функциональные группы, такие как аффинные группы и ионообменные группы. Одним из различий между смолой и мембраной является распределение потока: под действием диффузии в случае смолы и под действием конвекции в мембранах.

В одном варианте осуществления способа согласно изобретению первая, вторая и третья хроматографические матрицы являются хроматографическими колонками. В другом варианте осуществления способа согласно изобретению первая, вторая и третья хроматографические матрицы являются хроматографическими мембранными адсорберами.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание указанного раствора через первую хроматографическую колонку;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической колонки при использовании первого элюирующего буфера;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую колонку;

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической колонки при использовании второго элюирующего буфера; и

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока;

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической колонки;

где каждый из буферов включает бис-трис.

Более конкретно, каждая из двух первых хроматографических стадий выше может включать или состоять из:

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- пропускания раствора или неочищенного белкового элюента через хроматографическую колонку (как указано выше);

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, пропускания промывочного буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- элюирования неочищенного белкового элюента или белкового элюата с хроматографической колонки при использовании элюирующего буфера (как указано выше),

где каждый из буферов включает бис-трис.

Изобретение также относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание части указанного раствора через первую хроматографическую колонку;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической колонки при использовании первого элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через первую хроматографическую колонку;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую колонку,

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической колонки при использовании второго элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через вторую хроматографическую колонку;

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока,

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической колонки, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через третью хроматографическую колонку;

последовательный повтор стадий (a), (b) и (c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и

сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой стадии (c);

где каждый уравновешивающий, промывочный и элюирующий буфер включает бис-трис.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание указанного раствора через первый хроматографический мембранный адсорбер;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первого хроматографического мембранного адсорбера при использовании первого элюирующего буфера;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через второй хроматографический мембранны