Пестицидные композиции и относящиеся к ним способы

Пестицидные композиции и относящиеся к ним способы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по временной патентной заявке США с серийным номером № 61/594245, поданной 2 февраля 2012 года, под названием "Plant Transactivation Interaction Motifs and Uses Thereof."

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к биотехнологии растений. Варианты осуществления относятся к полипептидам (например, слитый белок), содержащим новый или синтетический мотив взаимодействия факторов транскрипции из трансактиватора растений. Некоторые варианты осуществления относятся к применению такого белка для экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты или для повышения экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Некоторые варианты осуществления относятся к полинуклеотидам, кодирующим белок, содержащий новый или синтетический мотив взаимодействия факторов транскрипции из трансактиватора растений. Конкретные примеры относятся к клеткам-хозяевам, тканям и/или организмам, содержащим полипептид или полинуклеотид по изобретению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Введение клонированных и выделенных генов в клетки растений (генетическая трансформация) и последующую регенерацию трансгенных растений широко используют для осуществления генетической модификации растений или растительных материалов. Генетическую трансформацию растений для введения желаемого признака (например, улучшенное питательное качество; увеличенный выход; устойчивость к паразитам или резистентность к заболеванию; устойчивость к стрессовым воздействиям; и устойчивость к гербицидам) в настоящее время широко используют для получения новых и улучшенных трансгенных растений, которые экспрессируют желаемый признак. ДНК, как правило, случайным образом встраивают в ядерную или пластидную ДНК эукариотической клетки-хозяина, а затем клетки, содержащие ДНК, встроенную в ДНК клеток, выделяют и используют для получения стабильно трансформированных клеток растений. Часто является желательной модификация способами генетической инженерии одного сорта растения для экспрессии более чем одного введенного признака путем введения множества кодирующих последовательностей, которые могут содержать сходные (или идентичные) регуляторные элементы.

Экспрессия трансгенов (а также эндогенных генов) контролируется посредством механизмов, вовлекающих множество взаимодействий белок-ДНК и белок-белок. Путем таких взаимодействий регуляторные элементы нуклеиновых кислот (например, промоторы и энхансеры), могут обеспечивать профили экспрессии кодирующей последовательности, которые являются либо конститутивными, либо специфическими. Например, промотор может обеспечивать увеличенную транскрипцию кодирующей последовательности в конкретных тканях во время конкретных периодов развития или в ответ на стимулы окружающей среды. К сожалению, присущие общепринятым промотором признаки экспрессии трансгенов ограничивают диапазон контроля экспрессии, который можно использовать для действия в клетке-хозяине. Одним практическим ограничением общепринятых промоторов является то, что трудно тонко отрегулировать уровень экспрессии введенного гена вследствие ограниченной силы промотора и подавления экспрессии трансгеном, в частности, сильными промоторами или одновременным применением в одной и той же клетке множества копий одного и того же промотора. Также является желательной инициация или увеличение экспрессии эндогенных или нативных генов.

Трансактиваторы представляют собой белки, которые функционируют, привлекая посредством белок-белковых взаимодействий ряд различных белков, вовлеченных в транскрипцию ДНК (например, комплексы ремоделирования нуклеосом; комплексы медиаторов и основные факторы транскрипции, такие как TFIIB, TBP и TFIIH) для инициации или увеличения скорости транскрипции путем влияния на сборку/разборку нуклеосом, образование прединициирующего комплекса, освобождение промотора и/или скорость удлинения. Белок-белковые взаимодействия трансактиваторов и их партнеров по связыванию вовлекают отдельные внутренние структурные элементы в трансактиваторах, известные как "домены трансактивации (TAD)". Полагают, что TAD обладают небольшой гомологией первичных последовательностей и принимают определенную структуру при связывании с мишенью. Sigler (1988) Nature 333:210-2. Хотя полагают, что кислые и гидрофобные остатки в TAD являются важными (см., например, Cress and Triezenberg (1991) Science 251(4989):87-90), вклад индивидуальных остатков в активность является небольшим. Hall and Struhl (2002) J. Biol. Chem. 277:46043-50.

Белок вириона вируса простого герпеса 16 (VP16) представляет собой трансактиватор, который функционирует, стимулируя транскрипцию вирусных генов в инфицированных HSV клетках. Как в случае других трансактиваторов, VP16 активирует транскрипцию посредством серии белок-белковых взаимодействий, вовлекающих их TAD, которые являются высококислотными. Было показано, что кислотные TAD VP16 взаимодействуют с несколькими белками-партнерами как in vitro, так и in vivo. Например, TAD VP16 содержит мотив взаимодействия, который взаимодействует прямо с субъединицей Tfb1 TFIIH (Langlois et al. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130:10596-604), и это взаимодействие коррелирует со способностью VP16 активировать как фазу инициации, так и фазу элонгации транскрипции для предранних генов вирусов.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны новые мотивы белок-белковых взаимодействий TAD, выделенные из белков трансактиваторов растений, и нуклеиновые кислоты, кодирующие их. Эти новые мотивы взаимодействия можно использовать в синтетических TAD для сообщения свойств регуляции генов полипептиду, содержащему TAD. Например, некоторые варианты осуществления включают слитый белок активаторов транскрипции, который содержит полипептид ДНК-связывающего домена и такой полипептид TAD. В зависимости от конкретного ДНК-связывающего домена, который слит с TAD в слитом белке активатора транскрипции, трансактивацию можно использовать для увеличения экспрессии представляющего интерес гена. Например, гетерологичный полинуклеотид, с которым связывается связывающий ДНК домен, может быть функционально связанным с представляющим интерес геном, тем самым осуществляя нацеливание слитого белка (и его функционального TAD), связывание которого увеличит экспрессию представляющего интерес гена. Альтернативно ДНК-связывающий домен можно модифицировать способами инженерии так, чтобы он связывал эндогенный полинуклеотид, который функционально связан с представляющим интерес геном или является проксимальным относительно него. При связывании слитого белка активатора транскрипции с участком связывания ДНК-мишени можно стимулировать транскрипцию гена, функционально связанного с участком связывания ДНК-мишени.

Также в настоящем описании описаны синтетические варианты мотивов белок-белкового взаимодействия TAD и нуклеиновые кислоты, кодирующие их. В некоторых примерах синтетический вариант мотива белок-белкового взаимодействия TAD модифицируют способами инженерии путем внесения одной или нескольких мутаций (например, консервативная мутация или мутация, идентифицированная в ортологе мотива взаимодействия) в TAD трансактиватора (например, трансактиватор растений). Неожиданно синтетический вариант TAD, полученный таким образом, который содержит вариант мотива взаимодействия, может сообщать свойства регулирования генов, отличающиеся от немодифицированного TAD, когда он связан с ДНК-связывающим доменом в слитом белке активатора транскрипции. Например, конкретные синтетические варианты TAD, которые содержат мотив взаимодействия варианта, могут повышать уровень активации транскрипции, сообщаемый встречающимся в природе мотивом взаимодействия TAD, при экспрессии в том же положении в слитом белке, содержащем ДНК-связывающий домен.

Некоторые варианты осуществления включают синтетический слитый белок активатора транскрипции. В конкретных вариантах осуществления слитый белок может увеличивать транскрипцию представляющего интерес гена, где слитый белок содержит первый полипептид, содержащий ДНК-связывающий домен, функционально связанный со вторым полипептидом, содержащим мотив взаимодействия TAD. В некоторых примерах мотив взаимодействия TAD может быть выбран из группы мотивов взаимодействия TAD, состоящей из SEQ ID NO:10-16. Например, но не ограничиваясь ими, мотив взаимодействия TAD может находиться в TAD, содержащем аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-8 и SEQ ID NO:100-106. В некоторых примерах мотив взаимодействия TAD может представлять собой вариант мотива взаимодействия TAD, имеющий, например, но не ограничиваясь ими, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:17-58. Например, но не ограничиваясь этим, такой вариант мотива взаимодействия TAD может находиться в TAD, содержащем аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:107-120.

Некоторые варианты осуществления включают полинуклеотид, который кодирует синтетический слитый белок активаторов транскрипции, содержащий первый полипептид, содержащий ДНК-связывающий домен, функционально связанный со вторым полипептидом, содержащим мотив взаимодействия TAD. Полипептид ДНК-связывающего домена может представлять собой любой ДНК-связывающий домен, который специфично связывается с конкретным участком связывания ДНК-мишени. Например, но не ограничиваясь этим, полипептид ДНК-связывающего домена может представлять собой полипептид, выбранный из группы, состоящей из ДНК-связывающего домена в виде цинковых пальцев; ДНК-связывающего домена UPA; GAL4; TAL; LexA; Tet-репрессора; LacR и рецептора стероидных гормонов. В конкретных примерах последовательность, кодирующая ДНК-связывающий домен, может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:67; SEQ ID NO:68 и SEQ ID NO:99. В конкретных примерах полинуклеотид может содержать последовательность, кодирующую ДНК-связывающий белок, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:67; SEQ ID NO:68 и SEQ ID NO:99.

В некоторых примерах полинуклеотид может содержать последовательность, кодирующую мотив взаимодействия TAD, которая кодирует мотив взаимодействия TAD или вариант мотива взаимодействия TAD, например, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO:10-58. Конкретные варианты осуществления включают полинуклеотид, который кодирует слитый белок активатора транскрипции, содержащий по меньшей мере один мотив взаимодействия TAD. Конкретные варианты осуществления включают полинуклеотид, который кодирует слитый белок активатора транскрипции, содержащий по меньшей мере один ДНК-связывающий домен.

Примеры полинуклеотидов, которые кодируют синтетический слитый белок активатора транскрипции в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, включают полинуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую ДНК-связывающий домен, и по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую мотив взаимодействия TAD (или его вариант), где полинуклеотид содержит, например, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, которая по существу идентична одной из SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 97% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO:79-93; нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO:79-93; последовательность, комплементарную полинуклеотиду, который специфически гибридизуется по меньшей мере с одной из SEQ ID NO:79-93; и последовательность, обратно комплементарную полинуклеотиду, который специфически гибридизуется по меньшей мере с одной из SEQ ID NO:79-93.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, который кодирует слитый белок активатора транскрипции, можно включать, например, в рекомбинантный вектор, например, для обеспечения экспрессии белка в клетке-хозяине. Таким образом, некоторые примеры включают вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид по изобретению, и/или клетку-хозяина, в которую введен такой вектор.

Также в настоящем описании описано средство для трансактивации экспрессии генов растения. Как используют в рамках изобретения, "средство для трансактивации экспрессии генов растения" включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:46 и SEQ ID NO:52. В некоторых вариантах осуществления синтетический белок, содержащий по меньшей мере одно средство для трансактивации экспрессии генов растения можно использовать для модулирования экспрессии представляющего интерес гена в клетке растения.

Кроме того, в настоящем описании описаны средства для увеличения экспрессии генов, которые происходят из ERF2. Как используют в рамках изобретения, "средство для увеличения экспрессии генов, которое происходит из ERF2", включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:17-22 и SEQ ID NO:121. Кроме того описаны средства для увеличения экспрессии генов, которые происходят из PTI4. Как используют в рамках изобретения, "средство для увеличения экспрессии генов, которое происходит из PTI4" включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:23-28 и SEQ ID NO:122. Кроме того, описаны средства для увеличения экспрессии генов, которые происходят из AtERF1. Как используют в рамках изобретения, "средство для увеличения экспрессии генов, которое происходит из AtERF1", включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:29-34 и SEQ ID NO:123. Кроме того, описаны средства для увеличения экспрессии генов, которые происходят из ORCA2. Как используют в рамках изобретения, "средство для увеличения экспрессии генов, которое происходит из ORCA2", включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:35-40 и SEQ ID NO:124. Кроме того, описаны средства для увеличения экспрессии генов, которые происходят из DREB1A. Как используют в рамках изобретения, "средство для увеличения экспрессии генов, которое происходит из DREB1A", включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:41-46 и SEQ ID NO:125. Кроме того, описаны средства для увеличения экспрессии генов, которые происходят из CBF1. Как используют в рамках изобретения, "средство для увеличения экспрессии генов, которое происходит из CBF1", включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:47-52 и SEQ ID NO:126. Кроме того, описаны средства для увеличения экспрессии генов, которые происходят из DOF1. Как используют в рамках изобретения, "средство для увеличения экспрессии генов, которое происходит из DOF1", включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:53-58 и SEQ ID NO:127.

Также в настоящем описании описаны способы увеличения экспрессии генов с использованием синтетического слитого белка активатора транскрипции. Например, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий синтетический слитый белок активатора транскрипции, можно вводить в клетку-хозяина (например, клетку растения, дрожжевую клетку, клетку млекопитающего и иммортализованную клетку), содержащую представляющий интерес ген, функционально связанный с ДНК-связывающим участком, являющимся мишенью слитого белка. Экспрессия слитого белка в клетке-хозяине и последующее связывание слитого белка с функционально связанным ДНК-связывающим участком, являющимся мишенью, может приводить к инициации транскрипции или увеличенной транскрипции представляющего интерес гена. В конкретных примерах ДНК-связывающий участок, являющийся мишенью, можно вводить в клетку-хозяина, так чтобы ДНК-связывающий участок, являющийся мишенью, был функционально связан с представляющим интерес геном. В следующих примерах синтетический слитый белок активатора транскрипции может содержать полипептид ДНК-связывающего домена, который сконструирован так, чтобы он связывался с ДНК-связывающий участком, являющимся мишенью, который функционально связан с представляющим интерес геном.

В некоторых вариантах осуществления вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий синтетический слитый белок активатора транскрипции, можно вводить в клетку-хозяина, так чтобы полинуклеотид впоследствии встраивался в геномную ДНК клетки-хозяина (например, посредством гомологичной рекомбинации). Таким образом, синтетический слитый белок активатора транскрипции, и, более того, нуклеиновая кислота, кодирующая его, могут находиться в трансгенном организме (например, трансгенное растение). Таким образом, такие организмы также описаны в настоящем описании. В примерах нуклеиновая кислота, кодирующая синтетический слитый белок активатора транскрипции, может либо встраиваться случайным образом, либо в заданной области, в геноме клетки трансгенного организма.

Кроме того, описаны способы экспрессии представляющего интерес гена с использованием синтетического слитого белка активатора транскрипции и/или нуклеиновой кислоты, кодирующей его. В некоторых вариантах осуществления вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий синтетический слитый белок активатора транскрипции, можно вводить в клетку-хозяина, содержащую представляющий интерес ген, функционально связанный с участком связывания ДНК, являющимся мишенью для слитого белка. В некоторых примерах синтетический слитый белок активатора транскрипции содержит средство для трансактивации экспрессии генов растения. После введения вектора в клетку-хозяина, экспрессия представляющего интерес гена может инициироваться или увеличиваться, тем самым, продуцируя продукт экспрессии представляющего интерес гена в клетке-хозяине, например, в количестве в соответствии с регулирующим контролем слитого белка. Такие продукты экспрессии можно выделять и/или очищать из клетки-хозяина в соответствии с любым способом, известным в данной области.

Указанные выше и другие признаки станут очевидными из представленного ниже подробного описания нескольких вариантов осуществления, которое предоставлено с отсылкой на прилагаемые чертежи.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлен идентифицированный мотив взаимодействия субдомена II домена трансактивации VP16 (TAD) (SEQ ID NO:9). Звездочками указаны аминокислоты субдомена II домена трансактивации VP16, которые предположительно прямо контактируют с субъединицей Tfb1 TFIIH, как предположено в Langlois et al. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130:10596-604.

На фиг. 2 представлено выравнивание субдомена трансактивации II VP16 с идентифицированными TAD растений. Приведенные TAD растений содержат мотив взаимодействия. Выровненные мотивы взаимодействия выделены цветом. Остатки мотива взаимодействия субдомена II из VP16, которые предположительно контактируют с факторами транскрипции, обозначены звездочкой (*).

На фиг. 3 представлено выравнивание, демонстрирующее модификации, которые могут быть внесены в мотив взаимодействия TAD ERF2 для получения варианта мотива взаимодействия ERF2. Для сравнения приведены последовательности нативных мотивов взаимодействия ERF2 и VP16. Прямые контакты выделены.

На фиг. 4 представлено выравнивание, демонстрирующее модификации, которые могут быть внесены в мотив взаимодействия TAD PTI4 для получения варианта мотива взаимодействия PTI4. Для сравнения приведены последовательности нативных мотивов взаимодействия PTI4 и VP16. Прямые контакты выделены.

На фиг. 5 представлено выравнивание, демонстрирующие модификации, которые могут быть внесены в мотив взаимодействия TAD AtERF1 для получения варианта мотива взаимодействия AtEFR1. Для сравнения приведены последовательности нативных мотивов взаимодействия AtERF1 и VP16. Прямые контакты выделены.

На фиг. 6 представлено выравнивание, демонстрирующее модификации, которые могут быть внесены в мотив взаимодействия TAD ORCA2 для получения варианта мотива взаимодействия ORCA2. Для сравнения приведены последовательности нативных мотивов взаимодействия ORCA2 и VP16. Прямые контакты выделены.

На фиг. 7 представлено выравнивание, демонстрирующее модификации, которые могут быть внесены в мотив взаимодействия TAD DREB1A для получения варианта мотива взаимодействия DREB1A. Для сравнения приведены последовательности нативных мотивов взаимодействия DREB1A и VP16. Прямые контакты выделены.

На фиг. 8 представлено выравнивание, демонстрирующее модификации, которые могут быть внесены в мотив взаимодействия TAD CBF1 для получения варианта мотива взаимодействия CBF1. Для сравнения приведены последовательности нативных мотивов взаимодействия CBF1 и VP16. Прямые контакты выделены.

На фиг. 9 представлено выравнивание, демонстрирующее модификации, которые могут быть внесены в мотив взаимодействия TAD DOF1 для получения варианта мотива взаимодействия DOF1. Для сравнения приведены последовательности нативных мотивов взаимодействия DOF1 и VP16. Прямые контакты выделены.

На фиг. 10 представлена карта встраивающегося вектора дрожжей pHO-zBG-MEL1, который содержит участки связывания HAS (High Affinity Site, высокоаффинный участок) ZFP выше репортерного гена MEL1. Вектор был нацелен на локус HO S. cerevisiae и содержал ген устойчивости KanMX для селекции как в дрожжах, так и в бактериях.

На фиг. 11 представлена графическая иллюстрация уровней экспрессии репортерного гена Mel1, которая была результатом активации в дрожжах различных трансактивирующих мотивов взаимодействия.

На фиг. 12 представлена карта плазмиды pDAB9897: промотор актина 2 Arabidopsis thaliana, содержащий 8 тандемных участков связывания в виде цинковых пальцев (Z6) на 548-749 пар оснований выше участка начала транскрипции, запускающий репортерный ген gus, использованный для исследования слитых белков трансактивирующих мотивов взаимодействия растений в виде цинковых пальцев. Бинарный вектор также содержит промотор убиквитина 10 A. thaliana, контролирующий селективный маркер pat, для продукции заданного репортерного трансгенного объекта растений.

На фиг. 13 представлена карта плазмиды pDAB107881.

На фиг. 14 представлена карта плазмиды pDAB107882.

На фиг. 15 представлена карта плазмиды pDAB107883.

На фиг. 16 представлена карта плазмиды pDAB107884.

На фиг. 17 представлена карта плазмиды pDAB107885.

На фиг. 18 представлена карта плазмиды pDAB107886.

На фиг. 19 представлена карта плазмиды pDAB107887.

На фиг. 20 представлена карта плазмиды pDAB106272.

На фиг. 21 представлена карта плазмиды pDAB106238.

На фиг. 22 представлена карта плазмиды pDAB106273.

На фиг. 23 представлена карта плазмиды pDAB106274.

На фиг. 24 представлена карта плазмиды pDAB106275.

На фиг. 25 представлена карта плазмиды pDAB106276.

На фиг. 26 представлена карта плазмиды pDAB106277.

На фиг. 27 представлена карта плазмиды pDAB106278.

На фиг. 28 представлена карта плазмиды pDAB106279.

На фиг. 29 изображено графическое представление среднего значения и стандартного отклонения (робмы) и квартили (линии и рамки) уровня транскрипта gus, нормализованного к уровню эндогенной экспрессии гена, для различных введенных трансактивирующих мотивов взаимодействия растений. Активацию репортерного гена gus из различных трансактивирующих мотивов взаимодействия растений сравнивали с контролем в виде пустого вектора и активацией субъединицы домена II белка VP16.

На фиг. 30 представлена карта плазмиды pGalGUS: шесть тандемных участков связывания Gal4, слитых с промотором актина 2 A. thaliana, контролирующим репортерный ген gus, используют для исследования трансактивирующих мотивов взаимодействия растений, слитых со связывающим Gal4 белком. Бинарный вектор также содержит промотор убиквитина 10 A. thaliana, контролирующий селективный маркер pat, для продукции заданного репортерного трансгенного объекта растений.

На фиг. 30 представлена карта плазмиды pTALGUS: восемь тандемных участков связывания UPA-бокс, слитых с промотором актина 2 A. thaliana, контролирующим репортерный ген gus, используют для исследования трансактивирующих мотивов взаимодействия растений, слитых со связывающим TAL белком. Бинарный вектор также содержит промотор убиквитина 10 A. thaliana, контролирующий селективный маркер pat, для продукции заданного репортерного трансгенного объекта растений.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот, приведенные в прилагаемом списке последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. Представлена только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, однако понятно, что комплементарная цепь включена путем любого указания на представленную цепь. На прилагаемом списке последовательностей:

В SEQ ID NO:1 представлен домен трансактивации растений VP16, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVDDFEFEQMFTDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:2 представлен домен трансактивации растений ERF2, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): NDSEDMLVYGLLKDAFHFDTSSSDLSCLFDFPA

В SEQ ID NO:3 представлен домен трансактивации растений PTI4, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): CLTETWGDLPLKVDDSEDMVIYGLLKDALSVGWSPFSFTAG

В SEQ ID NO:4 представлен домен трансактивации растений AtERF1, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): CFTESWGDLPLKENDSEDMLVYGILNDAFHGG

В SEQ ID NO:5 представлен домен трансактивации растений ORCA2, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): FNENCEEIISPNYASEDLSDIILTDIFKDQDNYEDE

В SEQ ID NO:6 представлен домен трансактивации растений DREB1A, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): GFDMEETLVEAIYTAEQSENAFYMHDEAMFEMPSLLANMAEGM

В SEQ ID NO:7 представлен домен трансактивации растений CBF1, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): EQSEGAFYMDEETMFGMPTLLDNMAEG

В SEQ ID NO:8 представлен домен трансактивации растений DOF1, содержащий мотив взаимодействия (подчеркнут): SAGKAVLDDEDSFVWPAASFDMGACWAGAGFAD

В SEQ ID NO:9 представлен субдомен II домена трансактивации VP16, который представляет собой мотив взаимодействия в SEQ ID NO:1: DDFEFEQMFTD

В SEQ ID NO:10 представлен мотив взаимодействия домена трансактивации растений ERF2: DAFHFDTSSSD

В SEQ ID NO:11 представлен мотив взаимодействия домена трансактивации растений PTI4: DDSEDMVIYGLLKD

В SEQ ID NO:12 представлен мотив взаимодействия домена трансактивации растений AtERF1: ENDSEDMLV

В SEQ ID NO:13 представлен мотив взаимодействия домена трансактивации растений ORCA2: EDLSDIILTD

В SEQ ID NO:14 представлен мотив взаимодействия домена трансактивации растений DREB1A: ENAFYMHDEAMFEMP

В SEQ ID NO:15 представлен мотив взаимодействия домена трансактивации растений CBF1: DEETMFGMP

В SEQ ID NO:16 представлен мотив взаимодействия домена трансактивации растений DOF1: EDSFVWPAASFD

В SEQ ID NO:17-22 представлены последовательности вариантов мотива взаимодействия домена трансактивации растений ERF2.

В SEQ ID NO:23-28 представлены последовательности вариантов мотива взаимодействия домена трансактивации растений PTI4.

В SEQ ID NO:29-34 представлены последовательности вариантов мотива взаимодействия домена трансактивации растений AtERF1.

В SEQ ID NO:35-40 представлены последовательности вариантов мотива взаимодействия домена трансактивации растений ORCA2.

В SEQ ID NO:41-46 представлены последовательности вариантов мотива взаимодействия домена трансактивации растений DREB1A.

В SEQ ID NO:47-52 представлены последовательности вариантов мотива взаимодействия домена трансактивации растений CBF1.

В SEQ ID NO:53-58 представлены последовательности вариантов мотива взаимодействия домена трансактивации растений DOF1.

В SEQ ID NO:59-66 представлены праймеры, используемые для конструирования плазмиды pHO-zBG-MEL1.

В SEQ ID NO:67 представлена полинуклеотидная последовательность ДНК-связывающего домена: TGTGGTGGGAGAGGAGGGTGG

В SEQ ID NO:68 представлена последовательность 8x тандемного повтора ДНК-связывающего домена Z6: GGTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGGAGTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGCTCTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGAGATGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGTCTTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGGGATGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGCCTTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGAGGTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGCTTAAGCCGC

В SEQ ID NO:69-74 представлены праймеры и зонды, использованные в анализах HP pat и pal.

В SEQ ID NO:75-78 представлены праймеры, использованные для анализа способом ПЦР PTU в табаке.

В SEQ ID NO:79 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая нативный мотив взаимодействия домена трансактивации растений из VP16, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: GGCATGACCCATGATCCTGTGTCTTATGGAGCCTTGGATGTTGATGACTTTGAGTTTGAGCAGATGTTCACAGATGCACTGGGCATCGATGACTTTGGTGGA

В SEQ ID NO:80 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v3), кодирующая нативный мотив взаимодействия домена трансактивации растений из ERF2, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: AATGACTCTGAGGACATGCTGGTGTATGGTTTGCTCAAGGATGCCTTTCACTTTGACACCTCCAGCTCAGACCTCTCCTGCCTCTTTGACTTCCCAGCC

В SEQ ID NO:81 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v3), кодирующая нативный трансактивирующий мотив взаимодействия растений из PTI4, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TGCCTGACAGAAACTTGGGGAGACTTGCCTCTCAAGGTTGATGACTCTGAGGACATGGTGATCTATGGTCTGTTGAAGGATGCACTCTCAGTGGGGTGGTCCCCATTCTCTTTCACGGCTGGT

В SEQ ID NO:82 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v3), кодирующая нативный мотив взаимодействия домена трансактивации растений из AtERF1, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TGCTTCACGGAATCCTGGGGAGACCTTCCTTTGAAGGAGAATGACTCTGAGGACATGTTGGTGTACGGAATCCTCAATGATGCTTTTCATGGTGGC

В SEQ ID NO:83 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v3), кодирующая нативный мотив взаимодействия домена трансактивации растений из ORCA2, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TTCAATGAGAATTGTGAAGAAATCATCTCTCCAAACTACGCATCAGAGGACTTGTCTGACATCATCTTGACGGACATCTTCAAGGACCAAGACAACTATGAGGATGAG

В SEQ ID NO:84 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v3), кодирующая нативный мотив взаимодействия домена трансактивации растений из DREB1A, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: GGCTTTGACATGGAAGAAACATTGGTGGAGGCCATCTACACTGCTGAACAGAGCGAGAATGCCTTCTACATGCATGATGAGGCAATGTTTGAGATGCCATCTCTTCTGGCCAACATGGCTGAGGGAATG

В SEQ ID NO:85 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v3), кодирующая нативный мотив взаимодействия домена трансактивации растений из CBF1, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: GAACAGTCAGAAGGTGCTTTCTACATGGATGAAGAGACCATGTTTGGGATGCCAACCCTTCTGGATAACATGGCAGAGGGA

В SEQ ID NO:86 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v3), кодирующая нативный мотив взаимодействия домена трансактивации растений из DOF1, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TCAGCTGGGAAGGCAGTCTTGGATGATGAGGACAGCTTTGTTTGGCCTGCTGCATCCTTTGACATGGGTGCCTGCTGGGCTGGAGCTGGCTTTGCTGAC

В SEQ ID NO:87 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v2), кодирующая иллюстративный вариант мотива взаимодействия домена трансактивации растений из ERF2, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: AATGACTCTGAGGACATGCTGGTGTATGGTTTGCTCAAGGATGATTTCCACTTTGAGACAATGTTCTCAGACCTGTCCTGCCTCTTTGACTTCCCAGCC

В SEQ ID NO:88 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v2), кодирующая иллюстративный вариант мотива взаимодействия домена трансактивации растений из PTI4, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TGCCTGACAGAAACTTGGGGAGACTTGCCTCTCAAGGTTGATGACTTTGAGTTTGAGATGATGTTCACAGATGCACTCTCAGTGGGGTGGTCCCCATTCTCTTTCACGGCTGGT

В SEQ ID NO:89 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v2), кодирующая иллюстративный вариант мотива взаимодействия домена трансактивации растений из AtERF1, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TGCTTCACGGAATCCTGGGGAGACCTTCCTTTGAAGGAGAATGACTTTGAGTTTGAAATGTTCACAGATTACGGAATCCTCAATGATGCTTTTCATGGTGGC

В SEQ ID NO:90 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v2), кодирующая иллюстративный вариант мотива взаимодействия домена трансактивации растений из ORCA2, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TTCAATGAGAATTGTGAAGAAATCATCTCTCCAAACTACGCATCAGAGGACTTTGATCTTGAGATGTTGACGGACATCTTCAAGGACCAAGACAACTATGAGGATGAG

В SEQ ID NO:91 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v2), кодирующая иллюстративный вариант мотива взаимодействия домена трансактивации растений из DREB1A, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: GGCTTTGACATGGAAGAAACATTGGTGGAGGCCATCTACACTGCTGAACAGAGCGAGGACTTTGAGTTTGAAGCAATGTTCATGGATTCTCTTCTGGCCAACATGGCTGAGGGAATG

В SEQ ID NO:92 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v2), кодирующая иллюстративный вариант мотива взаимодействия домена трансактивации растений из CBF1, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: GAACAGTCAGAAGGTGCTTTCTACATGGATGACTTTGAGTTCGAGACAATGTTCATGGACACCCTTCTGGATAACATGGCAGAGGGA

В SEQ ID NO:93 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность (v2), кодирующая иллюстративный вариант мотива взаимодействия домена трансактивации растений из DOF1, который был слит со связывающим белком с цинковыми пальцами Z6: TCAGCTGGGAAGGCAGTCTTGGATGATGAGGACTTTGAGTTTGAAGCCATGTTCACGGACATGGGTGCCTGCTGGGCTGGAGCTGGCTTTGCTGAC

В SEQ ID NO:94-98 представлены праймеры и зонды, использованные в анализах HP gus и BYEEF.

В SEQ ID NO:99 представлена последовательность тандемного повтора, взятая из консенсусной связывающей последовательности индуцируемых AVRBS3 генов, и называемая ДНК-связывающим доменом UPA: TATATAAACCTNNCCCTCT

В SEQ ID NO:100 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий мотив взаимодействия домена трансактивации ERF2 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVDAFHFDTSSSDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:101 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий мотив взаимодействия домена трансактивации PTI4 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVDDSEDMVIYGLLKDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:102 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий мотив взаимодействия домена трансактивации AtERF1 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVENDSEDMLVALGIDDFGG

В SEQ ID NO:103 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий мотив взаимодействия домена трансактивации ORCA2 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVEDLSDIILTDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:104 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий мотив взаимодействия домена трансактивации DREB1A растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVENAFYMHDEAMFEMPALGIDDFGG

В SEQ ID NO:105 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий мотив взаимодействия домена трансактивации CBF1 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVDEETMFGMPALGIDDFGG

В SEQ ID NO:106 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий мотив взаимодействия домена трансактивации DOF1 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVEDSFVWPAASFDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:107 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации ERF2 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVDDFHFETMFSDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:108 представлен дополнительный иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации ERF2 растений (подчеркнут): NDSEDMLVYGLLKDDFHFETMFSDLSCLFDFPA

В SEQ ID NO:109 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации PTI4 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVDDFEFEMMFTDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:110 представлен дополнительный иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации PTI4 растений (подчеркнут): CLTETWGDLPLKVDDFEFEMMFTDALSVGWSPFSFTAG

В SEQ ID NO:111 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации AtERF1 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVENDFEFEMFTDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:112 представлен дополнительный иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации AtERF1 растений (подчеркнут): CFTESWGDLPLKENDFEFEMFTDYGILNDAFHGG

В SEQ ID NO:113 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации ORCA2 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVEDFDLEMLTDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:114 представлен дополнительный иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации ORCA2 растений (подчеркнут): FNENCEEIISPNYASEDFDLEMLTDIFKDQDNYEDE

В SEQ ID NO:115 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации DREB1A растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVEDFEFEAMFMDALGIDDFGG

В SEQ ID NO:116 представлен следующий иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации DREB1A растений (подчеркнут): GFDMEETLVEAIYTAEQSEDFEFEAMFMDSLLANMAEGM

В SEQ ID NO:117 представлен иллюстративный синтетический домен трансактивации, содержащий вариант мотива взаимодействия домена трансактивации CBF1 растений (подчеркнут): GMTHDPVSYGALDVDDFEFETMFMDALGIDDFGG

В SEQ ID