Способ получения сульфатированного производного 3,5-дийод-o-[3-йодфенил]-l-тирозина

Способ получения сульфатированного производного 3,5-дийод-o-[3-йодфенил]-l-тирозина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу получения сульфатированных производных тиреоидных гормонов или их солей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Тиреоидный гормон трийодтиронин (3,5-дийод-O-[3-йодфенил]-L-тирозин, или T3) является метаболически наиболее активным тиреоидным гормоном. Как и тироксин (T4), он физиологически продуцируется щитовидной железой и хранится вместе с ним в форме тиреоглобулина, гликопротеина-предшественника. Одна молекула тиреоглобулина в среднем содержит 3 или 4 остатка T4 и самое большее 1 остаток T3. Продуцирование TSH активирует протеолиз тиреоглобулина с помощью ферментов катепсина D, B и L с высвобождением тиреоидных гормонов T3 и T4. Однако образование T3 не ограничивается этим механизмом: в действительности, в периферических тканях тироксин превращается в трийодтиронин (80% трийодтиронина продуцируется из тироксина в периферических тканях и 20% продуцируется внутри щитовидной железы).

Важность T3 обусловлена не только тем, что он является наиболее активным тиреоидным гормоном. В действительности, в связи с этим известно, что его дефицит приводит к различным патологическим состояниям. В частности, например, в нервной ткани во время эмбрионального развития и в детстве дефицит T3 приводит к уменьшению роста головного мозга и коры мозжечка, пролиферации аксонов, миграции клеток, миелинизации, ветвления дендритов и генеза синапсов. При дефиците T3 на начальных стадиях жизни наблюдается задержка развития центральной нервной системы с последующими нарушениями познавательной способности и моторики, которые могут привести к клинической картине, называющейся кретинизмом. Кроме того, для взрослых с помощью позитронно-эмиссионной томографии головного мозга показано, что при уменьшении содержания трийодтиронина уменьшается кровоток в головном мозге и метаболизм глюкозы в головном мозге. Эти данные могут объяснить дефицит психомоторики у страдающих гипотиреозом индивидуумов.

В дополнение к проявлениям, наблюдающимся в нервной ткани, известны проявления и в костной ткани, когда эндохондральное окостенение стимулируется трийодтиронином, что делает кости линейно длиннее вследствие созревания костных центров в эпифизе. Даже если трийодтиронин не является необходимым для линейного роста костей после рождения, он важен для надлежащего развития костей плода.

Кроме того, доказано влияние T3 на ткани эпидермиса, когда трийодтиронин не только участвует в их созревании и придатках кожи, но и в их деградации, тем самым стимулируя регенерацию клеток. Поэтому и избыток, и дефицит этого гормона может привести к кожным нарушениям.

Поэтому тиреоидный гормон T3 с определенностью можно считать плейотропным гормоном, который в дополнение к указанных воздействиям влияет на кроветворную ткань, в которой он увеличивает продуцирование эритропоэтина и, следовательно, гемопоэз; на жировые ткани, в которых он стимулирует созревание преадипоцитов в адипоциты, усиливает липолиз жирных кислот и, кроме того, регулирует метаболизм холестерина.

Гипотиреоз, очень часто вызываемый аутоиммунными патологиями, является довольно распространенным: в действительности, среди итальянцев он встречается примерно у 1,5% женщин и 1% мужчин. Он удовлетворительно лечится фармакологически с помощью заместительной терапии, в основном основанной на синтетическом левотироксине (T4), обычно использующимся лекарственным средством вследствие очень небольшого периода полувыведения более активной формы, т.е. T3, которую по этой причине нельзя использовать стандартным образом.

Однако и лечение левотироксином обладает некоторыми недостатками, связанными с тем фактом, что, когда сохраняется плазматический эутиреоз, тканевый протекает не всегда. Исследование фармакологических альтернатив, таких как предложенные на основе тиромиметической активности T3, описанной в EP 1560575 B, может стать желательной альтернативой выбирающимся в настоящее время средствам.

Однако применительно к T3S основным недостатком, видимо, являются трудности крупномасштабного синтеза. В действительности, до настоящего времени T3S могли получать только в лаборатории.

В связи с этим получение T3S из T3 с помощью сульфатирующих реагентов, например, концентрированной серной кислоты (H₂SO₄) или хлорсульфоновой кислоты (ХСК), взятых в большом избытке, описано, например, в US2970165 и Biochim. Biophys. Acta, 33, 461 (1959), где представлено получение T3S из T3 в твердой форме путем прямого добавления концентрированной серной кислоты при низких температурах.

В Endocrinology, Vol.117, № 1, 1-7 (1985) и Endocrinology, Vol.117, № 1, 8-12 (1985) описан синтез T3S из T3 путем проводимого при охлаждении добавления раствора хлорсульфоновой кислоты (ХСК) в диметилформамиде с последующей стадией очистки с помощью Sephadex LH-20.

Однако до настоящего времени ни один из способов предшествующего уровня техники невозможно было использовать для получения граммовых количеств конечного продукта в чистом виде, в основном по той причине, что в описанных методиках очистки необходимо использовать чрезвычайно большие объемы.

Установлено, что реакция сульфатирования, начинающаяся с использования трийодтиронинхлорсульфоновой кислоты (ХСК) в качестве сульфатирующего реагента, в присутствии диметилацетамида (ДМАЦ) приводит к высоким степеням превращения. Кроме того, очистку можно проводить с использованием меньших объемов, чем указанные для известных способов предшествующего уровня техники. В конечном счете продукт T3S можно очистить до степени, необходимой для клинического применения и получить необходимые количества (сотни граммов) и при условиях, подходящих для производства в промышленном масштабе.

Кроме того, поскольку, до настоящего времени описаны только радиоактивные анализы определения уровней T3S в выворотке, такие как RIA (радиоиммуноанализ), описанный у Chopra et al. (J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194), необходимы более безопасные методики иммунологического анализа, основанные, например, на нерадиоактивных реагентах. Применение таких реагентов также позволит клиническим и/или исследовательским структурам проводить эти измерения. Для этого разработаны методики иммунологического анализа, и они являются частью настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Диаграмма a) калибровочная кривая для T3S, полученная с помощью конкурентного ELISA; диаграмма b) калибровочная кривая полученная с помощью DELFIA. Определение T3S проводили при 33,6, 56, 93,3, 155,5, 259, 432, 720, 1200, 2000 пг/мл.

Фиг. 2. Схема синтеза моноамида диэтилентриаминпентауксусной кислоты-T3S (ДТПК-T3S).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения монокатионной соли 3,5-дийод-O-[3-йод-4-(сульфоокси)фенил]-L-тирозина формулы II (T3S) с использованием в качестве исходного вещества 3,5-дийод-O-(4-гидрокси-3-йодфенил)-L-тирозина формулы I или его соли, по схеме:

где M означает щелочной металл, предпочтительно Na,

включающему стадии:

a) сульфатирование соединения формулы I или их солей хлорсульфоновой кислотой (ХСК) в присутствии диметилацетамида (ДМАЦ) в качестве растворителя;

b) образование соли сульфатированного производного, полученного на стадии a), с получением соединения формулы II (T3S) путем добавления реакционной смеси, полученной на стадии a), к водному раствору неорганической соли щелочного металла, предпочтительно монокатионной соли натрия, еще более предпочтительно NaHCO₃.

В особенно предпочтительном варианте осуществления соединение формулы I (T3) получают йодированием соединения формулы III (T2):

йодирующим агентом, предпочтительно с помощью NaI и I₂, в присутствии алифатического амина, предпочтительно выбранного из числа линейных моноалкил(C₁-C₄)-алифатических аминов, из которых предпочтительным является этиламин.

Добавление йодирующего агента проводят в присутствии водного растворителя, предпочтительно воды, предпочтительно при температуре, ниже чем 25°C. Предпочтительно, если йодирующий агент содержится в молярном отношении, составляющем от 0,9 до 1,1 моль/моль соединения III (T2).

Таким образом, способ получения T3S включает получение T3 йодированием T2 при описанных выше условиях и последующее сульфатирование хлорсульфоновой кислотой в диметилацетамиде, что лучше описано в подробном описании.

Кроме того, другим объектом настоящего изобретения также является приготовление активного вещества, T3S, в виде фармацевтических композиций, предпочтительно твердых, при котором T3S, предпочтительно в порошкообразной форме, смешивают с разбавляющим агентом и затем агентом, улучшающим сыпучесть, смазывающим агентом, предпочтительно глицериндибегенатом, и разрыхляющим агентом, предпочтительно кроскармеллозой или ее производными, добавляют к смеси в просеянном виде и дополнительно перемешивают с разбавляющей смесью, содержащей активное вещество.

Таким образом, в соответствии с этим вариантом осуществления способ включает стадию, на которой разбавитель, например, микрокристаллическую целлюлозу, добавляют одной или большим количеством порций, их перемешивают, затем получают смесь, содержащую агент, улучшающий сыпучесть, предпочтительно глицериндибегенат, смазывающий агент, предпочтительно стеарат магния или цинка, гидратированный коллоидный диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния и предпочтительно также разрыхляющий агент, предпочтительно кроскармеллозу или ее производные; затем их просеивают и затем дополнительно перемешивают со смесью, содержащей активное вещество вместе с разбавителем. Затем можно добавить другие эксципиенты, стабилизаторы и разбавители (такие как, например, карбонат кальция) и перемешать в течение подходящего времени.

Особенно предпочтительным объектом настоящего изобретения также является таблетка, полученная описанным выше способом, содержащая T3S в качестве активного вещества в количестве, равном от 1 до 1000 мкг, и содержащая следующие разбавители, эксципиенты, вещества, придающие скользкость и смазывающие вещества: карбонат кальция, глицериндибегенат, натриевая соль кроскармеллозы, гидратированный коллоидный диоксид кремния, стеарат магния, микрокристаллическая целлюлоза. Предпочтительные количества для одной дозы указаны в приведенной ниже таблице:

	Количество в одной таблетке
Карбонат кальция	20-40 мг
Глицериндибегенат	2-15 мг
Натриевая соль кроскармеллозы	1-10 мг
Гидратированный коллоидный диоксид кремния	0,1-5 мг
Стеарат магния	0,01-2 мг
Микрокристаллическая целлюлоза	По меньшей мере 30 мг

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения являются нерадиоактивные иммуноанализы.

Предпочтительно, если иммунологическим анализом является иммуноферментный анализ (ELISA), более предпочтительно конкурентный ELISA, наиболее предпочтительно проводимый в многолуночном планшете с использованием в качестве детектируемого фрагмента флуоресцентной группы или фермента (например, пероксидазы хрена (HRP), щелочной фосфатазы и т.п.) или фрагмента, детектирующего производное авидина (т.е. биотина).

В качестве дальнейшего развития нерадиоактивных анализов по определению T3S, разработаны реагенты для лантанидного флуоресцентного иммунологического анализа. Этот анализ, синтезированные реагенты и наборы для количественного определения T3S на основе этих новых реагентов являются другим объектом настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Объектом настоящего изобретения является способ получения сульфатированной формы тиреоидного гормона T3, 3,5-дийод-O-[3-йод-4-(сульфоокси)фенил]-L-тирозина (T3S), имеет формулу II, в виде монокатионной соли с использованием в качестве исходного вещества 3,5-дийод-O-[4-гидрокси-3-йодфенил]-L-тирозина формулы I или его производного-соли:

где M означает щелочной металл, предпочтительно Na, который включает стадии:

a) сульфатирование соединения формулы I (T3) хлорсульфоновой кислотой (ХСК) в присутствии диметилацетамида (ДМАЦ) в качестве растворителя,

b) образование соли сульфатированного производного, полученного на стадии a), с получением соединения формулы II. Образование соли обычно проводят путем добавления полученной реакционной смеси в a) водный раствор неорганической соли щелочного металла, предпочтительно натриевой соли, еще более предпочтительно Na₂CO₃ или NaHCO₃.

Для задач настоящего изобретения T3S означает соединение формулы II, представляющее собой сульфатированную форму трийодтиронина или его монокатионных солей (соединение формулы II).

Стадию a) проводят путем добавления ХСК к суспензии T3 в ДМАЦ при охлаждении при постоянном энергичном перемешивании раствора.

Температуру поддерживают при значениях, равных ниже примерно 10°C, более предпочтительно от -10°C до 8°C, более предпочтительно от -8°C до 6°C, еще более предпочтительно от -5°C до 5°C.

Добавление ХСК к суспензии выполняют медленно, предпочтительно в течение периода времени, равного от 30 до 60 мин, в зависимости от количеств использующихся реагентов и предпочтительно в инертной атмосфере, например, в атмосфере азота или аргона.

В предпочтительном варианте осуществления отношение количества молей ХСК к количеству молей T3 превышает 4, предпочтительно равно от 4,5 до 10, еще более предпочтительно равно от 7 до 9. Еще более предпочтительно равно от 7,5 до 8,5 моля ХСК/моль T3. Концентрация T3 в ДМАЦ, выраженная в молях T3/л ДМАЦ, равна от 0,06 до 0,15 моль/л, более предпочтительно от 0,12 до 0,14 моль/л. Следовательно, отношение количества ХСК к количеству растворителя может равняться от 0,35 до 1,28 моля ХСК/л ДМАЦ, предпочтительно от примерно 0,8 до 1,15 моль/л, еще более предпочтительно от примерно 0,96 до 1,1 моля ХСК/л ДМАЦ.

После добавления ХСК реакции в смеси дают протекать в течение периода времени, не превышающего 4-5 ч, обычно без охлаждения, давая температуре достичь комнатной температуры (20-25°C).

Сульфатирование обычно завершается при заданных условиях, когда более 85%, предпочтительно более 90%, еще более предпочтительно более 95% T3 превратилось в T3S.

В особенно предпочтительном варианте осуществления перед стадией a) способа проводят добавление ХСК к раствору T3 в ДМАЦ при концентрации, равной 0,12-0,14 моля T3/л ДМАЦ, и предпочтительное отношение составляет примерно 8 молей ХСК на 1 моль T3, при температуре, равной от примерно -5°C до примерно 5°C, в течение периода времени, равного 30-40 мин. После окончания добавления охлаждение обычно прекращают и температуре дают повышаться до комнатной температуры (равной от примерно 15 до 25°C) в течение не более 4-5 ч, предпочтительно не более 2-3 ч.

Затем в соответствии со стадией образование соли b) сульфатирующую смесь добавляют к водному раствору неорганической соли щелочного металла, предпочтительно монокатионной, где Na является особенно предпочтительным катионом, в таком количестве, чтобы нейтрализовать содержащуюся хлорсульфоновую кислоту.

Образование соли предпочтительно проводят в водном растворе карбоната натрия (Na₂CO₃) или гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), взятом в количестве, зависящем от количества хлорсульфоновой кислоты, использующейся на предыдущей стадии, и по меньшей мере достаточном для нейтрализации полученного раствора. Обычно при использовании Na₂CO₃ достаточным является количество, равное примерно 1,5 моля на 1 моль ХСК. В этом варианте осуществления концентрация раствора Na₂CO₃ равна примерно 0,7 моль/л. При таких условиях после нейтрализации обеспечивается значение pH раствора, равное от 6,5 до 7,5.

В этом варианте осуществления соответствующая полученная монокатионная соль соединения T3S описывается формулой II, в которой M предпочтительно означает Na.

Добавление реакционной смеси в соответствии со стадией b) проводят в течение периода времени, который является переменным, обычно составляя от 1 ч до 3 ч, при поддержании температуры равной ниже 30°C.

Соединение T3S формулы II, полученное в растворе в виде монокатионной соли в соответствии с описанной выше стадией b), очищают с помощью хроматографии в соответствии со следующей стадией c). Перед хроматографией необязательно проводят осаждение и/или фильтрование, например, гравитационное или в вакууме реакционной смеси, полученной на стадии b), для уменьшение количества неорганических солей, которые образуются в качестве побочных продуктов.

Хроматографию (c) проводят на адсорбирующей смоле полимерного типа. Предпочтительно, если эта смола образует макросетчатую ароматическую полимерную матрицу. Примерами предпочтительных смол являются XAD^TM Amberlites^TM, еще более предпочтительно Amberlite^TM XAD^TM 1600.

Как хорошо известно, перед использованием смолу активируют по методикам, известным в данной области техники, таким как, например, промывка водой, ацетоном и т.п. (общее описание приведено в публикации Rohm and Haas in “Laboratory Column Procedures and Testing of Amberlite and Duolite Polymeric Adsorbents”, section “Preparation of Resins”). В способе, предлагаемом в настоящем изобретении, смолу предпочтительно активируют растворителем, выбранным для последующего элюирования (т.е. ацетоном или смесью вода/ацетон).

T3S предпочтительно элюируют из смолы элюирующей смесью растворителей с полярностью, уменьшающейся в градиентном режиме, начиная со смеси, обладающей наибольшей полярностью. В предпочтительном варианте осуществления указанной элюирующей смесью сначала является вода, затем ее последовательно разбавляют подходящим полярным органическим растворителем, в подходящих обратных отношениях.

Предпочтительными элюирующими смесями являются смеси вода/ацетонитрил и вода/ацетон в отношениях, составляющих от 1:0 до 0,7:0,3. Предпочтительно, если элюирующей смесью является смесь воды и ацетона в отношении, составляющем от 1:0 до 0,85:0,15, и скорость элюирования через колонку обычно равна от 0,9 до 1,1 объемов колонки/ч.

Фракции, элюирующиеся из колонки и содержащие конечный продукт, обладающий чистотой, превышающей 95%, более предпочтительно превышающей 96%, 98%, 99% (определено по аналитическим методикам, хорошо известным в данной области техники, таким как, например, УФ-детектирование и анализ с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)), собирают и объединяют, и активное вещество можно выделить путем выпаривания растворителя, т.е. в вакууме, с помощью сушки вымораживанием или по другим известным методикам.

Однако в предпочтительном варианте осуществления элюирующиеся фракции концентрируют, например, путем частичного выпаривания в вакууме до концентрации, равной примерно 10 г/кг раствора.

При этой концентрации значение pH раствора доводят до значений, равных менее 6,5, предпочтительно равных от 5,5 до 6,5, путем добавления разбавленного раствора сильной неорганической кислоты, предпочтительно кислоты, представляющей собой серной кислоту или хлористоводородную кислоту, хлористоводородная кислота является особенно предпочтительной, и используют в разбавленном виде при концентрации, равной от 0,9 до 1,1 н.

Раствор дополнительно концентрируют примерно в 10-15 раз и T3S можно выделить в виде твердого вещества например, с помощью сушки вымораживанием, распылительной сушки или, предпочтительно путем обработки органическим растворителем, предпочтительно полярного типа и затем необязательно дополнительно микронизируют.

Таким образом, в этом предпочтительном варианте осуществления соединение формулы II выделяют в твердой форме путем обработки растворителем, выбранным из группы, включающей: ацетон, ацетонитрил и C₁-C₄-спирты. Однако можно использовать другие растворители, которые выбраны из группы, включающей: ароматические алканы, простые эфиры, хлорированные растворители, сложные эфиры, диметилформамид, нитрометан, диметилсульфоксид, 2-метоксиэтанол или их смеси, которые позволяют получить и выделить соль в твердой форме и.

Таким образом, при подробном описании после хроматографии и концентрирования содержащих T3S фракций до концентрации, равной примерно 10 г/кг раствора, установления значений pH, равных ниже 6,5, предпочтительно равных от 5,5 до 6,5, и дополнительного выпаривания до концентрации соединения формулы II, равной от 170 до 500 г/кг суспензии или геля, концентрированный раствор обрабатывают органическим растворителем. Предпочтительно, если указанный растворитель является полярным органическим растворителем, выбранным из группы, включающей: ацетон, низшие спирты, такие как, например, этанол, пропанол, изопропанол и т.п., и ацетонитрил, ацетон является особенно предпочтительным.

Добавление ацетона к концентрированному раствору T3S проводят при температуре, равной от 20 до 25°C, предпочтительно при выдерживании смеси при перемешивании в течение 1-3 ч при температуре, равной от 0 до 25°C, для обеспечения полного осаждения твердой формы монокатионной соли T3S.

Добавление растворителя к суспензии проводят в известных отношениях: если используют ацетон, его добавляют в количестве, равном 1-11 г ацетон/г T3S, при температуре, равной 20-25°C.

Таким образом монокатионное производное формулы II или, более предпочтительно, его натриевую соль получают в твердой форме после отделения жидкой фазы от твердой, например, фильтрованием, по данным ВЭЖХ обладающее чистотой, превышающей 95%, более предпочтительно, превышающей 96%, 98% или даже >99%.

Таким образом, в целом способ, предлагаемый в настоящем изобретении, позволяет обеспечить выделение конечного продукта (T3S) с высокими выходами (суммарный выход: ≥60%) и высокой чистоты (по данным ВЭЖХ >99%).

В действительности, что является улучшением по сравнению со способами предшествующего уровня техники, уже на стадии сульфатирования смеси a) в присутствии ДМАЦ содержание побочных продуктов составляет менее 10%, обычно менее 7%.

Высокая степень превращения в реакции сульфатирования и последующего образования соли позволяет получить продукт в чистом виде с помощью промышленно применимой стадии хроматографирования и с использованием ограниченных объемов.

T3S эффективно отделяется от побочных продуктов и обладает достаточной чистотой (>99%), даже если его получают в количестве, составляющем сотни граммов, что делает возможным применение этого производного трийодтиронина в клинической практике.

Для приготовления препаратов, предназначенных для клинического применения, T3S в твердой форме и чистотой до 99% для уменьшения размера частиц предпочтительно дополнительно микронизируют, например, под давлением в атмосфере азота.

Особенно предпочтительными являются частицы размером менее 25 мкм (по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% частиц с размерами, равными менее 25 мкм), что обеспечивает стабильность в течение по меньшей мере месяца при ускоренных испытаниях стабильности в климатической камере.

Поэтому в соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения способ включает микронизацию твердого T3S в чистой форме с получением частиц указанного выше размера и их применение для приготовления твердых составов, предназначенных для перорального введения.

В соответствии с этим вариантом после микронизации T3S готовят вместе с подходящими дополнительными компонентами в виде порошкообразных смесей, также необязательно в гранулированной или микрогранулированной форме, предпочтительно готовят в виде таблетки или пилюли, полученной путем прямого прессования порошкообразной смеси.

Препарат T3S в твердой форме или, более предпочтительно, в виде таблетки, получают путем добавления к микронизированному активному веществу (или веществам, если предпочтительна комбинация с левотироксином) сначала части необходимого конечного разбавителя, предпочтительно 30, 40 или предпочтительно по меньшей мере 50% разбавителя, и их смешивания с получением смеси a).

Предпочтительным разбавителем является целлюлоза или ее производные, например, микрокристаллическая целлюлоза. Другими подходящими разбавляющими агентами являются каолин, крахмал или неорганические соли щелочного металла, такие как карбонат магния или кальция. Особенно предпочтительным является карбонат кальция, более предпочтительно вместе с микрокристаллической целлюлозой.

Затем смесь a) смешивают со смесью b), содержащей дополнительные компоненты, обычно: агент, придающий скользкость, смазывающий агент и разрыхляющий агент, которую просеивают и затем смешивают со смесью a), содержащей активное вещество.

Из разрыхляющих агентов, особенно предпочтительной является кроскармеллоза или ее производные. Другими подходящими для этой цели агентами являются кросповидон, полиметакрилаты, мальтодекстрины, натриевая соль гликолята крахмала, предварительно желатинизированный крахмал, альгинат натрия.

Из агентов, придающих скользкость, особенно предпочтительным является глицериндибегенат. Другими подходящими веществами, придающими скользкость являются: трикальцийфосфат, тальк, крахмал или его производные.

Из смазывающих агентов особенно предпочтительными являются стеарат магния или цинка, коллоидный гидратированный диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния. Другие эксципиенты, стабилизаторы и разбавители (такие как, например, карбонат кальция) можно последовательно добавлять и перемешивать в течение разного времени. Затем конечную смесь отмеряют и таблетки предпочтительно получают прямым прессованием.

T3S содержится в твердых дозированных формах в количествах, равных от 1 до 1000 мкг, более предпочтительно от 2,5 до 500 мкг, еще более предпочтительно от 5 до 250 мкг, в виде единственного активного вещества, или в комбинации с другими активными веществами, предпочтительно с T4 (левотироксин). В этом варианте осуществления T4 содержится в количествах, равных от 1 до 800 мкг, или 5-400 мкг, более предпочтительно 10-200 мкг. Затем при изготовлении таблеток, содержащих и T3, и T4 в качестве активных веществ, их смешивают с предпочтительным разбавителем (разбавителями) в смеси a) и дополнительно смешивают с другими компонентами, которые, в свою очередь, предварительно перемешаны, как описано выше.

Поэтому предпочтительным объектом настоящего изобретения является таблетка, приготовленная описанным выше способом, содержащая T3S в качестве активного вещества, в количестве, равном от 1 до 1000 мкг, вместе со следующими дополнительными компонентами:

- разбавитель, выбранный из целлюлозы или ее производных, предпочтительно вместе со вторым разбавителем, предпочтительно карбонатом кальция, содержание которого составляет до 35% от всего разбавителя (мас./мас.);

- агент, придающий скользкость, выбранный из глицериндибегената (наиболее предпочтительный), талька, производных диоксида кремния, из которых трисиликат магния, амиды, трикальцийфосфат обычно содержатся в композиции в количестве, находящемся в диапазоне от 1 до 10%, наиболее предпочтительно 4 до 6% (мас./мас.);

- разрыхлитель, выбранный из крахмала, натриевой соли кроскармеллозы и кросповидона. Предпочтительной является натриевая соль кроскармеллозы в количестве, находящемся в диапазоне от 0,5 до 10%, еще более предпочтительно в количестве, равном 1-5%, наиболее предпочтительно в количестве, равном от 2 до 4% (мас./мас.);

- смазывающее вещество, выбранное из стеарата магния, гидратированного коллоидного диоксида кремния и талька, более предпочтительно стеарата магния и коллоидного диоксида кремния, содержащихся в полном количестве, находящемся в диапазоне от 0,1 до 7% еще более предпочтительно, если первый содержится в количестве, равном от 0,1 до 2%, и второй содержится в количестве, равном от 0,5 до 5% (мас./мас.).

Особенно предпочтительными в качестве эксципиентов являются следующие ингредиенты: карбонат кальция, глицериндибегенат, натриевая соль кроскармеллозы, гидратированный коллоидный диоксид кремния, стеарат магния, микрокристаллическая целлюлоза, содержащиеся в следующих предпочтительных количествах:

	Количество в одной таблетке
Карбонат кальция	20-40 мг, предпочтительно 25-35 мг, более предпочтительно 30 мг
Глицериндибегенат	2-15 мг, предпочтительно 4-8 мг, более предпочтительно 5 мг
Натриевая соль кроскармеллозы	1-10 мг, предпочтительно 2-6 мг, более предпочтительно 3,5 мг
Гидратированный коллоидный диоксид кремния	0,1-5 мг, предпочтительно 0,5-4, более предпочтительно 2 мг
Стеарат магния	0,01-2 мг, предпочтительно 0,1-1 мг, более предпочтительно 0,5 мг
Микрокристаллическая целлюлоза	По меньшей мере 30 мг

В более предпочтительном варианте осуществления композиция содержит от 2,5 до 500 мкг T3S или, более предпочтительно, 5-250 мкг T3S.

В комбинированных композициях, в которых также содержится T4, T3S предпочтительно содержится в количестве, равном 2,5-500 мкг, и T4 в количестве, равном от 1 до 800 мкг, или, еще более предпочтительно: T3S: 5-250 мкг и T4: 5-400 мкг, или T3S: 10-100 мкг и T4 10-200 мкг.

Следует понимать, что указанные выше количества относятся к разовым дозированным формам, предпочтительно к таблеткам массой примерно 110 мг, предпочтительно предназначенным для ежедневного введения разовой дозы, хотя специалист в данной области техники может представить себе альтернативные формы композиции, массы таблетки и/или схемы медикаментозного лечения.

Таблетки, соответствующие предпочтительному варианту осуществления, обладают оптимальными скоростями растворения (см. приведенную ниже таблицу) и оптимальной стабильностью активного вещества (веществ) (в течение по меньшей мере 24 месяцев).

Приведенные ниже характеристики определены при условиях, соответствующих требованиям руководств Международной конференции по гармонизации:

Исследование растворимости	≥75% через 45 мин
Влажность	≤10%
Сопротивление раздавливанию	≥20 Н
Содержание T3S по данным ВЭЖХ	90-110%
Содержание T4 по данным ВЭЖХ (если содержится)	90-110%

Для способа, предлагаемого в настоящем изобретении, все реагенты, включая T3 (соединение формулы I), имеются в продаже.

Однако в особенно предпочтительном варианте осуществления T3 получают йодированием соединения формулы III (3,5-дийодтиронин, леводити, или T2):

йодирующим агентом, предпочтительно NaI и I₂, в присутствии алифатического амина, предпочтительно выбранного из числа линейных моноалкил(C₁-C₄)-алифатических аминов, из которых предпочтительным является этиламин. T2 предпочтительно получают так, как описано.

Добавление йодирующего агента проводят в присутствии водного растворителя, предпочтительно воды, при температуре предпочтительно равной ниже 25°C.

Предпочтительно, если йодирующий агент содержится в молярном отношении, составляющем от 0,9 до 1,1 моль/моль соединения III (T2).

После йодирования T3 отделяют, предпочтительно фильтрованием, в виде натриевой соли, затем превращают в кислотную форму путем повторного суспендирования в воде и подкисления кислотой, предпочтительно уксусной кислотой или серной кислотой.

Кислотную форму отделяют, предпочтительно фильтрованием, также путем повторного суспендирования в воде для удаления солей и фильтрования.

T3 в виде влажного твердого вещества суспендируют в N,N-диметилацетамиде, суспензию обезвоживают и вводят в реакцию сульфатирования.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления отношение количества молей ХСК к количеству молей T3 превышает 4, предпочтительно равно от 4,5 до 10, еще более предпочтительно равно от 7 до 9. Еще более предпочтительно равно от 7,5 до 8,5 моля ХСК/моль T3. Концентрация T3 в ДМАЦ, выраженная в виде количества молей T3/л ДМАЦ, равна от 0,10 до 0,15 моль/л, более предпочтительно от 0,12 до 0,14 моль/л. Отсюда следует, что отношение количества ХСК к количеству растворителя может составлять от 0,58 до 1,28 моля ХСК/л ДМАЦ, предпочтительно от 0,89 до 1,15 моль/л, еще более предпочтительно от 0,96 до 1,09 моля ХСК/л ДМАЦ.

После добавления ХСК смеси дают взаимодействовать в течение периода времени, не превышающего 4-5 ч, обычно без охлаждения, давая температуре повыситься до комнатной температуры.

При описанных условиях сульфатирование обычно завершается, когда более 85%, предпочтительно более 90%, еще более предпочтительно более 95% T3 превращается в T3S.

В особенно предпочтительном варианте осуществления перед стадией a) способа проводят добавление ХСК к раствору T3 в ДМАЦ при концентрации, равной 0,12-0,14 моля T3/л ДМАЦ, и предпочтительное соотношение составляет примерно 8 молей ХСК на 1 моль T3 при температуре, равной от примерно -5°C до примерно 10°C, в течение периода времени, равного 30-40 мин. После окончания добавления охлаждение обычно прекращают и температуре дают повышаться до комнатной температуры (равной от примерно 15 до 25°C) в течение не более 4-5 ч, предпочтительно не более 2-3 ч.

Затем в соответствии со стадией b) образование соли сульфатирующую смесь добавляют к водному раствору неорганической соли щелочного металла, предпочтительно дикатионной, где Na является особенно предпочтительным катионом, в таком количестве, чтобы нейтрализовать содержащуюся хлорсульфоновую кислоту.

Образование соли предпочтительно проводят в водном растворе Na₂CO₃ или NaHCO₃, взятом в количестве, зависящем от количества использующейся хлорсульфоновой кислоты, по меньшей мере достаточном для нейтрализации полученного раствора. Обычно при использовании Na₂CO₃ достаточным является количество соли, равное примерно 1,5 молей на 1 моль ХСК. Если в соответствии с особенно предпочтительным вариантом неорганической солью щелочного металла является Na₂CO₃, ее конечная концентрация в растворе равна по меньшей мере 0,7 моль/л. При таких условиях после нейтрализации обеспечивается значение pH раствора, равное от 6,5 до 7,5.

В этом варианте осуществления соответствующая полученная монокатионная соль соединения T3S описывается формулой II, в которой M предпочтительно означает Na.

Добавление реакционной смеси в соответствии со стадией b) проводят в течение периода времени, который является переменным, обычно составляя от 1 ч до 3 ч, при поддержании температуры равной ниже 30°C.

Соединение T3S формулы II получают в растворе в виде монокатионной соли в соответствии со стадиями b) и c), как это описано выше.

Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, насколько известно заявителям, впервые описывает получение T3S из T3 или T2 с чистотой, составляющей по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, 98% или >99%, предназначенной для клинического применения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится нерадиоактивному иммунологическому анализу, по определению T3S, основанному на колориметрическом, флуоресцентном или хемолюминесцентном детектировании.

Предпочтительно, если иммунологическим анализом является иммуноферментный анализ (ELISA), более предпочтительно конкурентный ELISA, в котором увеличивающиеся количества T3S конкурируют за связывание со связанными с твердой фазой антителами к T3S (например, поликлональными, описанными в публикации Chopra et al., J. Clin. Endoc