Способы получения белков в растениях

Способы получения белков в растениях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам транзиентной экспрессии целевых белков, в особенности фармацевтически ценных белков, в растениях.

Крупномасштабное производство рекомбинантных белков является важной областью применения трансгенных растений. Хотя для производства рекомбинантных белков может успешно применяться множество растений, немногие системы обладают потенциалом для продукции существенных количеств рекомбинантного белка в течение короткого периода времени.

Транзиентная экспрессия генов в клетках растений была разработана в качестве быстрого способа получения небольших количеств данного белка и для тестирования генетических конструкций. Способы транзиентной продукции белка в клетке растения включают, например, доставку на частицах с помощью генной пушки молекулы нуклеиновой кислоты, которая включает ген, кодирующий нужный белок в экспрессируемой форме, агробактериальную доставку бинарного вектора, включающего экспрессируемый ген, электропорацию протопластов и полиэтиленгликоль-опосредованную доставку "голой" ДНК в растительные протопласты.

Бомбардировка частицами обычно достигает лишь нескольких клеток, при этом ДНК должна достичь ядра клетки для того, чтобы проходила транскрипция, и, таким образом, не слишком эффективна для транзиентной экспрессии.

Использование агробактерии, доставляемой путем инфильтрации (агроинфильтрации), может обеспечивать доставку чужеродных генов в значительно более высокое количество клеток. Оригинальная система агробактериальной инфильтрации для транзиентной экспрессии была описана Kapila et al., Plant Sci. 122:101-108 (1997) и была разработана для быстрой проверки функциональности белка, представляющегося полезным для устойчивости растительной ткани к болезням. Для такого применения белок не нужно очищать или анализировать, поскольку вся ткань растения может использоваться в биоанализе. Такую систему позже использовали для экспрессии фармацевтически важных белков (Vaquero et al., Mol. Biotechnol. 5:209-21 (1996)). Впрочем, продуктивность такой системы была относительно низкой.

В WO 99/48355 раскрыт способ генетической трансформации растений, включающий этапы (a) погружения ткани растения в среду, включающую инфекционный трансформирующий вектор, например, агробактериальный; (b) уменьшения давления на указанную ткань до -10 - -100 кПа по манометру; (c) поддержания указанного давления в течение 10-60 минут, и (d) повышения указанного давления до атмосферного давления или выше, где трансформирующий вектор обеспечивает селекцию для проведения отбора растительных клеток или тканей, в которых трансформирующий вектор интегрирован в геном указанных растительных тканей или клеток. Также описано, что растительный материал может быть подвергнут чередующимся циклам пониженного и избыточного давления, где давление, как указано, должно находиться в диапазоне 10-500 кПа (0,1-5 бар).

В EP 1662002 раскрыты способы агробактериальной генной трансдукции и трансформации, включающие получение растительного материала, заражение растительного материала агробактерией, несущей вектор, содержащий нужный трансген. Следующая часть способа заключается в воздействии на растительный материал повышенного давления в ходе процесса получения растительного материала, или до получения, но перед заражением агробактерией.

В WO 01/12828 описано устройство, которое включает вакуумную камеру, приспособление для создания вакуума и соединитель между приспособлением для создания вакуума и вакуумной камерой, и дополнительно приспособление для закрепления или удерживания растения в вакуумной камере.

Существует потребность в системах и способах, которые могут производить существенное количество рекомбинантного белка в коммерческом масштабе в течение короткого периода времени, такого как, например, субъединичные вакцины для предотвращения пандемических вспышек или появления болезней.

В настоящем изобретении предложены приспособления и способы, удовлетворяющие такую потребность. В частности, настоящее изобретение обеспечивает в одном варианте осуществления способ получения гетерологичного целевого пептида или белка, включающий:

(i) контакт целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или множества частей целых и интактных растений, с клетками Agrobacterium, суспендированными в жидкости, где клетки агробактерии включают экспрессируемую, в частности, экспрессируемую растениями, конструкцию, кодирующую гетерологичный целевой пептид или белок;

(ii) обработку указанного растения или части растения, или множества растений или частей растений и клеток Agrobacterium в одном или более циклах давления, в результате чего клетки Agrobacterium инфильтрируют в целое растение или часть растения, и

где экспрессируемая конструкция выбрана для обеспечения транзиентной экспрессии гетерологичного целевого пептида или белка, и по меньшей мере один из циклов давления включает повышение давления относительно атмосферного давления.

В некоторых вариантах осуществления изобретения растения обрабатывают в одном или более циклах давления, которые включают повышение давления относительно атмосферного давления.

В определенном варианте осуществления давление в каждом цикле поддерживают в течение периода продолжительностью 0,5-60 секунд.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ инфильтрации агробактерии в растение или часть растения, или множество растений или частей растений, включающий:

(i) контакт целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или множества частей целых и интактных растений, с клетками агробактерии, суспендированными в жидкости;

(ii) обработку указанного растения или части растения, или множества растений или частей растений и клеток Agrobacterium в одном или более циклах давления,

где экспрессируемая конструкция выбрана для обеспечения транзиентной экспрессии гетерологичного целевого пептида или белка, и по меньшей мере один из циклов давления включает увеличение давления относительно атмосферного давления.

В некоторых вариантах осуществления изобретения растения обрабатывают в одном или более циклах давления, которые включают увеличение давления относительно атмосферного давления.

В определенном варианте осуществления давление в каждом цикле поддерживают в течение периода продолжительность 0,5-60 секунд.

В одном варианте осуществления изобретения целое растение, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, или множество целых и интактных растений или частей целых и интактных растений, и клетки Agrobacterium обрабатывают в одном или более циклах давления в закрытой системе, в частности системе, включающей в себя камеру, предназначенную для помещения в нее целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, и приспособление для регулируемого повышения давления воздуха и/или текучей среды в камере.

В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все растение, включая его наземные и подземные части, погружено в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.

В другом варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что только все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, но при этом все растение, включая наземные части, а также подземные части растения, подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.

В еще одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуты воздействию давления в одном или более циклах давления, тогда как подземные части растения, в частности корень растения, расположены вне камеры таким образом, что они не погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и не подвергнуты воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.

В одном варианте осуществления изобретения производят обработку давлением, включающую один или более циклов давления, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, при этом указанное растение или часть растения находится в контакте с клетками Agrobacterium в суспензии бактериальных клеток.

В одном варианте осуществления изобретения суспензия клеток Agrobacterium включает OD600 по меньшей мере 1,0, в частности по меньшей мере 1,5, в частности по меньшей мере 2,0, в частности по меньшей мере 2,5, в частности по меньшей мере 3,0, в частности по меньшей мере 3,5, в частности по меньшей мере 4,0, в частности по меньшей мере 4,5.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения подвергают воздействию давления по меньшей мере 0,5 бар, в частности по меньшей мере 1,0 бар, в частности по меньшей мере 1,5 бар, в частности по меньшей мере 2,0 бар, в частности по меньшей мере 2,5 бар, в частности по меньшей мере 3,0 бар, в частности по меньшей мере 3,5 бар, в частности по меньшей мере 4,0 бар, в частности по меньшей мере 4,5 бар, в частности по меньшей мере 5,0 бар, в частности по меньшей мере 5,5 бар, в частности по меньшей мере 6,0 бар, в частности по меньшей мере 7,0 бар, в частности по меньшей мере 8,0 бар, в частности по меньшей мере 9,0 бар, в частности по меньшей мере 10,0 бар, в частности по меньшей мере 11,0 бар и в частности по меньшей мере 12,0 бар.

Оптимальное давление, которое обеспечивает максимальную инфильтрацию бактериальной суспензии в растение или часть растения, не вызывая повреждения растения, может изменяться в зависимости от вида растения и, в пределах данного вида растения, также от сорта, используемого в способе инфильтрации. Оптимальные условия режима давления могут быть легко определены специалистом, квалифицированным в данной области, с применением тестовой системы, описанной в Примерах ниже.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, включает по меньшей мере 2 цикла, в частности по меньшей мере 3 цикла, в частности по меньшей мере 4 цикла, в частности по меньшей мере 5 циклов, в частности по меньшей мере 6 циклов, в частности по меньшей мере 7 циклов, в частности по меньшей мере 8 циклов, в частности по меньшей мере 9 циклов, в частности по меньшей мере 10 циклов, в частности по меньшей мере 11 циклов, где по меньшей мере один из указанных циклов или, в определенном варианте осуществления, все указанные циклы включают давление по меньшей мере 0,5 бар, в частности по меньшей мере 1,0 бар, в частности по меньшей мере 1,5 бар, в частности по меньшей мере 2,0 бар, в частности по меньшей мере 2,5 бар, в частности по меньшей мере 3,0 бар, в частности по меньшей мере 3,5 бар, в частности по меньшей мере 4,0 бар, в частности по меньшей мере 4,5 бар, в частности по меньшей мере 5,0 бар, в частности по меньшей мере 5,5 бар, в частности по меньшей мере 6,0 бар, в течение по меньшей мере 0,1 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,2 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,3 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,4 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 1 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 1,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 2,0 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 2,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 3,0 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 3,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 5,0 секунды/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 2 цикла.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 4 цикла.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 5 циклов.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения или множества частей растения включает по меньшей мере 6 циклов.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 7 циклов.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 8 циклов.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 2,5 бар.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 3,5 бар.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 4,5 бар.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 6 бар.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 8 бар.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 12 бар.

В одном варианте осуществления изобретения давление приложено в течение от 0,5 секунды/цикл до 10 секунд/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения давление приложено в течение от 1 секунды/цикл до 5 секунд/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения давление приложено в течение от 0,5 секунды/цикл до 1 секунды/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 5 циклов при давлении по меньшей мере 3,0 бар, в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 8 циклов при давлении по меньшей мере 4,5 бар, в течение по меньшей мере 1 секунды/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 1 цикл при давлении по меньшей мере 8,0 бар, в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 2 цикла при давлении по меньшей мере 6,0 бар, в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл.

В одном варианте осуществления изобретения этап контакта целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, с клетками Agrobacterium включает: (i) погружение растения или его части в суспензию клеток Agrobacterium, где суспензия включает OD600 по меньшей мере 1,0, в частности по меньшей мере 1,5, в частности по меньшей мере 2,0, в частности по меньшей мере 2,5, в частности по меньшей мере 3,0, в частности по меньшей мере 3,5, в частности по меньшей мере 4,0, в частности по меньшей мере 4,5; (ii) контакт растения или его части с аэрозолем, полученным при использовании суспензии клеток Agrobacterium, включающей OD600 по меньшей мере 1,0, в частности по меньшей мере 1,5, в частности по меньшей мере 2,0, в частности по меньшей мере 2,5, в частности по меньшей мере 3,0, в частности по меньшей мере 3,5, в частности по меньшей мере 4,0, в частности по меньшей мере 4,5.

В одном варианте осуществления изобретения растение является видом Nicotiana, в частности видом Nicotiana tabacum, на стадии развития 8, 9 или 10.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена система для инфильтрации агробактерии в целое растение, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, или множество целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, и/или для получения гетерологичного пептида или белка, включающая камеру, предназначенную для помещения в нее целого растения, в частности целого и интактного растения или части растения, и приспособление, предназначенное для регулируемого повышения давления воздуха и/или текучей среды в камере.

В одном варианте осуществления изобретения система включает в себя компрессор и редуктор давления.

В одном варианте осуществления изобретения система включает в себя множество впускных отверстий, выпускных отверстий и трубопроводов для создания линии потока текучей среды между внутренним и внешним пространством камеры, где поток текучей среды регулируется.

В одном варианте осуществления изобретения камера включает, во внутреннем пространстве, множество форсунок, которые имеют размеры, позволяющие разбрызгивать или распылять жидкость.

В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все растение, включая его наземные и подземные части, погружено в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.

В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что только все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, но при этом все растение, включая наземные части, а также подземные части растения, подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.

В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуты воздействию давления в одном или более циклах давления, тогда как подземные части растения, в частности корень растения, расположены вне камеры таким образом, что они не погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и не подвергнуты воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.

В одном варианте осуществления изобретения камера включает одно или более отверстий, обеспечивающих проход наземных частей растений в ходе установки или извлечения, где по краям отверстий расположено эластичное уплотнение, в частности, эластичное пневматическое или гидравлическое уплотнение.

В одном варианте осуществления изобретение относится к применению системы согласно изобретению и как описано в настоящей заявке для инфильтрации бактерий Agrobacterium в целое растение, в частности целое и интактное растение или часть растения, и/или для получения гетерологичного пептида или белка.

Определения

Технические термины и выражения, используемые в рамках настоящей заявки, как правило, имеют такое значение, которое обычно относится к ним в релевантной области биологии растений.

Все следующие определения терминов относятся к полному содержанию настоящей заявки. Слово "включающий" не исключает другие элементы или этапы, а употребление единственного числа в оригинальном тексте описания не исключает множество. Один этап может выполнять функции нескольких признаков, указанных в формуле изобретения. Термины "по существу", "около", "приблизительно" и т.п. в сочетании с показателем или значением, в частности, также точно определяют показатель или точно определяют значение, соответственно. Термин "приблизительно" в контексте данного числового значения или диапазона относится к значению или диапазону, который составляет в пределах 20%, в пределах 10%, в пределах 5% или в пределах 2% от приведенного значения или диапазона.

"Растение", используемое в рамках настоящего изобретения, относится к интактному растению, по существу интактному растению, или к множеству интактных или по существу интактных растений; целому растению, по существу целому растению или множеству целых, или по существу целых растений, и к их потомству, на любой стадии их развития. В рамках настоящей заявки интактное растение, как понимают, относится к растению, включающему по существу интактную и замкнутую сосудистую систему, которая не демонстрирует выхода жидкости из сосудов вследствие повреждений.

"Часть растения", используемая в рамках настоящего изобретения, относится к любой части растения, включая черенки, органу растения, ткани растения или клетке растения, где такая часть растения может быть отдельной частью растения или частью целого и интактного растения.

"Часть целого и интактного растения", как подразумевается, относится к такой части растения, которая, даже при ее инфильтрации отдельно от остальной части растения, представляется функциональным компонентом растения с сосудистой системой, которая остается полностью интегрированной в интактную и замкнутую сосудистую систему интактного растения.

"Клетка растения", используемая в рамках настоящего изобретения, относится к структурной и физиологической единице растения, включая пыльцу, семяпочки и зиготы. Клетка растения может быть в форме протопласта без клеточной стенки, одной выделенной клетки, культивируемой клетки или клетки как части более высокоорганизованной единицы, такой как, помимо прочего, ткань растения, орган растения или целое растение, включая целое и интактное растение.

"Ткань растения", используемая в настоящем описании, означает множество клеток растения, которые организованы в структурные или функциональные единицы. Она включает любую ткань растения in planta или в культуре.

"Орган растения", используемый в настоящем описании, относится к отдельной или дифференцированной части растения, такой как, помимо прочего, корень, стебель, лист, цветок, часть цветка, бутон, зародыши, семена или плоды. Он включает любой орган растения in planta или в культуре.

"Растительный материал", используемый в рамках настоящего изобретения, относится к любой твердой, жидкой или газообразной композиции или их комбинации, включающей, помимо прочего, секреты или экстракты, получаемые из растения, его тканей и органов, in planta или в культуре, включая листья, стебли, корни, цветки или части цветков, плоды, пыльцу, семяпочки, зиготы, семена, черенки и любые другие части растения.

"Культура клеток растения", используемая в рамках настоящего изобретения, охватывает культуры клеток растений, такие как, помимо прочих, протопласты, клетки культуры клеток, клетки в культивируемых тканях растений, клетки в эксплантах и культуры пыльцы.

"Растение табака", используемое в рамках настоящего изобретения, относится к растению вида, относящегося к роду Nicotiana, включая, помимо прочих, Nicotiana tabacum (или N. tabacum). Некоторые варианты осуществления изобретения описаны в настоящей заявке с использованием термина "растение табака", без указания Nicotiana tabacum, при этом следует считать, что такие описания прямо включают Nicotiana tabacum.

Термин "полинуклеотид" используется в настоящем описании для обозначения полимера нуклеотидов, которые могут быть немодифицированной или модифицированной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) или рибонуклеиновой кислотой (РНК). Таким образом, полинуклеотид может без ограничения являться геномной ДНК, комплементарной ДНК (кДНК), мРНК или антисмысловой РНК. Кроме того, полинуклеотид может являться однонитевой или двунитевой ДНК, ДНК, которая является смесью однонитевых и двунитевых областей, гибридной молекулой, включающей ДНК и РНК, или гибридной молекулой со смесью однонитевых и двунитевых областей. Кроме того, полинуклеотид может состоять из тринитевых областей, включающих ДНК, РНК, или и то, и другое. Полинуклеотид может содержать одно или более модифицированных оснований, таких как фосфотиоаты, и может быть пептидонуклеиновой кислотой (ПНК). Как правило, полинуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть собраны из выделенных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или одиночных нуклеотидов, или комбинаций предыдущего.

Термин "нуклеотидная последовательность" относится к базовой последовательности полимера нуклеотидов, включая, помимо прочего, рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды.

Термин "последовательность гена", используемая в настоящем описании, относится к нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотиду, который кодирует полипептид или биологически активную РНК, и охватывает нуклеотидную последовательность неполной кодирующей последовательности, которая кодирует только фрагмент белка. Последовательность гена также может включать последовательности, обладающие регуляторной функцией в отношении экспрессии гена, которые расположены перед или после кодирующей последовательности, а также интронные последовательности гена.

Термин "промотор" относится к нуклеотидной последовательности на 5'-конце гена, которая направляет инициацию транскрипции гена. Как правило, промоторные последовательности необходимы, но не всегда достаточны для направления экспрессии гена, с которым они функционально связаны. При дизайне экспрессируемой генной конструкции, ген помещают в достаточной близости и в подходящей ориентации относительно промотора, при этом промоторная последовательность управляет экспрессией гена. Промотор располагается предпочтительно перед геном и на некотором расстоянии от сайта начала транскрипции, которое приблизительно равно расстоянию между промотором и геном, который он регулирует в своем естественном окружении. Как известно из уровня техники, некоторое изменение данного расстояния допускается без потери функции промотора. Используемый в настоящем описании термин "функционально связанный" означает, что промотор связан с кодирующей областью таким образом, что транскрипцию указанной кодирующей области контролирует и регулирует данный промотор. Способы функционального связывания промотора с кодирующей областью известны в уровне техники.

Используемая в настоящем описании "последовательность регуляции экспрессии" включает промотор и может включать, без ограничения: одну или более энхансерных последовательностей, последовательности терминации транскрипции, последовательности полиаденилирования, 3'- или 5'-нетранслируемые последовательности, интронные последовательности, сайты связывания рибосомы и другие последовательности, которые могут стабилизировать или иным образом регулировать экспрессию гена в клетке растения. Последовательности регуляции экспрессии могут быть эндогенными (то есть, присутствующими в растении-хозяине в естественных условиях) или экзогенными (не присутствующими в растении-хозяине в естественных условиях). Экзогенные последовательности регуляции экспрессии могут быть или могут не быть последовательностями растения, при условии, что они функциональны в растительной клетке при выбранных условиях.

"Гетерологичный ген" или "гетерологичная кодирующая последовательность" относятся к гену или кодирующей последовательности, которая является экзогенной, или не присутствующей в естественных условиях, по отношению к трансформируемому или обрабатываемому растению, и которая кодирует "гетерологичный полипептид" или его биологически активный фрагмент. Гетерологичные последовательности генов включают вирусные, прокариотические и эукариотические последовательности. Прокариотические кодирующие последовательности включают, помимо прочих, микробные последовательности, бактериальные последовательности или вирусные последовательности (например, для получения антигенов, которые можно вводить в качестве вакцин). Эукариотические кодирующие последовательности включают последовательности млекопитающих или человека, но также могут включать последовательности не млекопитающих, даже других растений, включая, без ограничения ими, лидерные последовательности или последовательности сигнала секреции, направляющие последовательности и т.п. В одном предпочтительном аспекте нуклеиновая кислота гетерологичного гена кодирует человеческий белок. Термин "гетерологичный ген" или "гетерологичная кодирующая последовательность" включает, без ограничения ими, природную, мутированную, вариант, химически синтезированную, геномную, кДНК или любую комбинацию таких последовательностей. Отсылка к "гену" охватывает полноразмерные гены или их фрагменты, кодирующие биологически активные белки.

Термин "гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок", используемый в настоящем описании, относится к пептиду, включая олиго- и полипептиды, или к белку, который экспрессирован с "гетерологичного гена" или "гетерологичной кодирующей последовательности", как определено выше. Таким образом, "гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок", полученный в растении, является экзогенным по отношению к растению или не присутствующим в растении в природе. "Гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок" может быть пептидом или белком млекопитающего или человека. "Гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок" может быть даже пептидом или белком растения, если он является вариантом или мутантной формой растительного пептида или белка, или пептидом или белком, обычно не присутствующим в продуцирующих видах, линии или сорте растения.

Используемый в настоящем описании "T-ДНК бордер" относится к фрагменту ДНК, включающему последовательность длиной приблизительно 25 нуклеотидов, которую способны узнавать продукты вирулентных генов штамма агробактерии, такого как штамм A. tumefaciens или A. rizogenes, или его модифицированную или мутированную форму, и который является достаточным для переноса последовательности ДНК, с которой он связан, в эукариотические клетки, предпочтительно клетки растения. Данное определение включает, без ограничения ими, все природные T-ДНК бордеры из Ti-плазмид дикого типа, а также их любое функциональное производное, и включает химически синтезированные T-ДНК бордеры. В одном аспекте кодирующая последовательность и последовательность регуляции экспрессии экспрессионной конструкции согласно изобретению расположены между двумя T-ДНК бордерами.

Термин "выбранный для обеспечения транзиентной экспрессии" относится к экспрессионной конструкции, которая была специально создана для транзиентной экспрессии гена в растениях, в частности, путем удаления элементов обычных бинарных векторов, необходимых для стабильной трансформации, таких как селективные гены трансформации (см., например, RP Hellens et al., Plant Methods 205, 1:13).

Используемый в настоящем описании термин "поверхностно-активное вещество" относится к поверхностному-активному агенту, который обычно содержит гидрофобную часть и гидрофильную часть (см., например, Bhairi, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biological Systems, Calbiochem-Novabiochem Corp. 1997).

Поверхностно-активные вещества могут быть разделены на анионные, неионные, цвиттерионные или катионные в зависимости от того, содержат ли они одну или более заряженных групп. Анионные поверхностно-активные вещества содержат отрицательно заряженную группу и имеют отрицательный суммарный заряд. Неионные поверхностно-активные вещества содержат незаряженные полярные группы и не имеют заряда. Такие поверхностно-активные вещества обычно являются продуктами реакции алкиленоксида с алкилфенолом или первичными или вторичными спиртами, или являются аминоксидами, фосфиноксидами или диалкилсульфоксидами.

Поверхностно-активные вещества, которые могут предпочтительно использоваться в системах инфильтрации растения, например, раскрыты в WO/2005/076766.

в частности примерные неионные поверхностно-активные вещества включают, помимо прочих: трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Triton X-100), полиоксиэтиленсорбитан монолаурат (Tween 20), полиоксиэтиленсорбитан монолаурат (Tween 21), полиоксиэтиленсорбитан монопальмитат (Tween 40), полиоксиэтиленсорбитан моностеарат (Tween 60), полиоксиэтиленсорбитан моноолеат (Tween 80), полиоксиэтиленсорбитан монотриолеат (Tween 85), (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40), триэтиленгликольмонолауриловый эфир (Brij 30) и сорбитан монолаурат (Span 20).

Цвиттерионное поверхностно-активное вещество содержит положительно заряженную группу и отрицательно заряженную группу, и не имеет суммарного заряда. Подходящие цвиттерионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения ими: бетаины, такие как карбоксибетаины, сульфобетаины (также известные как сультаины), амидобетаины и сульфоамидобетаины, которые могут включать C8-C18, предпочтительно C10-C18, алкилбетаины, сульфобетаины, амидобетаины и сульфоамидобетаины, например, бетаины лауриламидопропилбетаинового (LAB) типа, н-алкилдиметиламмонио-метанкарбоксилат (DAMC), н-алкилдиметиламмонио-этанкарбоксилат (DAEC) и н-алкилдиметиламмонио-пропанкарбоксилат (DAPC), н-алкилсультаины, н-алкилдиметиламмонио-алкилсульфонаты, N-алкилдиметиламмонио-этансульфонат (DAES), н-алкилдиметиламмонио-пропансульфонат (DAPS) и н-алкилдиметиламмонио-бутансульфонат (DAPS), гексадецилдиметиламмонио-пропансульфонат, н-алкиламидометан-диметиламмонио-метанкарбоксилат, н-алкиламидометан-диметиламмонио-этанкарбоксилат, лауриламидопропилбетаин (LAB), н-алкиламидометан-диметиламмонио-метансульфонат, н-алкиламидоэтан-диметиламмонио-этансульфонат и н-алкиламидопропан-диметиламмонио-пропансульфонат, 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS) и 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-2-гидрокси-1-пропансульфонат (CHAPSO), фосфолипиды (например, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилглицерины, фосфатидилинозиты, диацилфосфатидилхолины, диалкилфосфатидилхолины, лизофосфатидилхолины, лизофосфатидилэтаноламины, лизофосфатидилглицерины, лизофосфатидилинозиты, производные насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (например, сложные этилэфиры, сложные пропилэфиры, сложные холестерилэфиры, сложные эфиры кофермента A, сложные нитрофенилэфиры, сложные нафтилэфиры, моноглицериды, диглицериды и триглицериды, жирные спирты, ацетаты ж