Плазмида, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая ген, экспрессирующий щелочную сериновую протеиназу семейства s1 из streptomyces avermitilis vkm ac-1301, штамм e. coli m15 (prep4, pqe30-a2.1) - продуцент данной протеиназы

Плазмида, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая ген, экспрессирующий щелочную сериновую протеиназу семейства s1 из streptomyces avermitilis vkm ac-1301, штамм e. coli m15 (prep4, pqe30-a2.1) - продуцент данной протеиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Бактериальные протеиназы – это ферменты, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Микробные протеиназы составляют одну из важных групп промышленно и коммерчески получаемых ферментов, объемы продаж которых составляют примерно 2/3 всех продаж ферментов. Динамика роста количества патентов на получение протеиназ является наиболее высокой среди промышленно значимых ферментов.

В качестве источника генетического материала, кодирующего ранее неохарактеризованную протеиназу семейства S1 (далее по тексту белок A2.1), был выбран штамм Streptomyces avermitilis - VKM Ас-1301, относящийся к порядку Actinomycetales.

Для получения искомого гена была проведена амплификация с использованием ДНК-зависимой ДНК-полимеразы Q5 и праймерами:

А2.1_F_wSP_BamHI: TATATGGATCCGCCATCGAGCCGCCC

А2.1_R_HindIII: TATATAAGCTTTCAGAGACGCTGCCACA

При амплификации искомого гена последовательность, кодирующая сигнальный пептид, была исключена. Полученный ПЦР-продукт был обработан эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII и клонирован в экспрессионный вектор pQE30 (pREP4). Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки Е. coli M15 (pREP4), отдельные клоны трансформантов E. coli анализировались на наличие вставки с помощью ПЦР с ДНК–зависимой ДНК–полимеразой Q5, с праймерами к плазмиде. Клоны со вставкой пересевали на ночную культуру для последующего выделения плазмидной ДНК pQE30 (pREP4, pQE30-A2.1). Анализ клонируемой последовательности ДНК проводился методом секвенирования. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего рекомбинантный белок, представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO: 1, а карта полученной плазмидной ДНК представлена на фиг. 1.

Полученный экспрессионный штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) позволяет получить протеиназу А2.1 молекулярной массой 44,92 кДа, pH оптимум 8 (при гидролизе 2% денатурированного гемоглобина) и 10–11 (при гидролизе 2% казеина), температурный оптимум 60°С. Показано, что активность протеиназы А2.1 не ингибируется полностью в присутствии SDS и незначительно изменяется в присутствии Triton X–100, Twin 20. Полученные результаты являются предпосылкой для возможного применения данной протеиназы в составе моющих средств.

1. Плазмидная ДНК pQE30-A2.1, схема которой представлена на фиг.1, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1), кодирующую рекомбинантную щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301.

2. Штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) - продуцент щелочной сериновой протеиназы семейства S1, полученный путем трансформации штамма E. coli М15 (pRep4) плазмидой pQE30-A2.1 по п.1.