Иммунная модуляция

Иммунная модуляция

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится, главным образом, к области профилактических или терапевтических вакцин. В частности описание относится к вакцине для лечения аллергий на арахис путем подавления аллергической реакции на него.

Уровень техники

В принципе аллергические заболевания представляют собой расстройства иммунной системы, связанные с дисрегуляцией субпопуляций лимфоцитов T_H1 и T_H2 [de Vries et al., 1999, Parronchi et al., 1999, Singh et al., 1999]. Постулировано, что со снижением частоты инфекционных заболеваний вследствие вакцинации, применения антибиотиков и других методов здравоохранения утерян основной источник иммунной провокации T_H1 с последующим возрастанием смещения иммунных реакций T_H2 на окружающие аллергены [Holgate 1999, Shaheen et al., 1996].

Из различных аллергических заболеваний, которые поражают значительную часть населения, вызываемая арахисом анафилаксия является особенно тяжелой и представляет наиболее распространенного участника госпитализаций в отделения неотложной помощи для лечения анафилактических реакций.

Аллергии на арахис являются результатом аберрантной иммунной реакции, направленной против другого безвредного антигена окружающей среды. Аллергия на и анафилаксия к арахису концентрируются вокруг иммунной реакции типа 2, характеризующейся генерацией клеток T_H2 и В-клеток, секретирующих антитела IgE. Напротив, иммунная реакция типа 1 может характеризоваться антителами преимущественно IgG (изотип IgG2 у мышей), активацией клеток NK и фагоцитов и развитием цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Реакции как типа 1, так и 2 координируются хелперными Т-клетками, которые дифференцируют до нескольких функционально различных субпопуляций, включая лимфоциты T_H1 и T_H2. Такие субпопуляции характеризуются по их профилю секреции цитокинов [Mosmann et al., 1989], где клетки T_H1 продуцируют IFN-гамма, и клетки T_H2 типично секретируют IL-4, IL-5 и IL-13.

Поглощаемые перорально аллергены арахиса сначала сталкиваются с иммунной системой слизистой оболочки кишечника. Складчатые (М) клетки являются специализированными фолликул-ассоциированными клетками, которые выстилают эпителий желудочно-кишечного тракта и находятся в непосредственной близости к пейеровым бляшкам. Они ответственны за индукцию толеризации и/или защитные ассоциированные с кишечником иммунные реакции. Чувствительность к пищевым аллергенам имеет место, когда экзогенные пищевые антигены поглощаются М-клетками и затем представляются макрофагам и дендритным клеткам (DC) [DeLong et al., 2011]. После интернализации макрофагами и DC антигены претерпевают эндоцитоз, затем денатурируются и разрушаются до пептидов длиной примерно в 12-20 аминокислот. Затем небольшая фракция таких небольших пептидных фрагментов переносится внутриклеточно и представляется молекулам класса II ГКС на поверхности клеток для специфического взаимодействия с CD4⁺ Т-клетками. Затем такие активированные CD4⁺ Т-клетки увеличиваются в числе и высвобождают цитокины T_H2. Клетки T_H2, IL-4 и IL-5 промотируют дифференцировку В-клеток, которые включают аллергены, связанные с поверхностными иммуноглобулиновыми (Ig) рецепторами, до клеток, которые секретируют аллергенспецифические антитела IgE [Turcanu et al., 2010]. Такие продуцирующие IgE В-клетки увеличиваются в числе и становятся клетками плазмы, которые непрерывно секретируют аллергенспецифические антитела IgE. Воздействие окружающей среды на арахис приводит к связыванию аллергенов арахиса со специфическим слоем IgE на тучных клетках и базофилах. Затем перекрестное сшивание с Fc-рецептором дает сильный активирующий стимул, что приводит к дегрануляции базофилов и тучных клеток, которые быстро высвобождают различные предварительно образовавшиеся провоспалительные и вазоактивные соединения, такие как простагландины, лейкотриены, серинпротеазы, гистамин и цитокины, во внеклеточную жидкость с продуцированием воспалительной реакции [Sicherer et al., 2010], которые все достигают кульминации в клиническом проявлении острой аллергической реакции [Long 2002].

Локальные симптомы аллергии на арахис включают боль в животе, рвоту, судороги и диарею и являются обычными даже в случаях умеренной аллергии на арахис. Такая острая неопасная для жизни реакция вызывает временное возрастание интестинальной проницаемости, которая затем допускает системное распространение макромолекул, таких как цельные аллергены арахиса, обострение аллергической реакции на аллергены арахиса, что может вызвать опасные для жизни анафилактические реакции [Sanderson et al., 1993].

В отличие от традиционной иммунотерапии против аллергических реакций на пыльцу растений, пылевого клеща и пчелиный яд, подкожные десенсибилизирующие инъекции арахисовых экстрактов имеют неприемлемые опасные благоприятные действия [Oppenheimer et al., 1992]. Поэтому в настоящее время единственным доступным способом предотвращения дополнительных реакций является избегать арахис. Однако строгое избегание часто является нереальной стратегией для многих индивидуумов, в частности, в свете случайного воздействия арахиса, которое часто происходит через поглощение обработанных пищевых продуктов или продуктов, приготовленных в некоторой близости от продуктов, содержащих арахис, например, в ресторанах, школах, предприятиях питания и рабочих столовых. Поэтому сохраняется потребность в эффективной терапевтической стратегии для лечения и предупреждения аллергии на арахис.

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании, для лечения или для изготовления лекарственного средства для лечения аллергии на арахис.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции переносимости или подавления аллергической реакции у субъекта или пациента, причем способ включает введение субъекту или пациенту эффективного количества поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании, в течение времени и в условиях, достаточных для того, чтобы добиться подавления/переносимости.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу вакцинации субъекта для индукции переносимости аллергена арахиса, включающему введение поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании.

Изложенную выше сущность изобретения не следует рассматривать как исчерпывающую все воплощения настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает расположение антигена PHAV согласно воплощению настоящего изобретения, включающего метку деградации протеасомой и несколько аллергенов арахиса (фиг. 1А и 1В), и антигена PHAV согласно воплощению настоящего изобретения без метки деградации протеасомой (фиг. 1С).

Фиг. 2 показывает нуклеотидную последовательность экспрессирующей кассеты UBc.PHAV.

Фиг. 3 показывает нуклеотидную последовательность экспрессирующей кассеты конструкции PHAVag без последовательности убиквитина.

Фиг. 4 является схематическим представлением встраивания экспрессирующих кассет PHAV в ORF A39R вируса коровьей оспы, штамм Копенгаген, методом гомологичной рекомбинации.

Фиг. 5 перечисляет особенности кассеты гомологичной рекомбинации, схематически представленной на фиг. 4.

Фиг. 6 показывает нуклеотидную последовательность кассеты гомологичной рекомбинации UBc.PHAV.

Фиг. 7 показывает нуклеотидную последовательность кассеты гомологичной рекомбинации PHAV.

Фиг. 8 является схематическим представлением рТС11 (UBc.PHAV) и рТС12 (PHAV). На фиг. 8 показаны плазмиды.

Фиг. 9 является схематическим представлением пути протеасомальной деградации в клетке.

Фиг. 10 показывает уровни сывороточных антител IgE (фиг. 10А) и IgG2a (фиг. 10В), специфических к белкам арахиса, до и после вакцинации (17 дней после вакцинации) с пустым вектором (SCV000) или вектором UBc.PHAV (SCV201C); *=р<0,05.

Фиг. 11 показывает уровни IFN-гамма (IFN-g; цитокин T_H1; фиг. 11А), IL4 (цитокины T_H2; фиг. 11В) и IL5 (цитокины T_H2; фиг. 11С), секретированных культивированными лимфоцитами, полученными из селезенок мышей, вакцинированных SCV000 и SCV201C.

Подробное описание

Ссылка на любой уровень техники в данном описании не является и не должна приниматься как признание или какая-либо форма утверждения, что данный уровень техники образует часть общедоступных сведений в любой стране.

В данном описании, если контекст не требует иного, слова «включать», «включает» и «включающий» следует понимать как означающие включение определенной стадии или элемента или группы стадий или элементов, но без исключения любой другой стадии или элемента или группы стадий или элементов. Таким образом, применение термина «включающий» и подобных показывает, что перечисленные элементы являются требуемыми или обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не могут. «Состоящий из» подразумевает включение и ограничивается тем, что следует за выражением «состоящий из». Таким образом, выражение «состоящий из» показывает, что перечисленные элементы требуются или являются обязательными, и что никакие другие элементы не могут присутствовать. «Состоящий по существу из» подразумевает включение любых элементов, перечисленных после указанного выражения и ставит предел другим элементам, которые не влияют на или не вносят вклад в активность или действие, конкретизированные в раскрытии для перечисленных элементов. Таким образом, выражение «состоящий по существу из» показывает, что перечисленные элементы требуются или являются необходимыми, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не могут, в зависимости от того, влияют ли они или нет на активность или действие перечисленных элементов.

Используемые в данном описании формы единственного числа включают множественные аспекты, если контекст не требует четко иного. Таким образом, например, ссылка на «композицию» включает одну композицию, а также две или больше композиций; ссылка на «агента» включает одного агента, а также два или больше агентов; ссылка на «изобретение» включает один и несколько аспектов изобретения; и так далее.

Если не указано иное, все технические термины, используемые в данном описании, имеют значения, которые им обычно придаются специалистами в области техники, к которой относится данное изобретение. Любые материалы и способы, схожие с или эквивалентные способам, описанным в данном описании, могут быть использованы для осуществления на практике или проверки настоящего изобретения.

Настоящее изобретение делает возможным «вакцинный» подход к разработке терапевтического средства для лечения или предупреждения аллергии на арахис. В частности, описывается средство, способное предоставить терапию в контексте основных аллергенов арахиса, например, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех и т.д. наиболее распространенных или опасных аллергенов арахиса.

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии авторов изобретения, что ДНК-вакцина, включающая нуклеотидную конструкцию, оперативно кодирующую слитый белок, причем слитый белок включает аллерген арахиса (такой, как ara h 1), соединенный с меткой деградации протеасомой (такой, как убиквитин), способна индуцировать иммунную реакцию у субъекта, которая смещена к фенотипу T_H1, что ведет таким образом к секреции специфических IgG-антител к аллергенам арахиса как противодействующих специфическим IgE-антителам к аллергенам арахиса, которые в противном случае облегчают аллергическую реакцию при воздействии аллергена арахиса.

Соответственно в одном аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, который экспрессирует в клетке субъекта слитый белок, включающий (i) аллерген аллергена арахиса, выбранный из перечня, состоящего из, (а) по меньшей мере, двух аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, или (b), по меньшей мере, трех аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, который экспрессирует в клетке субъекта слитый белок, включающий (i) аллерген аллергена арахиса, выбранный из перечня, состоящего из, (а) по меньшей мере, двух аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, или (b), по меньшей мере, трех аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.

Аллергены арахиса

Аллергены арахиса хорошо известны специалистам в данной области техники и включают любой пептид вида Arachis hypogaea, который может воздействовать на субъекта, например, при контакте, вдыхании, заглатывании, инъекции или подобным образом. В одном воплощении, по меньшей мере, два аллергена арахиса выбирают из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7. В другом воплощении, по меньшей мере, два аллергена арахиса выбирают из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11.

Слитый белок может включать любые два или больше аллергенов арахиса ara h 1 - ara h 11. Например, слитый белок может включать следующие аллергены арахиса:

(i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11;

(ii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 и ara h 10;

(iii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 и ara h 9;

(iv) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 и ara h 8;

(iv)) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7;

(vi) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 и ara h 6;

(vii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4 и ara h 5;

(viii) ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 4;

(ix) ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6;

(x) ara h 1, ara h 2 и ara h 3;

(xi) ara h 1 и ara h 2;

(xii) ara h 1 и ara h3;

(xiii) ara h 1 и ara h 4;

(xiv) ara h 1 и ara h 5;

(xv) ara h 1 и ara h 6;

(xvi) ara h 1 и ara h 7;

(xvii) ara h 1 и ara h 8;

(xviii) ara h 1 и ara h 9;

(xix) ara h 1 и ara h 10;

(xx) ara h 1 и ara h 11;

(xxi) ara h 2 и ara h 3;

(xxii) ara h 2 и ara h 4; и т.д.

За счет использования метки деградации протеасомой (например, убиквитина) как компонента слитого белка синтезированный слитый белок является мишенью для протеасомальной деградации, приводящей к генерации небольших пептидных фрагментов, которые вступают в эндоплазматический ретикулум (ER), где они образуют комплекс с белками класса I ГКС и затем переносятся к поверхности клетки для представления Т-лимфоцитам. Как следствие, имеет место усиленное представление фрагментов белков классу I ГКС. Таким образом, специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что когда нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий два или больше аллергенов арахиса, два или больше аллергенов арахиса могут оказаться в слитом белке в любом определенном порядке, когда экспрессированный слитый белок будет подвергаться протеасомальной деградации.

Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что выбор аллергена или аллергенов арахиса вероятно зависит от определенного терапевтического и/или профилактического применения. Например, когда вакцина должна использоваться для индукции переносимости у субъекта, который имеет аллергию на аллерген арахиса Ara h 1, тогда желательно, чтобы слитый белок включал ara h 1; когда вакцина должна использоваться для индукции переносимости у субъекта, который имеет аллергию на аллерген арахиса ara h2, тогда желательно, чтобы слитый белок включал ara h2; когда вакцина должна использоваться для индукции переносимости у субъекта, который имеет аллергию на аллергены арахиса ara h 1 и ara h 2, тогда желательно, чтобы слитый белок включал ara h 1 и ara h2; и т.д.

В одном воплощении аллерген арахиса выбирают из группы, включающей клон Р41В ara h 1 (GenBank, инвентарный номер L34402, или Swiss-Prot: Р43238.1); клон Р17 ara h 1 (GenBank, инвентарный номер L38853); кДНК ara h 2 (GenBank, инвентарный номер L7797, или UniProtKB/TrEMBL: Q8GV20); кДНК ara h 3 (GenBank, инвентарный номер AF093541 или АСН91862); кДНК ara h 4 (GenBank, инвентарный номер AF086821); кДНК ara h 5 (GenBank, инвентарный номер AF059616); кДНК ara h 6 (GenBank, инвентарный номер AF092846, или UniProtKB/TrEMBL: Q647G9), кДНК ara h 7 (GenBank, инвентарный номер AF091737), ara h 8 (GenBank, инвентарный номер AY328088, EF436550), ara h 9 (GenBank, инвентарный номер EU159429, EU161278), ara h 10 (AY722694, AY722695) и ara h 11 (DQ097716).

В одном воплощении слитый белок включает, по меньшей мере, четыре аллергена арахиса, предпочтительно, по меньшей мере, четыре из наиболее распространенных аллергенов, влияющих на субъектов с аллергией на арахис. В одном воплощении слитый белок включает аллергены арахиса ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6.

Используемый в данном описании термин «аллерген арахиса», включающий конкретные примеры, такие как ara h 1, ara h 2 и т.д., следует понимать как включающий также его гомолог или вариант. Термин «гомолог», используемый в данном описании с обращением к гомологам нуклеотидных последовательностей или полипептидов, описанных в данном описании (включая, например, любую из SEQ ID NO: 1-12), следует понимать как включающий, например, ортологи, паралоги, мутанты и варианты нуклеиновых кислот или полипептидов, описанных в данном описании. В некоторых воплощениях гомолог включает нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая включает, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 75% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 80% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 85% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 96% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 98% идентичность последовательностей или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательностей с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью, описанной в данном описании.

Так, в одном воплощении ara h 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, и ara h 6 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею,

В другом воплощении ara h 1 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 2 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 3 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, и ara h 6 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею.

Термин «идентичность последовательностей», используемый в данном описании, относится к степени, в которой последовательности идентичны на основе нуклеотид-нуклеотид или аминокислота-аминокислота в окне сравнения. Так, «процент идентичности последовательностей» вычисляют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определяя число позиций, в которых идентичное нуклеотидное основание (например, А, Т, С, G, I) или идентичный аминокислотный остаток (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) имеет место в обеих последовательностях, что дает число соответственных позиций, путем деления числа соответственных позиций на общее число позиций в окне сравнения (т.е. размер окна), и умножая результат на 100, что дает процент идентичности последовательностей. Для целей настоящего изобретения «идентичность последовательностей» следует понимать как обозначение «процента соответствий», вычисленного соответствующим способом. Например, анализ идентичности последовательностей можно выполнить с использованием компьютерной программы DNASIS (версия 2.5 для окон; доступна от Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, США) с использованием стандартных значений по умолчанию, как описано в справочном руководстве, прилагаемом к программному обеспечению. Идентичность последовательностей заключенной в аллергене арахиса аминокислотной или нуклеотидной последовательности в некоторых воплощениях возрастает до, по меньшей мере, 75% или по меньшей мере, 80% или по меньшей мере, 85% или, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 98% идентичности последовательностей.

В некоторых воплощениях термин «аллерген» может также включать фрагмент любого одного из вышеуказанных пептидов. Как таковая, нуклеиновая кислота может включать нуклеотид, который кодирует фрагмент одного из вышеуказанных аллергенов арахиса.

В некоторых воплощениях аллерген арахиса включает модифицированный аллерген арахиса, посредством чего повтор последовательностей из 8 или больше оснований удаляется из последовательности нативного аллергена арахиса. В некоторых воплощениях слитый белок включает 2 или больше аллергенов арахиса. В некоторых воплощениях слитый белок включает два или больше аллергенов арахиса, по меньшей мере, один из которых выбран из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11. В некоторых воплощениях слитый белок включает ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 или их гомологи.

В некоторых воплощениях для облегчения экспрессии слитого белка нуклеиновую кислоту лишают стоп-кодонов между двумя последовательностями, кодирующими аллергены арахиса.

Метка деградации протеасомой

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что использование метки деградации протеасомой (такой как убиквитин) как компонента слитого белка дает возможность преодолеть явное токсичное и/или ингибирующее действие, которое пептидная конструкция аллергена арахиса без убиквитина оказывает на рекомбинантную экспрессию. Использование метки деградации протеасомой делает экспрессированный слитый белок мишенью для протеасомальной деградации. В результате нацеленной убиквитином протеасомальной деградации небольшие пептидные фрагменты слитого белка (например, пептиды длиной примерно в 8-12 аминокислот) входят в эндоплазматический ретикулум (ER), где они образуют комплекс с белками класса I ГКС и затем переносятся к поверхности клетки для представления Т-лимфоцитам. В результате имеет место усиленное представление фрагментов слитого белка с классом I ГКС, приводящее к более сильной иммунной реакции T_H1 на аллергены арахиса. Таким образом, метка деградации протеасомой неожиданно предохраняет интактную пептидную конструкцию аллергена арахиса от ингибирования рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине и сдвигает иммунную реакцию к фенотипу T_H1.

Метка деградации протеасомой может представлять собой любую метку, которая делает слитый белок мишенью для протеасомальной деградации. В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой может включать молекулу убиквитина или связывающий домен убиквитина. В одном воплощении метка деградации протеасомой представляет собой мономер убиквитина, пояснительным примером которого является убиквитин С. В некоторых воплощениях мономер убиквитина включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность нуклеотидной последовательности к ней.

В некоторых воплощениях C-конец мономера убиквитина представляет собой аланиновый остаток.

В другом воплощении мономер убиквитина кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность нуклеотидной последовательности с нею.

Последовательность, кодирующая метку деградации протеасомой, может размещаться до или после последовательности, кодирующей, по меньшей мере, один аллерген арахиса (т.е. метка деградации белка может являться C-концом или N-концом слитого белка).

Молекулы убиквитина могут быть получены из любого подходящего вида. Для вакцины, предназначенной для лечения людей, молекула убиквитина может быть молекулой убиквитина человека или молекулой убиквитина животного другого вида, который может иметь кодон, оптимизированный для экспрессии в клетках человека. В некоторых воплощениях молекула убиквитина может представлять собой мономер убиквитина С. Сразу после экспрессии молекула убиквитина может притягиваться и связываться с другими молекулами убиквитина с образованием полиубиквитиновой цепи на слитом белке. Молекула убиквитина и/или полиубиквитиновая цепь могут направлять слитый белок для протеасомальной деградации.

В некоторых воплощениях нуклеотидная конструкция операбельно кодирует несколько молекул убиквитина или одну или несколько последовательностей, кодирующих укороченную или модифицированную молекулу убиквитина. Если кодированы несколько молекул убиквитина, один или несколько стартовых и стоп-кодонов могут быть удалены для создания возможности трансляции полного слитого белка.

В некоторых воплощениях укороченная молекула убиквитина может включать исключение лизина, ближайшего к C-концу нативной молекулы убиквитина. В некоторых воплощениях модифицированная молекула убиквитина может иметь один или несколько удаленных из последовательности или замененных (например, аргинином) лизиновых остатков нативной последовательности. В некоторых воплощениях молекула убиквитина может иметь только один лизин.

В некоторых воплощениях C-концевая молекула убиквитина может быть модифицирована. Например, C-концевой глицин нативной молекулы может быть заменен аланином. Замена глицина на аланин или другую аминокислоту может предотвратить отщепление метки деградации протеасомой от аллергена. Замена глицина на аланин также может создать возможность для образования ковалентной связи между меткой деградации протеасомой и аллергеном. Ковалентная связь может быть устойчива к расщеплению протеазой.

В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой может включать связывающий домен убиквитина. Метка деградации протеасомой может являться членом семейства UbL (убиквитинподобных)-UBA (убиквитинассоциированных) доменсодержащих белков. В этом отношении экспрессированный слитый белок может способствовать связыванию молекул убиквитина со связывающим доменом, что ведет к протеасомальной деградации слитого белка.

Слитый белок

В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, который оптимизирован для экспрессии у субъекта. Например, последовательность слитого белка аллергена арахиса может быть оптимизирована для экспрессии в клетке человека. Подобным образом, в некоторых воплощениях метка деградации протеасомой оптимизирована для экспрессии у субъекта и/или может представлять собой метку деградации протеасомой, клонированную из того же вида, что и нужный субъект. В некоторых воплощениях оптимизация кодона включает замену кодона другим кодоном, который кодирует ту же аминокислоту, но более эффективно или точно транслируется в видах-мишенях (например, у людей).

В некоторых воплощениях оптимизация последовательности для экспрессии у субъекта также включает удаление повторных последовательностей. Например, в некоторых воплощениях из последовательности аллергена арахиса удаляют повторные последовательности из 8 или более оснований. Это может быть важно, в частности, если последовательность сконструирована синтетически обратной трансляцией. Синтетические последовательности обычно утрачивают преимущество оптимизации кодона через эволюцию. Поэтому разрыв случайно встречающихся дестабилизирующих повторных последовательностей в последовательности путем замены нуклеотидных оснований без изменения аминокислотной последовательности может улучшить экспрессию последовательности.

В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой кодирована нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 1 или ее гомологу. В некоторых воплощениях аллергены арахиса слитого белка кодированы нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 9, или гомологу одной из вышеуказанных последовательностей.

В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой включает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях аллергены арахиса слитого белка включает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и/или SEQ ID NO: 10.

Так как конформационные эпитопы не требуются для представления КГС-1 и в некоторых отношениях нежелательны для того, чтобы предотвратить связывание аллергенспецифических IgE-антител, не требуется, чтобы аллергены, экспрессированные как часть слитого белка, находились в своей нативной структурной форме. Это может создать возможность для использования слитых белков, включающих несколько аллергенов арахиса, и дает маневренность при создании слитого белка.

Соответственно в некоторых воплощениях нуклеотидная конструкция операбельно кодирует 2 или больше аллергенов арахиса. Например, слитый белок может кодировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше аллергенов арахиса. Для некоторых нуклеиновых кислот, по меньшей мере, один из аллергенов можно выбрать из следующих аллергенов арахиса или их гомологов: ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 или ara h 11. В примере для пояснения нуклеотидная конструкция операбельно кодирует ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 или их гомологи. Например, нуклеотидная конструкция может включать нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 11, или может кодировать белок с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 12.

Каждый аллерген может быть слит со своей собственной меткой деградации протеасомой и может быть операбельно соединен со своим собственным промотором (например, могут экспрессироваться несколько слитых белков). С другой стороны, последовательности для метки деградации протеасомой и аллергенов могут располагаться, допуская экспрессию слитого белка, включающего метку деградации протеасомой и несколько аллергенов. Такой последний подход может предотвратить дифференциальную экспрессию различных аллергенов и/или предотвратить внутримолекулярную рекомбинацию, если используют несколько экспрессирующих кассет с идентичными промоторами.

Для того чтобы создать возможность трансляции слитого белка с 2 или больше аллергенами, нуклеиновую кислоту можно лишить стоп-кодонов между двумя последовательностями, кодирующими аллергены арахиса. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность может быть лишена стоп-кодонов между любыми последовательностями, кодирующими аллергены арахиса, и/или может быть лишена стоп-кодонов между последовательностью, кодирующей метку деградации протеасомой, и последовательностью, кодирующей аллерген.

Для того чтобы провести трансляцию, последовательность, кодирующая первую часть слитого белка, может включать стартовый кодон на 5'-конце последовательности. Стартовые кодоны могут отсутствовать в последовательности, кодирующей остальную часть слитого белка. В этом отношении аллергены, которые не слиты с меткой деградации протеасомой, могут быть сведены к минимуму или предотвращены. Это может минимизировать или предотвратить секрецию интактных аллергенов арахиса из клетки или представление на поверхность клетки, что в ином случае может стимулировать иммунную реакцию T_H2 против аллергена.

В одном воплощении слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею.

В другом воплощении слитый белок кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 11 ил