Высокопроизводительная и высокомультиплексная визуализация при помощи программируемых зондов на основе нуклеиновых кислот

Высокопроизводительная и высокомультиплексная визуализация при помощи программируемых зондов на основе нуклеиновых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 61/951461, поданной 11 марта 2014 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в целом к области выявления и количественного определения анализируемых веществ (например, мишеней).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Флуоресцентная микроскопия представляет собой мощный инструмент для исследования молекул, например, в биологической системе. Однако, количество разных молекул, которые можно различимо и одновременно визуализировать (т.е. мультиплексная способность), ограничено спектральным перекрытием флуорофоров.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает, помимо прочего, способы и композиции для выявления, визуализации и/или количественного определения представляющих интерес мишеней (например, биологических молекул). Некоторые способы, предусмотренные в данном документе, включают (1) приведение образца, подлежащего анализу (например, образца, предположительно содержащего одну или несколько представляющих интерес мишеней), в контакт с компонентами, которые специфически связываются с мишенями (при этом каждый компонент является партнером по связыванию для данной мишени), где каждый компонент конъюгирован с нуклеиновой кислотой (называемой в данном документе докинг-цепью), и где партнеры по связыванию с разной специфичностью конъюгированы с разными докинг-цепями, (2) необязательно удаление несвязанных партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными (например, флуоресцентно меченными) нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, комплементарной одной докинг-цепи и, следовательно, специфичной для нее (такие меченые нуклеиновые кислоты называются в данном документе мечеными визуализирующими цепями), (4) необязательно удаление несвязанных визуализирующих цепей, (5) визуализацию образца целиком или частично для выявления расположения и количества связанных визуализирующих цепей, (6) тушение сигнала от меченой визуализирующей цепи в образце (например, путем обесцвечивания, в том числе фотообесцвечивания) и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным визуализирующим цепям, применяемым в способе.

Визуализирующие цепи могут быть мечеными идентично, в том числе идентично флуоресцентно меченными. В других вариантах осуществления визуализирующие цепи с идентичными последовательностями могут быть идентично мечеными. Первый подход может быть более удобным, поскольку при его применении требуются одна длина волны возбуждения и детектор.

Таким образом, можно выявлять, визуализировать и/или количественно определять две или более мишени в образце, вне зависимости от их расположения в образце, в том числе вне зависимости от того, расположены ли они в образце настолько близко друг к другу, чтобы они были неразличимы, если сигнал от двух или более мишеней наблюдали одновременно. Таким образом, расстояние между двумя или более мишенями может быть меньше разрешающей способности по дальности системы визуализации, применяемой для выявления мишеней, и тем не менее с применением способов, предусмотренных в данном документе, будет возможным отличить две или более мишени друг от друга, что способствует тем самым более точному и надежному выявлению и количественному определению таких мишеней. В некоторых случаях разрешающая способность по дальности может составлять, например, приблизительно 50 нм.

Следует понимать, что перед проведением способа "содержание мишени" в образце может быть известным, или предполагаемым, или неизвестным и не предполагаемым. Партнеры по связыванию, которые приводят в контакт с образцом, могут связываться или не связываться с образцом в зависимости от того, присутствует или отсутствует мишень (например, если мишень присутствует, партнер по связыванию может связываться с образцом). Визуализирующие цепи, которые приводят в контакт с образцом, могут связываться или не связываться с образцом в зависимости от того, присутствует или отсутствует мишень (например, если мишень присутствует, визуализирующая цепь может связываться с соответствующей докинг-цепью, связанной с мишенью). "Связывание с образцом" означает, что партнер по связыванию или визуализирующая цепь связываются со своими соответствующими мишенью или докинг-цепью.

Партнеры по связыванию по своей природе могут представлять собой белки, такие как антитела или фрагменты антител. В случае партнера по связыванию, который представляет собой антитело или фрагмент антитела, докинг-цепи могут быть конъюгированы с их константными областями. Партнер по связыванию может представлять собой антитело, такое как моноклональное антитело, или он может представлять собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, такой как антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления партнер по связыванию представляет собой рецептор.

Партнер по связыванию может быть соединен с докинг-цепью посредством промежуточного линкера. В некоторых вариантах осуществления промежуточный линкер включает в себя биотин и/или стрептавидин.

Визуализирующие цепи могут быть флуоресцентно меченными (т.е. конъюгированными с флуорофором). Флуорофоры, конъюгированные с визуализирующими цепями с разными нуклеотидными последовательностями, могут быть идентичными друг другу, или они могут иметь такой профиль испускания, который перекрывается или не перекрывается с таковым у других флуорофоров. Флуоресцентно меченная визуализирующая цепь может содержать по меньшей мере один флуорофор.

В некоторых случаях флуоресцентно меченные визуализирующие нуклеиновые кислоты, такие как визуализирующие цепи, могут содержать 1, 2, 3 или более флуорофоров.

Образец может представлять собой клетку, популяцию клеток или клеточный лизат из клетки или популяции клеток. Мишень может представлять собой белок.

Поэтому следует понимать, что настоящее изобретение предусматривает способ выявления анализируемых веществ путем связывания анализируемых веществ с их соответствующими партнерами по связыванию и последовательного определения наличия таких партнеров по связыванию путем многократного связывания, выявления и тушения (например, путем обесцвечивания, такого как фотообесцвечивание) визуализирующих цепей, которые необязательно идентично мечены (например, идентично флуоресцентно мечены).

Соответственно, настоящее раскрытие предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепи, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих цепей, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих цепей, (6) тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим цепям.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

В некоторых вариантах осуществления специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие цепи мечены идентично. В некоторых вариантах осуществления каждая из меченых визуализирующих цепей содержит отличную от других метку. В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие цепи представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие цепи.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько мишеней представляют собой белки. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

В некоторых вариантах осуществления образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

В некоторых вариантах осуществления тушение сигнала на стадии (6) предусматривает фотообесцвечивание.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает композицию, содержащую образец, связанный с несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, при этом каждый распознающий мишень компонент связан с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту для докинга, стабильно связанную с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой, такой как визуализирующая цепь.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает композицию, содержащую образец, связанный с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, при этом каждый партнер по связыванию связан с докинг-цепью, и по меньшей мере одну докинг-цепь, стабильно связанную с меченой визуализирующей цепью.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга путем изменения температуры и/или условий буфера и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам. При таких условиях визуализирующая нуклеиновая кислота отделяется от нуклеиновой кислоты для докинга самопроизвольно.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга путем изменения температуры и/или условий буфера и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам. При таких условиях визуализирующая нуклеиновая кислота отделяется от нуклеиновой кислоты для докинга самопроизвольно.

В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем снижения концентрации соли, добавления денатуранта или повышения температуры. В некоторых вариантах осуществления соль представляет собой соль Mg++. В некоторых вариантах осуществления денатурант представляет собой формамид, мочевину или DMSO.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (6) меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты не удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем замещения цепи в присутствии конкурирующей нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (6) меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем химического, фотохимического или ферментативного расщепления, модификации или разрушения меченых визуализирующих нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах осуществления, в которых меченая визуализирующая нуклеиновая кислота связана с соответствующей ей нуклеиновой кислотой для докинга, визуализирующая нуклеиновая кислота или нуклеиновая кислота для докинга не имеют одноцепочечного участка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для докинга не имеет последовательность зацепления. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота не имеет последовательность зацепления.

В некоторых вариантах осуществления меченая визуализирующая нуклеиновая кислота не обладает свойством самогашения.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Различные варианты осуществления в равной степени применимы к вышеизложенным способам. Эти варианты осуществления являются следующими:

В некоторых вариантах осуществления на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию. В некоторых вариантах осуществления специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой природный или сконструированный лиганд, малую молекулу, аптамер, пептид или олигонуклеотид.

В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты мечены идентично. В некоторых вариантах осуществления каждая из меченых визуализирующих нуклеиновых кислот содержит отличную от других метку. В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты являются флуоресцентно меченными визуализирующими нуклеиновыми кислотами.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько мишеней представляют собой белки. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

В некоторых вариантах осуществления образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

В некоторых вариантах осуществления несвязанная нуклеиновая кислота для докинга является частично двухцепочечной. В некоторых вариантах осуществления несвязанная визуализирующая нуклеиновая кислота является частично двухцепочечной.

В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками, которая обладает свойством самогашения. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой полудуплекс. В некоторых вариантах осуществления полудуплекс обладает свойством самогашения. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота связана с несколькими испускающими сигнал компонентами посредством дендримерной структуры или полимерной структуры. Визуализирующая нуклеиновая кислота может быть линейной или разветвленной.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для докинга имеет вторичную структуру со шпильками.

Эти и другие варианты осуществления будут описаны в данном документе более подробно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ. 1 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления высокопроизводительного и по своей сути масштабируемого мультиплексного подхода к визуализации, предусмотренного в настоящем раскрытии. Клетки визуализируют после гибридизации с зондом и затем подвергают фотообесцвечиванию перед последующим циклом визуализации.

ФИГ. 2 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления высокопроизводительного и по своей сути масштабируемого мультиплексного подхода к визуализации, основанного на замене буфера с применением растворов с характеристиками легкой денатурации, такими как сниженная концентрация соли, повышенная концентрация формамида или более высокая температура.

ФИГ. 3 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления инактивации визуализирующей цепи путем удаления визуализирующей цепи с применением способов, предусмотренных в настоящем раскрытии.

ФИГ. 4 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления инактивации визуализирующей цепи путем инактивации флуорофора без удаления части визуализирующей цепи, представляющей собой нуклеиновую кислоту.

ФИГ. 5 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи по типу молекулярного маяка, обладающей свойством самогашения.

ФИГ. 6 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи в виде полудуплекса, обладающей свойством самогашения.

ФИГ. 7 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления докинг-цепи, не являющейся одноцепочечной.

ФИГ. 8 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи, которая привлекает несколько копий испускающих сигнал компонентов к докинг-цепи.

ФИГ. 9 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи, не являющейся одноцепочечной.

ФИГ. 10 представляет собой график, на котором показаны прогнозируемые константы диссоциации 10 различных олигонуклеотидов с соответствующими обратно комплементарными цепями при 3 различных наборах условий. Последовательность a1: 5'-CATCTAAAGCC-3' (SEQ ID NO: 1); последовательность a2: 5'-GAATTTCCTCG-3' (SEQ ID NO: 2); последовательность a3: 5'-GTTTAATTGCG-3' (SEQ ID NO: 3); последовательность a4: 5'-ACAATTCTTCG-3' (SEQ ID NO: 4); последовательность a5: 5'-TTTCTTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 5); последовательность a6: 5'-GCATTGTTACT-3' (SEQ ID NO: 6); последовательность a7: 5'-ATATACAAGCG-3' (SEQ ID NO: 7); последовательность a8: 5'-GCTGTCTATTG-3' (SEQ ID NO: 8); последовательность a9: 5'-TCTTTATGCTG-3' (SEQ ID NO: 9); последовательность a10: 5'-CAATCTCATCC-3' (SEQ ID NO: 10).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает, помимо прочего, композиции и способы для мультиплексной флуоресцентной визуализации, например, в клеточной среде, с применением визуализирующих зондов на основе нуклеиновых кислот (например, визуализирующих зондов на основе ДНК). Способы, предусмотренные в данном документе, частично основаны на программируемости докинг-цепей и визуализирующих цепей нуклеиновых кислот. Это означает, например, что докинг-цепи и визуализирующие цепи могут быть сконструированы таким образом, что они связываются друг с другом при определенных условиях в течение определенного периода времени. Такая программируемость предоставляет возможность стабильного связывания визуализирующих цепей с докинг-цепями, как предусмотрено в данном документе. В целом, способы, предусмотренные в данном документе, направлены на идентификацию одной или нескольких мишеней (например, биологических молекул, таких как белок или нуклеиновая кислота) в конкретном образце (например, биологическом образце). В некоторых случаях неизвестно, присутствуют ли одна или несколько мишеней в образце. Таким образом, способы по настоящему раскрытию можно применять для определения наличия или отсутствия одной или нескольких мишеней в образце, который предположительно содержит мишень(мишени). В любом из аспектов и вариантов осуществления, предусмотренных в данном документе, образец может содержать или может предположительно содержать одну или несколько мишеней.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способы для проведения высокопроизводительной и высокомультиплексной визуализации и выявления анализируемых веществ/мишеней с использованием программируемых зондов на основе нуклеиновых кислот (например, ДНК). Эти способы основаны на подходе по типу последовательной визуализации с использованием ортогональных визуализирующих цепей, которые могут стабильно присоединяться к комплементарной докинг-цепи, иммобилизованной на партнерах по связыванию, таких как антитела (ФИГ. 1). После гибридизации и визуализации с помощью визуализирующей цепи проводят стадию тушения (такую, как стадия фотообесцвечивания) с целью устранения и/или уменьшения флуоресценции от гибридизированных (связанных) визуализирующих цепей.

В другом варианте осуществления с целью устранения сигнала в способах используют более слабое связывание между докинг-цепями и визуализирующими цепями. Например, условия гибридизации можно изменять таким образом, что точка плавления дуплекса, который образуется между докинг-цепями или визуализирующими цепями, немного превышает комнатную температуру (например, 25°C) или температуру визуализации. Стадию мечения (т.е. стадию, на которой визуализирующие цепи связываются с соответствующими им докинг-цепями) и стадию визуализации проводят, как описано выше. В качестве примера, после визуализации первой мишени, образец подвергают денатурирующим условиям. Денатурирующие условия можно обеспечить на стадии замены буфера путем применения раствора, например, с более низкой концентрацией соли, присутствующим или имеющим повышенную концентрацию денатурантом, таким как формамид, или повышенной температурой (ФИГ. 2). Образец можно в альтернативном случае или дополнительно подвергать воздействию повышенной температуры. Вышеупомянутые повышения или понижения приведены по отношению к условиям, существующим на стадии мечения (т.е. когда визуализирующая цепь связывается с докинг-цепью). В случае замены буфера образец можно промывать, замену буфера можно повторять, образец можно промывать снова, и затем к образцу можно добавлять следующую визуализирующую цепь.

Для мультиплексирования в отношении одного и того же образца последовательно применяются различные резервуары ортогональных визуализирующих цепей после каждой стадии, например, фотообесцвечивания или других способов тушения сигнала или инактивации или удаления визуализирующей цепи, с целью потенциальной визуализации неограниченного числа мишеней. В отличие от традиционных подходов к визуализации, где мультиплексирование ограничено спектральным перекрытием цветовых каналов, способы, предусмотренные в данном документе, ограничены только количеством возможных ортогональных нуклеотидных последовательностей (докинг-цепей или, в альтернативном случае, визуализирующих цепей). Поскольку можно легко сконструировать большее количество ортогональных нуклеотидных последовательностей, этот подход имеет возможность по своей сути масштабируемого мультиплексирования благодаря применению всего одного флуорофора. Этот способ можно легко интегрировать со стандартными устройствами для микроскопии (например, конфокальными или эпифлуоресцентными микроскопами), что обеспечивает высокопроизводительный анализ образца.

Способы имеют применимость, например, для высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как скрининговый анализ лекарственных средств. Этот подход к визуализации обеспечивает анализ больших популяций клеток (~ 1000-10000) или образцов тканей в ультрамультиплексном формате при визуализации с применением стандартного конфокального или эпифлуоресцентного микроскопа. Скрининг большого количества мишеней, таких как белки, в одном и том же образце высокопроизводительным способом обеспечит информацию о новых лекарственных средствах или модификаторах и при этом обеспечит информацию о гетерогенности клеток. Крупномасштабный скрининг образцов тканей с возможностями высокопроизводительной и ультрамультиплексной визуализации будет применимым в патологическом анализе, например, в больнице или другой организации, предоставляющей такого рода услуги.

Способы, предусмотренные в данном документе, можно также применять для идентификации абсолютного количества одной мишени (например, такой как конкретный белок) или количества одной мишени по отношению к одной или нескольким другим мишеням.

Дополнительно, способы, предусмотренные в данном документе, можно применять для идентификации расположения мишени в образце или по отношению к другим мишеням в образце.

Следовательно, настоящее раскрытие предусматривает способ, включающий (1) приведение образца в контакт одновременно с множеством распознающих мишень компонентов, меченных последовательностями, (2) введение визуализирующих нуклеиновых кислот, таких как визуализирующие цепи, распознающих благодаря комплементарности последовательностей подмножество нуклеиновых кислот для докинга, таких как докинг-цепи распознающих мишень компонентов, меченных последовательностями, (3) удаление или инактивацию визуализирующих нуклеиновых кислот или тушение сигнала от визуализирующих нуклеиновых кислот и (4) повторение стадии (2) и необязательно стадии (3) по меньшей мере один раз с целью визуализации и выявления одной или нескольких дополнительных нуклеиновых кислот для докинга.

Способ может необязательно включать мечение множества распознающих мишень компонентов нуклеиновыми кислотами для докинга, такими как докинг-цепи, с образованием распознающих мишень компонентов, меченных последовательностями.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепи, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих цепей, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих цепей, (6) тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим цепям.

Стадии (3)-(6) можно повторять один или несколько раз. Например, стадии (3)-(6) можно повторять 1-10 или более раз. В некоторых вариантах осуществления стадии (3)-(6) повторяют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Стадии (3)-(6) можно повторять один или несколько раз. Например, стадии (3)-(6) можно повторять 1-10 или более раз. В некоторых вариантах осуществления стадии (3)-(6) повторяют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый из распознающих мишень компонентов соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим н