Стабилизированные капсиды fmdv

Стабилизированные капсиды fmdv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области ветеринарии и вирусологии. В частности, изобретение относится к мутантному белку VP2 вируса ящура (FMDV), к капсиду вируса ящура, содержащему мутантный белок вируса ящура VP2, к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, к клетке-хозяину, живому рекомбинантному микроорганизму-носителю и к вакцине против ящура. Кроме того, изобретение относится к нескольким способам получения и применения указанных вариантов осуществления.

Ящур (FMD) представляет собой острое, системное и очень заразное заболевание, поражающее парнокопытных млекопитающих; отряд Artiodactyla. Помимо многих диких видов основными характерными мишенями данного вируса являются сельскохозяйственные животные, такие как крупный рогатый скот, буйволы, свиньи, овцы и козы. Типичные симптомы включают в себя волдыри на языке и копытах; отсюда и название болезни. Данное заболевание не только вызывает особый дискомфорт и вторичные инфекции, но также лихорадку и иногда смерть. Кроме того, заболевание вызывает значительный экономический ущерб, поскольку пораженные животные перестают двигаться и есть. Ящур является заболеванием, подлежащим регистрации, и многие страны не разрешают импорт животных из FMD-положительных регионов; это обеспечивается международной системой экспортной сертификации (Paton et. al. 2009, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. Vol. 364, p. 2657).

FMD вызывается вирусом ящура (FMDV), который представляет собой вирус семейства пикорнавирусов, и является типичным видом рода Aphtovirus. Его вирион содержит одноцепочечный положительный смысловой РНК-геном размером примерно 8 кб, который содержится в не имеющем оболочке капсиде. Капсид имеет диаметр около 30 нм в диаметре и характеризуется икосаэдральной симметрией. Капсид состоит из правильно расположенных 60 копий каждого из четырех структурных вирусных белков: VP1, VP2, VP3 и VP4. Они организованы в протомерные единицы с коэффициентом седиментации 5S, содержащие по одному из VP1-4; пять из указанных протомеров образуют пентамер с коэффициентом седиментации 12S, а полный капсид состоит из 12 пентамеров. Он может представлять собой не способный к инфицированию пустой капсид с коэффициентом седиментации примерно 70S, или капсид вириона с коэффициентом седиментации примерно 146S, содержащий вирусную РНК, который может вызывать инфекцию (Fry et al., 2005, Curr. Top. Microbiol. Imm., vol. 288, p. 71).

Икосаэдральная структура капсида FMDV имеет три природных вида осей симметрии: пятерная ось, где протомеры собираются в пентамер, а также две оси, где встречаются пентамерные субъединицы: двойная ось симметрии, где взаимодействуют соседние белки VP2-VP2, и тройная ось симметрии, где взаимодействуют белки VP2-VP3; см. фигуру 1.

В случае природной репликации вируса вирусные белки FMDV экспрессируются в виде длинного полипротеинового предшественника, называемого Р1, который содержит VP4-2-3-1. Поэтому VP FMDV иногда обозначают в соответствии с порядком их расположения в Р1, а именно: VP1 обозначают 1D, VP2 обозначают 1B, VP3 обозначают 1С, а VP4 обозначают 1A. Посттрансляционное расщепление P1 на более мелкие части осуществляется неструктурными белками 2 A-C и 3 A-D, кодируемыми FMDV. (Chapter: Picornaviridae, in: Fields Virology, 4th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN-10: 0781718325).

Традиционные меры, предпринимаемые для уменьшения встречаемости или тяжести FMD, а также распространения FMDV, включают в себя вакцинацию, селективную выбраковку и ограничение перемещения. Однако в некоторых странах вакцинация разрешена только в условиях вспышки инфекции, так как система сертификации экспорта определяет, является ли животное серологически положительным по FMDV. Следовательно, разрабатываются маркерные вакцины, которые позволяют различить вакцинацию и инфекцию дикого типа.

Традиционные вакцины против FMD представляют собой адъювант-содержащие эмульсии инактивированных препаратов целых вирусов, которые индуцируют защитные уровни антител, нейтрализующих вирус. Однако из-за высокой инфекционности частиц FMDV манипуляции с вирусом и получение таких вакцин следует проводить в условиях биологической безопасности высокого уровня при эффективном контроле качества, особенно по инактивации вирусов.

FMDV является высоко вариабельным агентом и в настоящее время имеет семь основных серотипов: О, А, С, SAT (южноафриканские территории)-1, SAT-2, SAT-3 и Asia 1. В указанных серогруппах существует много антигенных вариантов, подтипов и квази-видов. Соответствующую информацию можно найти в Carrillo et al. (2005, J. of Gen.Virol., vol. 79, p. 6487), где приведены результаты выравнивания транслируемых геномных последовательностей более 100 изолятов FMDV всех серотипов.

Поскольку существует небольшая перекрестная защита против основных серотипов, как правило, вакцина FMD содержит отдельный компонент каждого серотипа, против которого нужно выработать защиту, и, как правило, представляет собой комбинированную вакцину.

Что касается распространенности, серотипы А и О присутствуют практически во всем мире, тогда как вспышки серотипа С не наблюдаются с 2004 года. Три серотипа SAT встречаются в ряде регионов Африки и Ближнего Востока, а серотип Азия 1 встречается в Азии и на Ближнем Востоке.

Семь серотипов также различаются по биофизическим свойствам, в основном, по стабильности. Они относятся к FMDV и, помимо высокой контагиозности, также являются очень неустойчивыми и легко инактивируются при нагревании, в кислых условиях, при гидродинамическом усилии и т.д. Тем не менее, все вакцины против FMD необходимо транспортировать и хранить в соответствии со строгими условиями холодовой цепи логистики. Это является особым недостатком в (суб-)тропических и развивающихся регионах мира, где FMD является эндемическим заболеванием. В данном отношении вирионы серотипа А и Азия 1 относительно более стабильны, чем вирионы других серотипов, и имеют реальный срок годности 6 месяцев или более. Однако вакцины серотипа O имеют очень ограниченный биологический период полужизни, составляющий, как правило, только несколько месяцев. Еще хуже ситуация для трех серотипов SAT, которые, как известно, обладают низкой стабильностью, позволяющей получать вакцины с низкой защитной способностью, даже при многократном введении.

Следовательно, остается потребность в разработке и совершенствовании безопасных, стабильных и эффективных вакцин против FMD.

В течение многих лет также исследуются вакцины против FMD, полученные путем экспрессии ДНК с использованием рекомбинантных технологий. Например, вакцины могут быть получены путем экспрессии субъединиц или эпитопов FMDV в разных системах, включающих в себя как бесклеточные системы, так и прокариотические или эукариотические клетки, в том числе растительные клетки.

Другим вариантом является применение пустых капсид FMDV; они более безопасны для производства, чем целые вирусы, и являются эффективными иммуногенами (Rweyemamu, et al., 1979, Arch. Virol., vol. 59, p. 69). Такие пустые капсиды можно эффективно получать в рекомбинантных системах экспрессии, таких как E.coli (Lewis et al., 1991 , J. of Virol., vol. 65, p. 6572; Lee et. al., 2009, J. Biomed. Sci. vol. 16, p. 69), или вирусные системы экспрессии, например, с использованием рекомбинантного вируса коровьей оспы (Abrams et al., 1995, J. of Gen. Virol., vol. 76, p. 3089); рекомбинантного бакуловируса, или с использованием клеток насекомых (Cao et al., 2009, Vet. Microbiol., vol. 137, p. 1; Charleston et al., WO 2011/048353; Subramanian et al., 2012, Antivir. Res., Vol. 96, p. 288) или шелковичных червей (Li et al., 2012, PLoS One. 2012;7(8): e43849); или с использованием живого рекомбинантного вектора, такого как рекомбинантный аденовирус (Lu et al., 2008, vaccine, vol. 26, Suppl. 6, p. G48).

К сожалению, пустые капсиды часто оказываются даже менее стабильными, чем капсиды вирионов; по-видимому, сама вирусная геномная РНК оказывает некоторое стабилизирующее влияние на структуру капсида FMDV.

В нескольких группах исследуют характеристики стабильности капсида FMDV, который быстро диссоциирует на пентамеры при температуре выше физиологической и значении рН ниже физиологического. Для применения в качестве вакцин это является нежелательным свойством, так как пентамеры 12S являются гораздо менее иммуногенными, чем интактные капсиды. См.: Doel et al. (1981, Arch. of Virol., vol. 70, p. 21) и Hegde et al. (2009, in: Editorial, Vaccine, vol. 27, p. 2199). Twomey et al. (1995, Virology, vol. 206, p. 69) исследуют природные варианты серотипа A FMDV, которые являются менее чувствительными к кислым условиям в результате аминокислотных замен в положениях 131 и 133 белка VP2.

Для улучшения термо- и/или кислотоустойчивости капсида FMDV исследователи из некоторых групп вводят мутации в один или несколько вирусных структурных белков и затем используют такие мутанты VP для получения капсидов вирионов FMDV с последующим тестированием их по биофизическим свойствам; такие методы называют капсидной инженерией.

Как правило, результаты варьируют; в некоторой степени чувствительность к кислоте можно уменьшить путем введения мутаций по остаткам гистидина в положениях 140-145 VP3: Martin-Acebes et al., (2011, J. of Virol., vol. 85, p. 2733), Liu et al. (CN 101270155), и Ellard et al. (J. of Gen. Virol., vol. 80, p. 1911). Martin-Acebes et al. (выше) вводят замену: VP1 N17D (это означает, что аспарагин в положении 17 VP1 заменяют на аспарагиновую кислоту).

Подобным образом, термостабильность капсида FMDV можно несколько улучшить путем введения аминокислотных мутаций в некоторые участки белков VP2 и VP3: Mateo et al. (2008, J. of Virol., vol. 82, p. 12232), King et al. (WO 2002/000251) и Fowler et al. (WO 2011/032348). Обзор: Mateu (2011, Prot. Eng., Des. & Sel., vol. 24, p. 53). Mateo et al. (выше) вводят замену VP2 A65H и сочетание замен: VP3 D69E/VP2 T188A. Fowler et al. (выше) вводят замены: в VP2: L78S, E79A, K80R, T88A, E131К или A193S; и в VP3: H85P или E196A.

Способ King et al. (выше) отличается от данной работы тем, что он включает в себя попытку стабилизировать капсид FMDV путем введения скорее ковалентных, чем нековалентных связей. Путем замены аминокислоты в VP2 на цистеин они вводят неприродный дисульфидный мостик между двумя смежными белками VP2 с двойной осью симметрии. Однако данный способ можно использовать для стабилизации только пустых капсидов, но не капсидов вирионов. Это связано с тем, что полученные с помощью данного способа капсиды являются постоянно фиксированными и после инфицирования клетки-хозяина капсиды вирионов больше не могут образовывать покрытие.

King et al. (выше) осуществляют аминокислотную замену в положении 93 белка VP2 (которое указано в WO 2002/000251 как аминокислотное положение 179 в последовательности с идентификационным номером 38). Данное аминокислотное положение находится в участке белка VP2, который в результате укладки нативной структуры образует α-спираль: αА-спираль белка VP2 охватывает (в случае серотипа O) аминокислоты 88-98 VP2 (см. Acharya et al., 1989, Nature, vol. 337, p. 709). Данный участок также исследуют в связи с механизмом удаления покрытия у другого пикорнавируса, человеческого энтеровируса (Wang et al., 2012, Nature Str. & Mol. Biol., vol. 19, p. 424), однако этот механизм отличается от аналогичного механизма, присутствующего в FMDV. Wang et al. не осуществляют или не предполагают введение каких-либо мутаций в данном участке.

Несмотря на все усилия, предпринимаемые на предшествующем уровне техники, в настоящее время отсутствует общеприменимая и иммунологически эффективная вакцина против FMD, полученная с использованием рекомбинантных капсид FMDV.

Целью настоящего изобретения является получение альтернативной вакцины против FMD, применимой ко всем серотипам FMDV, с использованием либо пустых капсидов FMDV, либо капсидов вирионов FMDV. Другой целью является получение усовершенствованной вакцины против FMD.

При попытке применить технологию, описанную King et al. (выше), авторы настоящего изобретения были разочарованы, поскольку им не удалось применить данный подход для получения пустых капсидов FMDV, относящегося к серотипу, отличному от серотипа A. Например, цистеиновые замены осуществляли в αА-спиральном участке белка VP2 FMDV серотипа О либо в положении 93, или в других положениях спирального участка. Были предприняты попытки получить пустые капсиды, однако капсиды либо совсем не образовывались, либо сильно агрегировали, что делало их непригодными для применения в качестве вакцин.

Неожиданно было обнаружено, что указанную цель можно достичь и, следовательно, недостатки предшествующего уровня техники можно преодолеть путем получения мутантного белка VP2 FMDV, который содержит определенную аминокислотную замену в αА-спиральном участке белка VP2, без необходимости введения ковалентной связи.

Такой мутантный белок VP2 FMDV можно ввести в капсиды FMDV, которые в результате приобретают значительно повышенную биофизическую стабильность. Полученные стабилизированные капсиды FMDV можно использовать для получения усовершенствованных вакцин против FMD на основе капсидов вирионов или пустых капсидов.

С учетом того, что точный механизм действия не известен, авторы настоящего изобретения без связи с какой-либо теорией или моделью, выдвинули предположение, что благоприятный эффект такой замены в указанном участке обусловлен гидрофобной и/или электростатической стабилизацией капсида FMDV на молекулярном уровне. Предположительно это происходит в результате усиления межмолекулярных взаимодействий между двумя смежными белками VP2 в области двойной оси симметрии капсида FMDV. Это укрепляет взаимодействие между соседними пентамерами, приводя к значительному повышению стабильности капсида FMDV в целом.

Повышенная стабильность капсидов FMDV приводит к ряду преимуществ по сравнению с капсидами FMDV, содержащими немодифицированный исходный белок VP2: капсиды, содержащие мутантный белок VP2, можно получать в больших количествах, их можно транспортировать с менее строгими требованиями к холодовой цепи логистики, и они вызывают улучшенный иммунный ответ.

Указанные результаты являются неожиданными, поскольку мутации, обеспечивающие нековалентное связывание, в данном конкретном участке белка VP2 не были описаны ранее, или не было оснований предполагать, что такие мутации могут привести к значительным улучшениям стабильности капсидов FMDV и полученным из них вакцин против FMD.

Следовательно, в одном аспекте изобретение предлагает мутантный белок VP2 вируса ящура (FMDV), который содержит замену, по меньшей мере, одной аминокислоты, расположенной в αА-спиральном участке белка VP2, на аминокислоту, выбранную из группы, включающей в себя: Q, N, V, I, L, M, F, Y, W и H.

"Вирус ящура" в соответствии с настоящим изобретением представляет собой вирус, имеющий характеристические признаки ряда таксономических видов FMDV. Он также включает в себя FMDV, который относится к любому из подразделов указанных видов, такому как подвид, квазивид, штамм, изолят, генотип, серотип, серовар, вариант, подтип и т.п. Для специалиста в данной области очевидно, что, хотя микроорганизм в настоящее время может называться FMDV, это является таксономической классификацией, которая может подвергаться изменениям по мере появления новых фактов, приводящих к переклассификации с образованием новой или другой таксономической группы. Однако, поскольку такое изменение не затрагивает микроорганизм или его характеристические признаки, а только его название или классификацию, считается, что такие переклассифицированные организмы продолжают входить в объем настоящего изобретения.

Термин "белок VP2" в соответствии с настоящим изобретением относится к белку вируса FMDV номер 2, который известен как структурный белок капсида FMDV. Он содержит примерно 218 аминокислот и имеет молекулярную массу примерно 24 кДа. Специалистам в данной области хорошо известно, что изменчивость, присущая FMDV, обуславливает наличие природных вариаций размера и аминокислотной последовательности белка VP2. Аминокислотную последовательность белка VP2, полученную из большого числа изолятов FMDV, можно найти в общедоступных базах данных, таких как GenBank™, или Swiss Prot™.

Мутантный белок VP2 в соответствии с настоящим изобретением может иметь биологическое или синтетическое происхождение, и может быть получен путем выделения, очистки, сборки и т.д. Предпочтительно мутантный белок VP2 получают с использованием рекомбинантной технологии, путем экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей мутантный белок VP2.

Белок VP2 для применения в настоящем изобретении можно получить из FMDV, например, путем получения из FMDV нуклеиновой кислоты, кодирующей белок VP2, или его нуклеотидную последовательность. Такой FMDV, в свою очередь, можно получить (при соблюдении соответствующих мер биологической безопасности) из разных источников, включающих в себя исходный полевой изолят или депозитарные учреждения, такие как ATCC или CNCM, или его можно получить из разных лабораторий и институтов, таких, как Пирбрайтский институт (Pirbright, Woking, UK), который является всемирной справочной лабораторией FAO и ВОЗ по стандартизации FMD (WRL FMD).

FMDV, подходящий для применения в настоящем изобретении, включает в себя один или несколько FMDV из серотипов A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 или Asia1; предпочтительно FMDV, подходящий для применения в настоящем изобретении, включает в себя один или несколько FMDV, циркулирующих в поле в определенное время.

Более предпочтительными являются один или несколько FMDV, выбранные из серотипов O, SAT-1, SAT-2 или SAT-3, поскольку проблемы, касающиеся низкой стабильности данных серотипов, вызывают наибольшее внимание в данной области.

Альтернативно предпочтительными являются FMDV, рекомендованные WRL FMD как высоко приоритетные кандидаты для получения вакцин; например в их последнем докладе указаны: O Manisa, O PanAsia-2, O BFS, O Campos, A 24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Iran-05, A 22 Iraq, SAT-2 Saudi Arabia и SAT-2 Eritrea, или эквивалент любого из указанных вирусов (ежеквартальный доклад WRL FMD, октябрь-декабрь 2012).

Термин "мутант" в соответствии с настоящим изобретением относится к объекту, который ранее не был широко известен или доступен, либо в природе, либо в лаборатории. Таким образом, мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения отличается от белка VP2, описанного на уровне техники, предшествующем настоящему изобретению. В частности, на сегодняшний день не известно ни одной аминокислотной последовательности белка VP2 FMDV, квалифицируемой как мутантный белок VP2 настоящего изобретения. Тем не менее, мутантный белок VP2 настоящего изобретения можно получить из природной среды, однако предпочтительно его получают искусственным путем.

Следовательно, в одном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения содержит замену, по меньшей мере, одной аминокислоты, расположенной в αА-спиральном участке белка VP2, на аминокислоту, выбранную из группы, включающей в себя: Q, N, V, I, L, M, F, Y, W и H, при условии, что указанная замена не приводит к получению белка VP2 с аминокислотной последовательностью, известной на предшествующем уровне техники.

Таким образом, в другом варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения содержит замену, по меньшей мере, одной аминокислоты, расположенной в αА-спиральном участке белка VP2, на аминокислоту, выбранную из группы, включающей в себя: Q, N, V, I, L, M, F, Y, W и H, при условии, что указанная замена не приводит к получению белка VP2, содержащего одну или несколько (или все) из нижеследующих аминокислотных последовательностей:

- 90V в FMDV серотипа O (например, как в штамме 01BFS и/или 01M_87), и/или не 90V в серотипе C (например, CS8c1), и/или не 90V в серотипе Asia 1 (например, ASIA1_Bar2003), и/или не 90V в серотипе А (например, A22_Iraq_95), и/или не 90I в серотипе SAT-1 (например, SAT1_bot), и/или не 90I в серотипе SAT-2 (например, SAT2_ZIM7_83), и/или не 90I в серотипа SAT-3 (например, SAT3_KNP10_90);

- 91Y;

- 93H в FMDV серотипа А (например, как в штамме A22_Iraq_95), и/или не 93Q в серотипе SAT-1 (например, SAT1_bot);

- 94L в FMDV серотипа O (например, как в штамме O1BFS и/или O1M_87), и/или не 94L в серотипе C (например, CS8c1), и/или не 94L в серотипе Asia 1 (например, ASIA1_Bar2003), и/или не 94L в серотипе А (например, A22_Iraq_95), и/или не 94L в серотипа SAT-1 (например, SAT1_bot), и/или не 94L в серотипе SAT-2 (например, SAT2_ZIM7_83), и/или не 94М в серотипа SAT-3 (например, SAT3_KNP10_90);

- 95V в FMDV серотипа C (например, как в штамме CS8c1), и/или не 95M в серотипе Asia 1 (например, как в штамме ASIA1_Bar2003), и/или не 95V в серотипе А (например, A22_Iraq_95), и/или не 95V в серотипе SAT-1 (например, SAT1_bot), и/или не 95L в серотипе SAT-3 (например, SAT3_KNP10_90);

- 98Y в FMDV серотипа O (например, как в штамме O1BFS и/или O1M_87), и/или не 98Y в серотипе C (например, CS8c1), и/или не 98Y в серотипе Asia 1 (например, ASIA1_Bar2003), и/или не 98F в серотипе А (например, A22_Iraq_95), и/или не 98H в серотипе SAT-1 (например, SAT1_bot), и/или не 98Y в серотипе SAT-2 (например, SAT2_ZIM7_83), и/или не 98H в серотипе SAT-3 (например, SAT3_KNP10_90).

Способы получения такого мутантного белка VP2 настоящего изобретения могут быть основаны на технологии случайных или направленных мутаций; например, мутанты можно идентифицировать и выбрать из случайных полевых изолятов. Кроме того, чтобы индуцировать мутации, можно проводить пассажи вирус-клетка, например, пассажи FMDV в присутствии мутагенного вещества с последующим отбором FMDV, содержащего мутантный белок VP2 настоящего изобретения, способствующий образованию более стабильного капсида. Стабильность можно тестировать с использованием селективного уровня кислотности, температуры, гидродинамического усилия, воздействия химических веществ и т.п., сравнивая пересеваемые и непересеваемые изоляты в отношении интактности и инфекционности, например, как описано и подтверждено примерами в данном описании.

В предпочтительном варианте осуществления мутантный белок VP2 настоящего изобретения анализируют, используя методы структурного анализа in silico, и получают с помощью направленных методов молекулярной биологии, включающих в себя, например, клонирование, трансфекцию, рекомбинацию, селекцию и амплификацию. Такие методы подробно описаны в известных справочниках, таких как: Current Protocols в Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989); Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986); и: Sambrook & Russell, 2001, in: 'Molecular cloning: a laboratory manual', 3rd edn. New York, USA: Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Методы введения мутаций в белок VP2 также подробно описаны и проиллюстрированы примерами в данном описании. Таким образом, специалист в данной области техники может легко применить, адаптировать, модифицировать и усовершенствовать указанные методы, используя только рутинные методы и материалы.

В данном описании термин "содержит" (а также его вариации, такие как "содержать", "содержал" и "содержащий") относится ко всем элементам, в любом возможном сочетании подходящих для настоящего изобретения, которые, упоминаются или включены в раздел, абзац, пункт и т.д. текста, в котором этот термин используется, даже если такие элементы или сочетания явно не цитируются; но не исключает какой-либо из таких элементов или их сочетаний. Следовательно, любой такой раздел, абзац, пункт и т.д. текста также может относиться к одному или нескольким вариантам осуществления, в которых термин "содержит" (или его варианты) заменяют такими терминами, как "состоит из", "состоящий из" или "по существу состоит из".

"Замена" представляет собой замещение одного элемента другим; в настоящем изобретении данный термин относится к мутации, включающей в себя замену одной аминокислоты или нуклеиновой кислоты на другую, в зависимости от того, является ли подвергающийся мутации объект молекулой белка, ДНК или РНК. Заменяемый элемент представляет собой элемент, который встречается в немодифицированной, исходной, или относящейся к дикому типу версии белка или нуклеиновой кислоты. В результате замена в соответствии с настоящим изобретением приводит к образованию αА-спирали, которая отличается от исходной или относящейся к дикому типу αА-спирали, т.е. замена приводит к образованию модифицированной αА-спирали, которая отличается от αА-спирали версии дикого типа. Любая αА-спираль дикого типа имеет проблемы со стабильностью, описанные выше. Настоящее изобретение предлагает αА-спираль, отсутствующую в природе и усовершенствованную в отношении ее способности стабилизировать пустые капсиды.

"αА-спираль" представляет собой участок белка VP2 FMDV, который в нативной конформации капсида может укладываться в альфа-спиральную структуру.

Используемая в настоящем изобретении в качестве стандарта "SEQ ID NO: 1" представляет собой аминокислотную последовательность белка VP2, полученную из белка P1 FMDV серотипа О, штамм 1BFS, опубликованную в GenBank под номером доступа: AAT01758; белок VP2 включает в себя аминокислоты 287-504 полноразмерного полипротеина P1. В SEQ ID NO: 1 αА-спираль содержит в длину 12 аминокислот, и занимает участок от аминокислотного положения 87 до положения 98, включая его.

Вследствие природной вариабельности FMDV положение указанной αА-спирали в белке VP2 других изолятов или серотипов FMDV может варьировать, например, αА-спираль может быть смещена на одну или несколько аминокислот в N-концевом или С-концевом направлении. Тем не менее, αА-спираль можно легко идентифицировать в аминокислотной последовательности VP2, с помощью, например, стандартной компьютерной программы для молекулярно-биологического анализа. Следовательно, в данном изобретении аминокислотные положения αА-спирали VP2, указанные в отношении SEQ ID NO: 1, могут отличаться от положений, занимаемых αА-спиралью в других изолятах FMDV.

Таким образом, в настоящем изобретении αА-спираль белка VP2 занимает участок длиной примерно 12 аминокислот, который находится между аминокислотными положениями 87 и 98 VP2, где номера положений указаны в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

Предпочтительно αА-спираль белка VP2 занимает участок от аминокислотного положения 87 до положения 98, включая его, где номера положений указаны в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

Только для иллюстрации уровня вариабельности последовательности среди разных изолятов FMDV, известных на момент даты подачи, на фигуре 2 приведены результаты множественного выравнивания аминокислотных последовательностей αА-спирали белка VP2 ряда типичных изолятов FMDV. Carrillo et al. (выше) описывают, что единственными высоко консервативными аминокислотами в участке αА-спирали белка VP2 являются остатки глицина в положениях 89 и 92 (в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1).

Обозначения аминокислот: "Q, N, V, I, L, M, F, Y, W и Н" приведены в хорошо известном 1-буквенном коде в соответствии со стандартом IUPAC. В 3-буквенном стандартном коде IUPAC указанные аминокислоты имеют следующие обозначения: "Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp и His". Среди указанных аминокислот Q и N содержат полярные незаряженные боковые цепи, как и Н; V, I, L, M, F, Y и W содержат гидрофобные боковые цепи; а аминокислоты F, Y, W, H содержат ароматические боковые цепи.

Предпочтительные для замены аминокислоты включают в себя одну или несколько из аминокислот с гидрофобной боковой цепью, выбранных из группы, состоящей из: V, I, L, M, F, Y, и W, или одну или несколько из аминокислот с ароматической боковой цепью, выбранных из группы, состоящей из: F, Y, W и H. Более предпочтительные для замены аминокислоты включают в себя одну или несколько из аминокислот с ароматической боковой цепью, выбранных из группы, состоящей из: F, Y, W и H.

Это предпочтение основывается на неожиданном открытии, что аминокислоты с гидрофобными боковыми цепями, а особенно аминокислоты с ароматическими боковыми цепями, хотя и являются относительно большими, неожиданно хорошо подходят к участку капсида FMDV с двойной осью симметрии, и, как обнаружено, оказывают значительное стабилизирующее действие на капсид FMDV, содержащий мутантный белок VP2 с такой заменой.

В соответствии с настоящим изобретением, ароматическая аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую ароматическую боковую цепь. Боковая цепь является ароматической, если она содержит циклическую структуру, удовлетворяющую правилу Хюккеля.

В некоторых положениях αА-спирали белка VP2 аминокислотные замены настоящего изобретения являются особенно предпочтительными.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления мутантного белка VP2 FMDV настоящее изобретение предлагает замену аминокислоты, по меньшей мере, в одном положении, выбранном из группы, включающей в себя: 87, 90, 91, 93, 94, 97 и 98, где нумерация аминокислотных положений белка VP2 соответствует нумерации аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления замену в соответствии с настоящим изобретением вводят в αА-спираль белка VP2 по одному или нескольким из положений 87 и/или 98 αА-спирали белка VP2, где нумерация аминокислотных положений белка VP2 соответствует нумерации аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1. Неожиданно было обнаружено, что введение замен в указанных аминокислотных положениях, расположенных на N- и C-концах αА-спирали белка VP2, приводит к стабилизации капсида FMDV, содержащего такой мутантный белок VP2.

В предпочтительном варианте осуществления положения в αА-спирали белка VP2, подходящие для замещения в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя одно или несколько из положений 90, 93 и 97, где нумерация аминокислотных положений белка VP2 соответствует нумерации аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что боковые цепи аминокислот в указанных положениях αА-спирали белка VP2 направлены к противоположному белку VP2 поперек двойной оси симметрии. Это обуславливает стабилизацию капсида в результате введения отдельных мутаций в данных положениях.

Следовательно, нековалентные молекулярные взаимодействия, индуцированные аминокислотными заменами в указанных положениях, эффективно обеспечивают стабилизацию поперек двойной оси симметрии.

В более предпочтительном варианте осуществления положение αА-спирали белка VP2, подходящее для замещения в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой положение 93, в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1. Установлено, что данное аминокислотное положение находится посередине αА-спирали белка VP2, а боковая цепь аминокислоты ориентирована в направлении эквивалентного остатка противоположного белка VP2. Следовательно, введение замены в указанном положении аминокислотной последовательности белка VP2 FMDV может привести к образованию ковалентного взаимодействия поперек двойной оси симметрии, что может существенно стабилизировать капсид FMDV, содержащий такой мутантный белок VP2.

В качестве иллюстрации на фигуре 3 приведено 3D-изображение нековалентного (гидрофобная укладка) взаимодействия поперек двойной оси симметрии в капсиде FMDV, содержащем замену VP2 93W.

В соответствии с настоящим изобретением, нековалентные химически взаимодействия представляют собой межмолекулярные взаимодействия посредством атомных сил, такие как ионные, водородные, ван-дер-Ваальсовы или гидрофобные взаимодействия.

В другом предпочтительном варианте осуществления мутантный белок FMDV VP2 настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 87V, 87M; 90N, 90L; 91 F; 93Y, 93F, 93W, 93H, 93V, 93L, 93I, 93M, 93Q; 94V; 97I, 97M, 97V, 97Q; 98F и 98H, где нумерация аминокислотных положений белка VP2 соответствует нумерации аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

Как описано выше, данный вариант осуществления также ограничен условием, что аминокислотная замена в VP2 не приводит к получению одной или нескольких (или всех) из нижеследующих аминокислотных последовательностей, известных на предшествующем уровне техники для белков VP2 FMDV:

- 93H в FMDV серотипа А, и/или не 93Q в серотипе SAT-1,

- 98F в серотипе А, и/или не 98H в серотипе SAT-1, и/или не 98H в серотипе SAT-3.

В соответствии с настоящим изобретением, такое обозначение, как "VP2 93F", относится к замене любой исходной аминокислоты в положении 93 VP2 (в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1) на указанную аминокислоту (здесь: фенилаланин).

Сочетания нескольких предпочтительных аминокислотных замен также входят в объем настоящего изобретения. Так, например, мутантный белок VP2 настоящего изобретения может содержать замену 93Y, 93F или 93H наряду с заменой 97I или 97M, и/или 90N. Другие примеры конкретных сочетаний замен, входящих в объем настоящего изобретения, включают в себя двойные замены в мутантных белках VP2, выбранные из группы, включающей в себя: 93Y и 97I; 90N и 93Y; 87V и 93F; 93H и 98F; 93F и 98F; 91F и 98F; 95V и 98F; и 87V и 98F. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает мутантные белки VP2, содержащие тройные замены, выбранные из группы, включающей в себя: 93H, 95V и 98F; 93F, 94V и 98F; 87V, 90L и 93Q; 90L, 93Q и 98F; а также 90А, 93Q и 98F. Примером мутантного белка VP2, содержащего 4 замены, является мутантный белок VP2, содержащий: 87V, 90L, 93Y и 97I. Все аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 93Y, 93F, 93W, 93H, 93V, 93L, 93I, 93M и 93Q, где аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1, при условии, что указанная замена не приводит к получению белка VP2, содержащего одну или несколько (или все) из нижеследующих аминокислотных последовательностей: 93H в FMDV серотипа А, и/или не 93Q в серотипе SAT-1.

В одном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 93Y, 93F, 93W, 93V, 93L, 93I и 93M, где аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 93Y, 93F, 93W и 93H, где аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1, при условии, что замена не приводит к получению белка VP2 с аминокислотной последовательностью FMDV серотипа A, содержащей 93H.

В одном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 98F и 98H, где аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1, при условии, что замена не приводит к получению белка VP2, содержащего одну или несколько (или все) из нижеследующих аминокислотных последовательностей: 98F в FMDV серотипа А, и/или не 98H в серотипе SAT-1, и/или не 98H в серотипе SAT-3.

В одном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения представляет собой белок VP2 из FMDV, относящегося к серотипу, выбранному из группы, включающей в себя следующие серотипы: O, Asia 1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3, где VP2 содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 93Y, 93F, 93W и 93H, где аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения представляет собой белок VP2 из FMDV, относящегося к серотипу, выбранному из группы, включающей в себя следующие серотипы: A, O, Asia 1, SAT-2 и SAT-3, где VP2 содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 93Y, 93F, 93W, 93H и 93Q, где аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления мутантный белок VP2 FMDV настоящего изобретения представляет собой белок VP2 из FMDV любого серотипа, где мутантный белок VP2 содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей в себя: 93Y, 93F и 93W, где аминокислотные положения в белке VP2 пронумерованы в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1. Как описано ниже, указанные замены в данном положении приводят к получению капсидов FMDV, содержащих такой мутантный белок VP2, которые обладают наивысшей относительной стабильностью.

Предпочтительные аминокислотные замены в мутантном белке VP2 настоящего изобретения идентифицируют с помощью сочетания методов, с использованием экспериментов in silico, in vitro и in vivo.

В таблице 1, в разделах А, В и С, приведены результаты анализа стабильности капсидов FMDV, содержащих мутантные белки VP2, для разных серотипов FMDV. Относительная стабильность разных мутант VP2-содержащих капсидов приведена в виде произвольного значения: "0", "-" или "+", где ноль обозначает уровень стабильности капсида, содержащего незамещенный исходный белок VP2, символ минус обозначает относительно нестабильные капсиды, т.е. менее устойчивые, чем исходные капсиды, символ плюс обозначает относительно стабильные капсиды, т.е. более стабильные, чем исходные капсиды. Относительные различия между мутантными капсидами обозначаются