Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний

Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к получению ми-РНК-продуктов и их применению в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний, связанных с высокими уровнями экспрессии и/или активностью ваниллоидного канала с транзиторным рецепторным потенциалом (TRPV1), с использованием РНК-интерференции. Наряду с прочим, необходимо облегчение глазных состояний, связанных с болью в глазах, таких как дискомфорт и измененная чувствительность роговицы после рефракционной операции, использования контактных линз, синдрома сухого глаза и синдрома Шегрена.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

РНК-интерференция (РНК-и) является природным механизмом регуляции в большинстве эукариотических клеток, в котором используются малые двунитевые молекулы РНК (дн-РНК) для управления зависимым от гомологии сайленсингом генов. За ее открытие у червя C. elegans (Fire, 1998) Fire и Mello получили Нобелевскую премию в 2006 году. Вскоре после первого описания РНК-и также было показано, что она происходит в клетках млекопитающих не за счет длинных дн-РНК, а с помощью малых интерферирующих РНК (ми-РНК) длиной 21 нуклеотид (Elbashir, 2001).

Полагают, что процесс РНК-интерференции является эволюционно консервативным механизмом защиты клеток, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов и обычно является общим для разных типов и флоры, в которых такой процесс называют посттранскрипционным сайленсингом генов. С момента открытия механизма РНК-и произошел взрыв исследований, направленных на обнаружение новых соединений, которые могут избирательно изменять экспрессию генов в качестве нового пути лечения заболеваний человека посредством адресного воздействия на мишени, которые в противном случае не поддаются медикаментозному лечению с использованием традиционных фармацевтических способов, в которых используют малые молекулы или белки.

Согласно современным представлениям механизм РНК-и инициируется в том случае, когда длинные двунитевые РНК процессируются белком, подобным РНКазе III, известным как Dicer. Белок Dicer обычно содержит N-концевой домен РНК-геликазы, РНК-связывающий так называемый Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) домен, два домена РНК-азы III и домен, связывающий двунитевую РНК (dsRBD) (Collins, 2005), и его активность приводит к процессингу длинных двунитевых РНК на 21-24-нуклеотидные двунитевые ми-РНК с состоящими из 2 оснований выступающими 3'-концами и 5'-фосфатом и 3'-гидроксильной группой. Получаемые в результате дуплексы ми-РНК затем включаются в эффекторный комплекс, известный как РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), где антисмысловая или ведущая нить ми-РНК позволяет RISC распознавать и расщеплять последовательности мРНК-мишени (Elbashir, 2001) после зависимого от аденозинтрифосфата (АТФ) раскручивания двунитевой молекулы ми-РНК в результате РНК-геликазной активности (Nykanen, 2001). Каталитическая активность RISC, которая приводит к распаду мРНК, опосредована эндонуклеазой Argonaute 2 (AGO2) (Liu, 2004; Song, 2004). AGO2 относится к высоко консервативному семейству белков Argonaute. Белки Argonaute представляют собой высоко основные белки с молекулярной массой ~100 кД, которые содержат два общих домена, а именно домены PIWI и PAZ (Cerutti, 2000). Домен PIWI является ключевым для взаимодействия с Dicer и обладает нуклеазной активностью, ответственной за расщепление мРНК (Song, 2004). AGO2 использует одну нить дуплекса ми-РНК в качестве ведущей при нахождении матричных РНК, содержащих комплементарные последовательности, и расщепляет фосфодиэфирный остов между основаниями 10 и 11 относительно 5'-конца ведущей нити (Elbashir, 2001). Важной стадией во время активации RISC является расщепление смысловой нити или «нити-пассажира» под действием AGO2, удаляющей такую нить из комплекса (Rand, 2005). Кристаллографические исследования, в которых анализировали взаимодействие между ведущей нитью ми-РНК и доменом PIWI, показали, что имеется только 2-8 нуклеотидов, которые составляют «затравочную последовательность», которая направляет распознавание мРНК-мишени комплексом RISC, и что несовпадение одного нуклеотида в такой последовательности может существенно влиять на способность молекулы к сайленсингу (Ma, 2005; Doench 2004; Lewis, 2003). После того как мРНК была расщеплена и вследствие присутствия незащищенных концов РНК во фрагментах мРНК далее расщепляется и распадается под действие внутриклеточных нуклеаз и больше не будет транслироваться в белки (Orban, 2005), тогда как RISC будет повторно использоваться в последующих раундах (Hutvagner, 2002). Указанный процесс представляет собой каталитический процесс, приводящий к избирательному уменьшению количества конкретных молекул мРНК и соответствующих белков. Можно использовать такой нативный механизм сайленсинга генов с целью регуляции любого выбранного гена(ов), непосредственно доставляя ми-РНК-эффекторы в клетки или ткани, где они буду активировать RISC и вызывать эффективный и специфичный сайленсинг целевой мРНК.

Было опубликовано множество исследований, описывающих, какие идеальные признаки должна иметь ми-РНК, чтобы достичь максимальной эффективности, касающиеся длины, структуры, химического состава и последовательности. Исходные параметры для конструирования ми-РНК были приведены Tuschl с соавторами в WO 02/44321, хотя с тех пор были опубликованы многие последующие исследования, алгоритмы и/или улучшения. Также значительные усилия были предприняты для повышения стабильности ми-РНК, поскольку это считается одним из основных препятствий для терапии на основе ми-РНК, учитывая повсеместное присутствие РНКаз в биологических жидкостях. Одной из основных стратегий, которой руководствовались для повышения стабильности, было использование модифицированных нуклеотидов, таких как 2'-O-метилнуклеотиды, 2'-аминонуклеотиды, нуклеотиды, содержащие 2'-O- или 4'-C-метиленовые мостики. Также была описана модификация рибонуклеотидного остова, связывающего соседние нуклеотиды, главным образом, за счет введения фосфоротиоатных модифицированных нуклеотидов. По-видимому, повышенная стабильность часто обратно пропорциональна эффективности (Parish, 2000), и только определенное количество, положения и/или сочетания модифицированных нуклеотидов могут приводит к стабильному соединению, необходимому для сайленсинга. Так как это является важным препятствием при основанном на ми-РНК лечении, были опубликованы разные исследования с описанием некоторых картин модификации, которые давали хорошие результаты, примеры таких публикаций включают EP1527176, WO 2008/050329, WO 2008/104978 или WO 2009/044392, хотя в литературе можно найти намного больше.

Ваниллоидный канал с транзиторным рецепторным потенциалом (TRPV1), также называемый ваниллоидным рецептором 1 (VR-1), является капсаицин-чувствительным лиганд-зависимым катионным каналом, который был впервые открыт в 1997 (Caterina, 1997). TRPV1, главным образом, экспрессируется на сенсорных нейронах и служит в качестве молекулярного детектора тепла, капсаицина, протонов и эндованиллоидов (Caterina, 2001; Montell, 2002; Baumann, 2000). Хотя авторы настоящего изобретения обнаружили экспрессию TRPV1 также и в тканях слезной железы и цилиарного тела.

Когда TRPV1 активируется агонистами, такими как капсаицин и другие факторы, такие как нагревание, ацидоз, продукты липоксигеназы или анандамид, кальций поступает в клетку и происходит инициация сигналов боли. Активация канала индуцирует высвобождение нейропептида из окончаний центральных и периферический сенсорных нейронов, приводя к ощущению боли, нейрогенному воспалению и иногда к сокращению гладкой мускулатуры и кашлю. В действительности, недавно полученные данные свидетельствуют о роли TRPV1 в случае боли, кашля, астмы и недержания мочи (Jia, 2005). На самом деле TRPV1 является известной мишенью для лечения посредством обезболивания в ответ на болевые стимулы. Кроме того, лечение, направленное на снижение уровня экспрессии TRPV1 с использованием разных методик, также было описано в WO 2004/042046 или в публикации (Schubert, 2005), при этом основное внимание было уделено лечению боли.

Полимодальные ноцицепторы являются наиболее широко распространенным типом ноцицепторов, находящихся в роговице. Имеются фармакологические данные о том, что такие рецепторные волокна экспрессируют рецептор TRPV1, так как они отвечают на капсаицин, нагревание и кислоту. Более того, высокие дозы капсаицина инактивируют ответ полимодальных ноцицепторов роговицы на нагревание и кислоту, хотя ответная реакция на механическое воздействия остается неизменной. Это свидетельствует о том, что рецепторы TRPV1, присутствующие в окончаниях полимодальных нервных волокон роговицы, избирательно инактивировались. Таким образом, по-видимому, важная часть острого ноцицептивного ответа на повреждение роговицы и длительные ощущения боли, которые сопровождают воспалительные процессы и процессы раздражения в такой ткани, опосредованы активацией TRPV1.

Кроме того, в WO 2007/045930 описано использование TRPV1-специфичных ми-РНК для лечений глазных патологий, связанных с глазной болью и синдромом сухого глаза. Однако настоящее изобретение относится к улучшенным продуктам для снижения экспрессии TRPV1 и возникающего в результате дискомфорта в глазах. Преимущество лечения таких состояний с использованием ми-РНК-продуктов по сравнению с лечением традиционными химическим ингибиторами состоит в том, что лечение, основанное на ми-РНК, может давать более длительный эффект. Такой результат является следствием того факта, что после того, как эффекторная молекула больше не будет присутствовать, клетка должна синтезировать новые рецепторы заново; тогда при традиционном лечении могут оставаться определенные уровни интактных рецепторов на клеточной мембране.

В связи с современным образом жизни количество людей с патологиями глаз, связанными с измененной чувствительностью глаза, довольно высоко и, как ожидается, увеличится в связи с повышением возраста популяции. Рефракционная операция и контактные линзы часто приводят к измененной чувствительности роговицы и ощущению сухости в глазах у пациента. Это дополнительно усугубляется при длительной продолжительности рабочего времени за экраном компьютера и использованием систем кондиционирования воздуха, которые обычно дополнительно сушат атмосферный воздух. Также количество и качество слез снижается с возрастом. Симптомы, сопровождающие синдромы сухих глаз, включают зуд, жжение и раздражение тканей глаза. Более тяжелая форма синдрома сухих глаз встречается у пациентов с синдромом Шегрена. Наличие одного или разных сочетаний указанных ощущений называют глазной болью в используемом в настоящем описании значении. В настоящее время синдромом сухих глаз, судя по оценкам, страдают более 10 миллионом американцев.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой диаграмму, на которой показан временной профиль экспрессии TRPV1, полученный с использованием количественной ПЦР в реальном времени (Qrt-ПЦР) после трансфекции клеток HeLa разными ми-РНК, мишенью которых является TRPV1: соединением согласно настоящему изобретению (SEQ ID NO: 2), ранее описанным соединением, мишенью которого является другая область (SEQ ID NO: 7) и четырьмя другими ми-РНК (SEQ ID NO: 17-20), сконструированными для целенаправленного воздействия на TRPV1, и рандомизированной последовательностью, используемой в качестве негативного контроля. Для ясности показано два альтернативных представления одних и тех же результаты, A и B.

Фигура 2 представляет собой диаграмму, показывающую временной профиль экспрессии TRPV1, полученный с использованием Qrt-ПЦР, после трансфекции клеток HeLa разными ми-РНК согласно настоящему изобретению: SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 - SEQ ID NO: 16 и рандомизированной последовательностью, используемой в качестве негативного контроля.

На фигуре 3 показан временной график раскрытия глазной щели, измеряемого в мм, в случае глаз кроликов, обработанных соединением согласно настоящему изобретению (SEQ ID NO: 2), по сравнению с капсазепином, разрешенным анальгезирующим средством, специфичным для зависимой от TRPV1 боли, после стимуляции капсаицином.

Фигура 4 является графиком, показывающим отношения (%) к значениям раскрытия глазной щели до проведения тестирования после индукции боли капсаицином, полученные в результате обработки соединением согласно настоящему изобретению (SEQ ID NO: 2) и капсазепином.

Фигура 5 является графиком, показывающим количество интактного продукта (%), которое остается после воздействия 10% плазмы в течение 24 часов.

Фигура 6 является графиком, показывающим концентрацию последовательности SEQ ID NO: 2 в тканях глаза на основе 5-фосфорилированной интактной антисмысловой нити, что означает количество интактной не подвергнутой метаболизму антисмысловой нити SEQ ID NO: 2 (исходное соединение), которая присутствует в цитоплазматическом компартменте и активируется 5'-фосфорилированием. Левый столбик: 5 минут; правый столбик: 30 минут.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к разработке схемы дозирования для молекулы ми-РНК, при этом специфичной мишенью указанной молекулы является последовательность SEQ ID NO: 1 и молекула снижает экспрессию гена TRPV1 ври введении в клетку.

Ми-РНК согласно настоящему изобретению «целенаправленно воздействует на ген» когда, например, молекула ми-РНК избирательно снижает или ингибирует экспрессию гена. Фраза «избирательно снижает или ингибирует» в используемом в настоящем описании смысле охватывает ми-РНК, которые влияют на экспрессию одного гена, в данном случае TRPV1. Альтернативно ми-РНК целенаправленно действует на ген, когда ми-РНК гибридизуется в жестких условиях с транскриптом гена, т.е. с его мРНК. Способна гибридизоваться «в жестких условиях» означает отжиг с областью мРНК-мишени в стандартных условиях, например, при высокой температуре и/или в случае низкого содержания соли, которые, как правило, не способствуют гибридизации. Подходящий протокол (включающий использованием 0,1×SSC, 68°C в течение 2 часов) описан в публикации Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, например, на стр. 387-389.

Последовательности нуклеиновых кислот, указанные в настоящем описании, записаны в 5'-3'-направлении, если не указано иное. Термин «нуклеиновая кислота» относится к ДНК или РНК или их модифицированной форме, содержащей пуриновые или пиримидиновые основания, присутствующие в ДНК (аденин «A», цитозин «C», гуанин «G», тимин «T) или в РНК (аденин «A», цитозин «C», гуанин «G», урацил «U»). Интерферирующие РНК, предлагаемые в настоящем изобретении, могут содержать основания «T», например, на 3'-концах, даже хотя основания «T» и не встречаются в природе в РНК. В некоторых случаях такие основания могут быть указаны как «dT», чтобы отличить дезоксирибонуклеотиды, присутствующие в цепи рибонуклеотидов.

Последовательность-мишень, которая определена выше, описана как последовательность ДНК-мишень, которая использована для определения вариантов транскриптов в базах данных, используемых в целях конструирования ми-РНК, хотя конкретные соединения, которые необходимо использовать, будут представлять собой последовательности РНК, определяемые как таковые.

Были идентифицированы разные варианты транскриптов, соответствующие TRPV1. Номера доступа в GenBank, соответствующие четырем транскриптам TRPV1, продуцируемым в результате альтернативного сплайсинга: NM_080704 (NM_080704.3, GI: 117306161), NM_018727 (NM_018727.5, GI:117306160), NM_080706 (NM_080706.3, GI:117306163) и NM_080705 (NM_080705.3, GI:117306162). Кроме того, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute) имеет 5 дополнительных транскриптов TRPV1, опубликованных в: ENST00000174621, ENST00000310522, ENST00000344161, ENST00000399752, ENST00000399756, ENST00000399759, ENST00000425167.

Настоящее изобретение относится к схемам дозирования ми-РНК, которые ингибируют экспрессию гена TRPV1, при этом такие ми-РНК особенно эффективны по сравнению с ми-РНК, уже раскрытыми в известном уровне техники. «Особенно эффективны» означает, что они достигают более высоких степеней ингибирования и/или более длительного эффекта.

Такие ми-РНК направлены против последовательности-мишени, общей для всех вариантов транскриптов TRPV1, описанных в предыдущем параграфе, и таким образом опосредуют RISC-опосредованную деградацию всех возможных мРНК, присутствующих в клетке, кодирующих белок TRPV1. Указанная предпочтительная область-мишень, идентифицированная в настоящем изобретении, описана в виде последовательности SEQ ID NO:1 (5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3'). Ми-РНК описаны в WO 2011/148193.

Следовательно, ми-РНК согласно аспектам настоящего изобретения, предпочтительно, будут содержать двунитевую молекулу РНК, антисмысловая нить которой будет содержать или состоять из последовательности РНК, по существу комплементарной последовательности SEQ ID NO: 1, и ее смысловая нить будет содержать последовательность РНК, комплементарную антисмысловой нити, при этом обе нити гибридизуются посредством стандартного спаривания оснований между нуклеотидами.

Как используется в настоящем изобретении «по существу комплементарная» последовательности мРНК-мишени также можно понимать как «по существу идентичная» указанной последовательности-мишени. «Идентичность», как известно специалисту в данной области, означает степень родства последовательностей между нуклеотидными последовательностями, которую определяют на основе совпадения порядка и природы нуклеотидов в последовательностях. В одном из вариантов осуществления антисмысловая нить ми-РНК, имеющую комплементарность, составляющую 80% и от 80% вплоть до 100%, например, комплементарность 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью мРНК-мишени, считают по существу комплементарной, и ее можно применять в настоящем изобретении. Процент комплементарности описывает процент следующих друг за другом нуклеотидов в первой молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать пары оснований согласно правилу Уотсона-Крика с группой следующих друг за другом нуклеотидов во второй молекуле нуклеиновой кислоты.

Как известно из уровня техники, было предложено множество разных структур для достижения интерференции РНК. Обычно такие двунитевые молекулы имеют длину примерно от 19 до примерно 25 нуклеотидов и содержат структуры с тупыми концами, а также структуры с выступающими концами. Как было описано, выступающие концы имеют преимущества и могут присутствовать на 5'-концах или на 3'-концах любой нити, так как они снижают распознавание РНК-азами и имитируют природный субстрат Dicer. Некоторые авторы рекомендовали включение выступающих концов на обоих 3'-концах молекул, тогда как другие считают достаточным один выступающий конец. Другие авторы описали применение структур с тупыми концами со специфичными картинами модификации (EP 1527176, WO 2008/104978 и многие другие).

Выступающие концы могут содержать от 1 до 5 нуклеотидов, обычно выступающие концы состоят из динуклеотидов. Классические молекулы, используемые в данной области, содержат 19-нуклеотидную двунитевую молекулу, которая дополнительно содержит 3'-динуклеотидные выступающие концы, предпочтительно, содержащие дезоксинуклеотиды, как показано в ранних исследованиях Tuschl (WO 02/44321). Говорят, что такие выступающие концы дополнительно повышают резистентность к расщеплению нуклеазами (РНК-азами). Позднее Kim et al. (2005) описали, что 21-мерные продукты (содержащие динуклеотидные выступающие концы) необходимы для загрузки на RISC. Кроме того, Bramsen et al. (2009) описали введение возможных дестабилизирующих модификаций в выступающие концы, чтобы дополнительно повысить эффективность сайленсинга.

По существу предпочтительный вариант осуществления различных аспектов настоящего изобретения относится к молекулам ми-РНК, мишенью которых является последовательность SEQ ID NO: 1, которые содержат, по меньшей мере, один выступающий конец.

Другой альтернативный вариант осуществления различных аспектов настоящего изобретения относится к молекулам с тупыми концами.

Кроме того, предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к ми-РНК, содержащей или состоящей из 19-нуклеотидной двунитевой структуры, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1. Неожиданно, указанные 19-нуклеотидные двунитевые РНК оказались более резистентными к распаду, чем ранее описанные продукты, содержащие 21 нуклеотид и 3'-выступающие концы, как можно видеть на фигуре 5.

Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к 19-нуклеотидной двунитевой ми-РНК с тупыми концами, направленной против SEQ ID NO: 1. В следующем конкретном варианте такое соединение идентифицировано как последовательность SEQ ID NO: 2 (5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'). В следующем предпочтительном варианте осуществления антисмысловая нить такой ми-РНК по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, комплементарна последовательности SEQ ID NO: 1.

Кроме того, как описано в разделе, озаглавленном «Уровень техники», важной проблемой, связанной с молекулами ми-РНК, является их нестабильность в биологических жидкостях вследствие широкого распространения РНК-аз. Поэтому было описано применение многих разных химических модификации нуклеотидов с целью повышения стабильности соединений.

Другой проблемой, присущей молекулам ми-РНК, является их иммуногенность, при этом было обнаружено, что ми-РНК индуцируют неспецифичную активацию врожденной иммунной системы, включая повышающую регуляцию продукции некоторых цитокинов, например, интерферона типа I и/или типа II, а также IL-12, IL-6 и/или TNF-альфа. Считают, что источником таких эффектов является активация Toll-подобных рецепторов, таких как ТLR7, TLR8 и/или TLR3, под действием ми-РНК.

Оба указанных эффекта, распознавание РНК-азами и иммуногенность, также были описаны как зависимые от последовательности.

Некоторые химические модификации, которые повышают стабильность соединений за счет снижения чувствительности к РНК-азам, также способны снижать индукцию иммунного распознавания последующего ответа. Однако встраивание химически модифицированных нуклеотидов в ми-РНК также может приводить к пониженной эффективности сайленсинга, как описано в предыдущем разделе, и следовательно, к этому нужно подходить с осторожностью.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления различных аспектов настоящего изобретения ми-РНК дополнительно содержит по меньшей мере один нуклеотид с химической модификацией.

Предпочтительные химические модификации, которые повышают стабильность и снижают иммуногенные эффекты, включают 2'-O-метилнуклеотиды, 2'-фторнуклеотиды 2'-аминонуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, нуклеотиды, содержащие 2'-O или 4'-C-метиленовые мостики. Также возможна модификация рибонуклеотидного остова, связывающего соседние нуклеотиды, введением модифицированных фосфоротиоатом нуклеотидов. Следующая предпочтительная химическая модификация согласно настоящему изобретению относится к замене содержащих урацил рибонуклеотидов дезокситимидином (дезоксирибонуклеотидами). В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один химически модифицированный нуклеотид находится в смысловой нити, в антисмысловой нити или в обеих нитях ми-РНК.

Соответственно, в одном из вариантов осуществления ми-РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

Молекулы ми-РНК, которые описаны выше, могут быть доставлены внутрь клеток в своей нативной структуре с испошльзованием способов, известных в данной области. Например, при исследовании сайленсинга генов in vitro такие соединения вводили, используя стандартные реагенты для трансфекции. Чтобы достичь эффектов in vivo, такие соединения также могут быть введены голыми или с использованием средств, усиливающих доставку, таких как, например, липосомы, с использованием конъюгации с конкретным компонентом и т.д., хотя множество разных альтернатив известно в данной области, и их использовали по-разному, в зависимости от требуемого участка-мишени в организме.

Альтернативно, молекулы ми-РНК согласно различным аспектам изобретения могут быть экспрессированы в клетках с эукариотических промоторов. Рекомбинантные векторы, способные экспрессировать молекулы ми-РНК, могут быть доставлены и могут сохраняться в клетках-мишенях. Альтернативно могут быть использованы векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул нуклеиновой кислоты. Такие векторы при необходимости можно вводить многократно. После экспрессии молекула ми-РНК взаимодействует с мРНК-мишенью и генерирует ответ в виде РНК-интерференции. Молекулы ми-РНК, полученные таким образом, часто называют кш-РНК (короткими шпилечными РНК), так как их смысловая и антисмысловая нити связаны небольшой петлей нуклеотидов. Доставка векторов, экспрессирующих молекулу ми-РНК, может быть системной, такой как внутривенное или внутримышечное введение, путем введения в клетки-мишени, эксплантированные из организма индивида, с последующим повторным введение в организм индивида, или любыми другими способами, которые обеспечивают возможность введения в требуемую клетку-мишень.

Следующий аспект изобретения относится к применению ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1, для получения лекарственного средства, применимого в способе лечения глазного состояния, характеризуемого повышенной экспрессией и/или активностью TRPV1, при этом ми-РНК вводят в соответствии со схемой дозирования, раскрытой в настоящем описании. Способ включает ингибирование экспрессии TRPV1 у пациента. Термин ингибирование используют для того, чтобы указать снижение или понижающую регуляцию экспрессии или активности. Предпочтительно, глазным состоянием является боль в глазах. В одном из вариантов осуществления состояние глаз выбрано из группы, состоящей из дискомфорта в глазах и измененной чувствительности роговицы после рефракционной операции, использования контактных линз, синдрома сухих глаз, синдрома Шегрена и других патологий глаз.

Предполагается, что терапевтическое лечение с применением ми-РНК, направленных против мРНК TRPV1, более эффективно, чем применение местных глазных капель, содержащих малые молекулы, благодаря увеличению длительности наблюдаемого эффекта, что позволяет менее часто вводить дозы и лучше соблюдать пациентами режим лечения. Это особенно важно в таких случаях, как синдром сухих глаз и измененная чувствительность роговицы, так как они часто являются хроническими состояниями.

Имея в виду получение такого лекарственного средства, могут быть приготовлены препараты ми-РНК согласно различны аспектам настоящего изобретения. Предпочтительно, композиции и препараты указанных ми-РНК могут быть введены местно в представляющий интерес орган. В еще более предпочтительном варианте их можно приготовить для местного введения в глаз, предпочтительно, на поверхность роговицы глаза. Нанесение на поверхность роговицы может быть осуществлено, например, в форме глазных капель, геля, лосьона, крема или вкладышей в глаза. Другие формы введения в глаз могут включать инъекцию в глаз.

Следующий предпочтительный вариант различных аспектов настоящего изобретения относится к ми-РНК, специфично нацеленной на последовательность SEQ ID NO: 1, которая описана в предыдущих абзацах, для применения в качестве лекарственного средства для лечения состояния глаз, характеризуемого повышенной экспрессией и/или активностью TRPV1, при этом ми-РНК вводят согласно схеме дозирования, раскрытой в настоящем описании. Как описано выше, такая ми-РНК может представлять собой ми-РНК, содержащую или состоящую из 19-нуклеотидной двунитевой структуры, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1. Такая ми-РНК может иметь тупые концы. Предпочтительно, ми-РНК имеет последовательность SEQ ID NO: 2. Другая ми-РНК для применения согласно изобретению может быть выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

В контексте настоящего изобретения, чтобы «быть специфично нацеленной на мишень» последовательность ми-РНК согласно изобретению, предпочтительно, содержит по меньшей мере такую же затравочную последовательность. Таким образом, любая последовательность согласно изобретению, специфичной мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1, предпочтительно, является идентичной в положениях 2-8 антисмысловой нити.

Невзирая на сказанное выше, ми-РНК согласно различным аспектам настоящего изобретения можно применять для сайленсинга экспрессии TRPV1 в других тканях, отличных от глаза. Следовательно, указанные ми-РНК следует получать в виде препаратов соответствующим образом.

Например, молекула ми-РНК может содержать наполнитель для доставки, включая липосомы, для введения индивиду. Носители и разбавители и их соли могут присутствовать в фармацевтически приемлемых препаратах. Молекулы нуклеиновых кислот можно вводить в клетки различными способами, известными специалисту в данной области, включая без ограничения инкапсулирование в липосомы, ионтофорез или включение в другие наполнители, такие как биологически разрушаемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины, сополимеры (молочной-гликолевой кислот) (PLGA) и микросферы PLCA, биологически разрушаемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы, или белковые векторы. В другом варианте молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению также могут быть приготовлены в виде препарата или в комплексе с полиэтиленимином и его производными, такими как производные полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-GAL) или полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-triGAL). Предпочтительными композициями согласно изобретению являются водные растворы, в частности растворы солей, такие как фосфатно-солевой буфер (PBS) с диапазоном pH примерно от 7,0 до примерно 7,4, предпочтительно, с pH 7,2±0,5.

Молекула ми-РНК согласно изобретению может быть приготовлена в виде комплекса со средствами, разрушающими мембраны и/или с молекулой катионного липида или молекулой вспомогательного липида.

Системы доставки, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, например, водные и неводные гели, кремы, множественные эмульсии, микроэмульсии, липосомы, мази, водные и неводные растворы, лосьоны, аэрозоли, углеводородные основы и порошки и могут содержать эксципиенты, такие как солюбилизаторы, усилители проницаемости (например, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты и аминокислоты) и гидрофильные полимеры (например, поликарбофил и поливинилпирролидон). В одном из вариантов осуществления фармацевтически приемлемым носителем является липосома или усилитель трансдермальной доставки.

Фармацевтический препарат согласно изобретению имеет форму, подходящую для введения, например, системного или локального введения, в клетку или в организм индивида, включая, например, человека. Подходящие формы отчасти зависят от применения или пути введения, например, перорального, трансдермального или посредством инъекции. Другие факторы известны в данной области и включают такие учитываемые факторы, как токсичность и формы, которые предотвращают такой эффект композиции или препарата.

Настоящее изобретение также относится к композициям, приготовленным для хранения или введения, которые содержат фармацевтически эффективное количество требуемых соединений в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области. Например, могут быть добавлены консерванты, стабилизаторы, красители и корригенты. К ним относятся бензоат натрия, сорбиновая кислота и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Кроме того, могут быть использованы антиоксиданты и суспендирующие средства.

Фармацевтически эффективной дозой является доза, необходимая для профилактики, ингибирования появления или лечения (ослабления симптома в определенной степени, предпочтительно, всех симптомов) патологического состояния. Фармацевтически эффективная доза обычно зависит от типа заболевания, используемой композиции, пути введения, вида млекопитающего, подвергаемого лечению, физических характеристики конкретного рассматриваемого млекопитающего, сопутствующей лекарственной терапии и других факторов, которые будут известны специалистам в области медицины.

В частности, известно, что кроме дозы схема введения является важной определяющей эффективной понижающей регуляции молекулами ми-РНК.

Авторы изобретения разработали эффективную схему дозирования для введения ми-РНК с целью лечения состояния глаз, характеризуемого повышенной экспрессией и/или активностью TRPV1, в частности, с целью лечения сухих глаз и/или глазной боли, при этом избегают побочных эффектов и средство можно безопасно вводить. Таким образом, введение молекулы ми-РНК в том случае, когда указанная молекула специфично нацелена на последовательность SEQ ID NO: 1 и снижает экспрессию гена TRPV1 при введении в клетку, согласно схеме дозирования, описанной в настоящее публикации, приводит к клиническому улучшению.

Как используется в настоящем описании «эффективная схема дозирования» относится к количеству ми-РНК согласно изобретению, достаточному для лечения или ослабления расстройства глаз, связанного со сверхэкспрессией TRPV1. Для лечения сухих глаз и/или глазной боли у человека, предпочтительно, снижение уровней глазной болезни, которые измеряют, используя различные параметры, известные специалистам в данной области, например, используя опросный лист OSDI (индекс заболевания глазной поверхности) (в случае сухих глаз) и/или VAS (визуальную аналоговую шкалу) в случае глазной боли. Любое снижение таких уровней по сравнению с уровнями до лечения дает преимущества, независимо от того доставляют ли соединения согласно изобретению отдельно или в сочетании с другим подходящим терапевтическим средством (например, в изобретении предполагается снижение OSDI и/или VAS более чем примерно на 5%, примерно на 10%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 35%, примерно на 40%, примерно на 50% или примерно на 60% по сравнению с IOP до обработки).

Терапевтически эффективное количество также может относиться к количеству ми-НК, достаточному для задержки или минимизации появления глазного расстройства, связанного с сухими глазами и/или глазной болью. Терапевтически эффективное количество также может относиться к количеству терапевтического средства, которое приносит терапевтическую пользу при лечении или контролировании глазного расстройства, связанного с сухими глазами и/или глазной болью. Кроме того, терапевтически эффективное количество по отношению к ми-НК согласно изобретению означает такое количество терапевтического средства отдельно или в сочетании с другими средствами терапии, которое приносит терапевтическую пользу при лечении или контролировании глазного расстройства, связанного с сухими глазами и/или глазной болью. При использовании в связи с количеством ми-НК согласно изобретению термин может охватывать количество, которое улучшает комплексную терапию, снижает или позволяет избегать нежелательных эффектов или повышает терапевтическую эффективность или оказывает синергетическое действие с другим терапевтическим средством.

Терапевтически полезным при лечении или контролировании глазного расстройства, такого как сухие глаза и/или глазная боль, является длительное снижение боли и/или нежелательных ощущений. Учитывая, что ми-РНК будет снижать уровни рецепторов TRPV1 в клетке, после прекращения лечения клетка должна вновь синтезировать новые рецепторы до того как появятся болевые ощущения. Как таковая терапия на основе лечения ми-РНК будет иметь более продолжительное действие. Это считается значимым повышением терапевтической эффективности.

Дополнительной пользой применения ми-РНК является минимальная вероятность побочных эффектов или проблем острой токсичности, возникающих вследствие присутствия в системе кровообращения, часто связанных с разными основанными на глазных каплях способами лечения. Это связано с тем, что когда соединение попадет в кровоток, оно будет быстро разрушаться РНК-азами, присутствующими в крови.

С другой стороны, тот факт, что препарат, описанный в настоящей публикации, может поставляться во флаконах, содержащих однократные дозы, означает включение противомикробных консервантов, присутствующих в бо