Олигонуклеотиды для введения изменения в последовательность молекулы целевой рнк в живой клетке

Олигонуклеотиды для введения изменения в последовательность молекулы целевой рнк в живой клетке

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к генной терапии, более конкретно, к олигонуклеотидам для введения изменений в последовательность молекулы целевой РНК, присутствующей в живой клетке.

Уровень техники

Причиной многих генетических заболеваний являются мутации в геноме. Было обнаружено, что за счет мутаций осуществляются модификации генома различного типа: делеции одной или нескольких пар оснований, одно или более ошибочных спариваний оснований в последовательности гена, вставка (инсерция) одного или нескольких нуклеотидов или реитерация триплетных повторов и отсутствие или дупликация целого гена или его части.

Генетические заболевания, вызываемые ошибочными спариваниями, делецией или инсерцией одной или более пар оснований, включают муковисцидоз (кистозный фиброз), мышечную дистрофию, серповидноклеточную анемию, гемофилию, β-талассемию, синдром ломкой Х-хромосомы (синдром Мартина-Белл).

Репарацию РНК можно применять для исправления генетических дефектов на уровне РНК.

Олигонуклеотиды и их комплексы применялись в качестве терапевтических молекул для восстановления ДНК-модификаций (ДНК-репарации) (I Papaioannou, JP Simons, JS Owen Oligonucleotide-directed gene-editing technology: mechanisms and future prospects Expert Opin. Biol. Ther. (2012) 12(3): 329-342). Эти олигомеры могут содержать РНК- и/или ДНК-нуклеотиды. Они применяются для осуществления сайт-специфической репарации дефектной ДНК. Предполагалось, что репарация осуществляется путем активации механизмов репарации эндогенной ДНК после узнавания введенного ошибочного спаривания оснований.

Триплекс-формирующие олигонуклеотиды также применялись для таргетирования генов (направленного воздействия на гены) в качестве специфических в отношении последовательностей инструментов. Триплекс-формирующие олигонуклеотиды с высокой аффинностью связываются с большой бороздкой двухцепочечной (двойной) спирали ДНК. Благодаря этому свойству триплекс-формирующие олигонуклеотиды были предложены в качестве средства для сайт-специфической коррекции генов-мишеней (Knauert et al., Hum Mol Genet. (2001) 10, 2243-2251; Richardson et al, Drug Target (2002) 10, 133-134; Thoung et al., (1993) Angewandte Chemie. Intl. Ed. Eng., 32, 666-690.). Современные методы репарации генов-мишеней не очень эффективны, и/или не доказано, что они работают в живых клетках in situ, что оставляет возможность существования другого механизма репарации дефектов генов.

Сообщалось о репарации дефектных генов на уровне РНК. Специфичную репарацию мРНК с помощью комплекса дуплексных олигонуклеотидов применяли, например, для вставки нуклеотидов в AF508 CFTR мРНК in vitro. Предполагаемый механизм этого процесса включает расщепление, опосредуемое РНКазой Н, с последующей репарацией РНК. (PC Zamecnik, МК Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a cultured AF508 cystic fibrosis transmembrane conductance 10 regulator cell line by oligonucleotide insertion Proc Natl Acad Sci 2004 101(21) 8150- 8155; Международная заявка WO 2005094370, Oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools).

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу репарации гена-мишени в живых (живых) клетках, более предпочтительно, в живых клетках многоклеточного организма (in vivo). Более конкретно, в настоящем изобретении рассматривается введение изменений целевой РНК in vivo в живых клетках многоклеточного организма, более конкретно, в живых клетках животного, более конкретно, млекопитающего, в особенности человека. Несмотря на то, что имеются более ранние сообщения о репарации генов в живых клетках, заявители полагают, что в настоящем изобретении впервые раскрывается возможность введения изменений в молекуле целевой РНК в живой клетке in vivo, изменяя тем самым фенотип этого организма, с применением олигонуклеотидов, предпочтительно, одноцепочечных олигонуклеотидов, более предпочтительно, одноцепочечных олигорибонуклеотидов, еще более предпочтительно, химически модифицированных одноцепочечных олигорибонуклеотидов. Неожиданно оказалось, что олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить in vivo без утраты активности и в таких количествах, которые позволяют практически исправить болезненный фенотип организма субъекта. Данное изобретение иллюстрируется на примере введения в легкое особи (организма), страдающей муковисцидозом, химически модифицированного олигорибонуклеотида, который способен восстанавливать последовательность РНК, кодирующую CFTR, тем самым исправляя функцию белка CFTR и восстанавливая CF фенотип, или по меньшей мере улучшая состояние организма. Следовательно, настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, предпочтительно, одноцепочечному антисмысловому олигонуклеотиду; к композиции, содержащей такой олигонуклеотид; к фармацевтической композиции, содержащей такой олигонуклеотид и фармацевтически приемлемый носитель; к применению и к способам применения такого олигонуклеотида или композиции для in vivo или in vitro репарации РНК и/или введения изменений (модификации) в последовательность молекулы целевой РНК; такой олигонуклеотид или такую композицию для применения с целью лечения или предупреждения заболевания, связанного с (генетическим) нарушением или с генетической мутацией, включающего введение такого олигонуклеотида или композиции субъекту, предпочтительно, человеку; и к способу лечения или предупреждения заболевания, связанного с (генетическим) нарушением или с генетической мутацией, включающему введение такого олигонуклеотида или композиции субъекту, предпочтительно, человеку. При введении такого, предпочтительно, одноцепочечного антисмыслового, олигонуклеотида в клетку, предпочтительно, клетку млекопитающего, более предпочтительно, в клетку человека, этот олигонуклеотид направляется в то место РНК или ее предшественника или матрицы, где требуется репарация РНК, и, вероятно, служит в качестве лидирующей (ведущей) цепи для репарации РНК. Конкретный механизм репарации неизвестен, но олигонуклеотид по настоящему изобретению, предпочтительно, одноцепочечная молекула для репарации, предпочтительно, не допускает участия РНКазы Н в процессе репарации. Изменение, опосредуемое в целевой РНК, может происходить непосредственно на уровне РНК или опосредованно с использованием ДНК, которая затем транскрибируется в РНК, или ее предшественник. Олигонуклеотиды по настоящему описанию, как правило, называются олигонуклеотидами по изобретению и могут применяться во всех вариантах настоящего изобретения.

Все варианты настоящего изобретения могут осуществляться (в случае способа или применения) или могут применяться (в случае соединения или композиции) in vitro, in vivo или ex vivo.

Предмет и способы по настоящему изобретению удобно применять для лечения муковисцидоза, предпочтительно, с использованием репарации мутации дельтаР508 в экзоне 10 белка CFTR (трансмембранного регулятора муковисцидоза). Механизм действия типичного олигонуклеотида по изобретению, молекулы, показанной SEQ ID NO: 1, представлен на фигурах 1-3 и 7А. Активность типичного олигонуклеотида по изобретению, молекулы, представленной SEQ ID NO: 1, по сравнению с ранее описанной двухцепочечной (двунитевой) молекулой (Zamecnik et al, см. выше), иллюстрируется на фигуре 4. На фигуре показано, что представленный в настоящем описании одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид (AON) по меньше мере проявляет такую же активность, и по-видимому, является более активным, в процессе репарации CFTR по сравнению с ранее описанной двухцепочечной молекулой (PC Zamecnik, МК Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a cultured ΔF508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion Proc Natl Acad Sci 2004 101(21) 8150-8155; W 02005094370, Oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools). Активность олигонуклеотида SEQ ID NO: 1 определяли, применяя сравнительный анализ, описанный в статье Zamecnik et al, см. выше, в частности, см. Фиг. 4 на стр. 8153.

Предмет и способы по настоящему изобретению удобно применять для введения изменения в другую молекулу целевой РНК и/или для лечения других заболеваний, связанных с (генетическими) нарушениями, такими, но без ограничения, как альбинизм, дефицит альфа-1-антитрипсина, болезнь Альцгеймера, боковой (латеральный) амиотрофический склероз, астма, β-талассемия, ЦАДАСИЛ (Cadasil)-синдром, болезнь Шарко-Мари-Тута (Charcot-Marie-Tooth), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ, COPD), дистальная спинальная мышечная атрофия (DSMA), мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера, дистрофический буллезный эпидермолиз, буллезный эпидермолиз, болезнь Фабри, семейный аденоматоз, полипоз, галактоземия, болезнь Гоше, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, гемофилия, врожденный гемохроматоз, синдром Хантера, болезнь Хантингтона, синдром (Гертруды) Гурлер (болезнь Шейе), воспалительные заболевания кишечника (ВБК, IBD), врожденный синдром массивной агглютинации (полиагглютинации), синдром Леша-Нихена, синдром Линча, синдром Марфана, мукополисахаридоз, мышечная дистрофия, миотоническая дистрофия типа I и II, болезнь Ниманна-Пика типа А, В и С, NY-ESO-1 опосредованный рак, болезнь Паркинсона, синдром Пейтца-Егерса, фенилкетонурия, болезнь Помпе, первичная цилиарная дискинезия, легочная гипертензия, пигментная дистрофия сетчатки, болезнь Сандхоффа, синдром тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД, SCID), серповидноклеточная анемия, спинальная мышечная атрофия, болезнь Штаргардта, болезнь Тея-Сакса, Х-сцепленный иммунодефицит (синдром ломкой Х-хромосомы), различные формы рака (например, рак молочной железы или рак яичника, связанный с мутацией в генах BRCA1 и 2) и т.п.

Согласно одному предпочтительному варианту изобретения изменение в целевой последовательности РНК включает инсерцию одного или более нуклеотидов в целевую РНК. Согласно более предпочтительному варианту инсерция одного или более нуклеотидов приводит к инсерции по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в полипептидной последовательности, кодируемой целевой РНК-последовательностью. Согласно наиболее предпочтительному варианту инсерция аминокислотной последовательности приводит к восстановлению кодируемого полипептида до полипептида с нормальной функцией в многоклеточном организме. Соответственно, наиболее предпочтительными вариантами изобретения являются такие варианты, в которых целевая РНК-последовательность в многоклеточном организме связана с нарушением, вызванным нарушением функции целевой РНК-последовательности, а генетическое нарушение выбрано из группы нарушений, вызванных отсутствием одного или более нуклеотидов в целевой РНК-последовательности по сравнению с целевыми РНК-последовательностями с нормальной функцией. Предпочтительными последовательностями по изобретению являются такие целевые РНК-последовательности, в которых отсутствует по меньшей мере часть кодона, которая восстанавливается посредством (введения изменения в РНК-последовательности с помощью олигонуклеотида по изобретению.

В настоящем изобретении показано, что репарацию РНК можно проводить in vivo посредством системного введения олигонуклеотида по изобретению. В зависимости от ткани или органа, связанных с нарушением, или, в более общем смысле, в которых нужно выполнить изменения в целевой РНК, для того, чтобы оптимизировать доставку олигонуклеотида по изобретению, следует специально подобрать способ введения. При нарушениях работы легких и других заболеваниях дыхательных путей олигонуклеотиды по изобретению можно удобно вводить непосредственно в легкие, например, с помощью ингаляции. Или же, в зависимости от нарушения и/или ткани-мишени олигонуклеотид по изобретению удобно вводить местно (например, на кожу) или системно, например, интрадермально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, перорально, ректально, интракраниально и т.п..

Олигонуклеотиды по изобретению могут содержать ДНК- или РНК-нуклеотиды; для более высокой стабильности эти нуклеотиды могут представлять собой модифицированные ДНК- или РНК-нуклеотиды, по описанию в другом месте настоящей заявки. Олигонуклеотид по изобретению может содержать, например, инозин и/или может содержать модифицированные нуклеотиды, включающие фрагменты, выбранные из группы, состоящей из 2'-О-алкилрибозы, 2'-O-метилрибозы, 2'-фторрибозы, фосфоротиоата, метилфосфоната, РМО (ФМО), 5-метил-dC, 2-амино-dA, С5-пиримидина. Примером такого предпочтительного стабилизированного нуклеотида является нуклеотид, стабилизированный 2'-O-метильной группой, другим примером является замкнутая (закрытая, "запертая") нуклеиновая кислота (LNA, ЗНК) и/или пептид(о)-нуклеиновая кислота (PNA, ПНК). Другие способы повышения стабильности могут включать, например, фосфоротиоатные связи между нуклеотидами. Олигонуклеотиды по изобретению можно получать любым методом, известным из уровня техники. Специалист в данной области техники знает, как синтезировать олигонуклеотиды по изобретению.

Исходя из этого олигонуклеотид по изобретению, предпочтительно, модифицируют химическими методами с тем, чтобы он был устойчив к действию эндонуклеаз и РНКазы Н, и с тем, чтобы инициировать (РНК) связывание и устойчивость дуплекса. Конкретные свойства выбранной химической группы, по меньшей мере частично, влияют на доставку олигонуклеотида по настоящему изобретению к мишени: способ введения, биологическую стабильность, биораспределение, внутритканевое распределение и клеточное поглощение и миграцию. Кроме того, можно осуществить дальнейшую оптимизацию химической структуры олигонуклеотида с целью повысить аффинность и устойчивость (стабильность) связывания, повысить активность, безопасность и/или снизить стоимость изделий, уменьшая время или совершенствуя методику синтеза или процессов очистки. Многие химические модификации обычно доступны и/или коммерчески доступны для специалиста в данной области техники (такие как 2-О-метил РНК и 5-замещенные пиримидины и 2,6-диаминопурины).

Олигонуклеотид по изобретению может иметь по меньшей мере один скелет и/или модификацию сахара и/или одну модификацию основания.

Модификация основания включает модифицированный вариант натуральных пуриновых и пиримидиновых оснований (в частности, аденина, урацила, гуанина, цитозина и тимина), такой как гипоксантин, оротовая кислота, агматидин, лизидин, 2-тиопиримидин (например, 2-тиоурацил, 2-тиотимин), G-clamp нуклеотид и его производные, 5-замещенный пиримидин (например, 5-галогенурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 5-аминометилурацил, 5-гидроксиметилурацил, 5-аминометилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, Super Т), 7-дезазагуанин, 7-дезазааденин, 7-аза-2,6-диаминопурин, 8-аза-7-дезазагуанин, 8-аза-7-дезазааденин, 8-аза-7-дезаза-2,6-диаминопурин, Super G, Super А и N4-этилцитозин или их производные; N²-циклопентилгуанин (cPent-G), N²-циклопентил-2-аминопурин (cPent-AP) и N²-пропил-2-аминопурин (Pr-АР) или их производные; и вырожденные или стандартные основания, такие как 2,6-дифтортолуол, или отсутствующие основания, такие как АР-сайты (например, 1-дезоксирибоза, 1,2-дидезоксирибоза, 1-дезокси-2-O-метилрибоза; или производные пирролидина, в которых атом кислорода в цикле замещен на азот (азарибоза)). Примеры производных Super A, Super G и Super Т можно найти в патенте США №6,683,173 (Epoch Biosciences), который включен в настоящее изобретение посредством отсылки. Было показано, что cPent-G, cPent-AP и Pr-АР ослабляют иммуностимулирующие эффекты при включении в киРНК (Peacock Н. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200).

Модификация сахаров включает модифицированный вариант рибозильного фрагмента, в частности 2'-O-модифицированную РНК, например, 2'-O-алкил или 2'-O-(замещенный)алкил, например, 2'-O-метил, 2'-O-(2-цианоэтил), 2'-O-(2-метокси)этил (2'-МОЕ), 2'-O-(2-тиометил)этил, 2'-О-бутирил, 2'-О-пропаргил, 2'-O-аллил, 2'-O-(2-амино)пропил, 2'-O-(2-(диметиламино)пропил), 2'-O-(2-амино)этил, 2'-O-(2-(диметиламино)этил); 2'-дезокси (ДНК); 2'-O-(галогеналкокси)метил (Arai K. et al. Bioorg. Med. Chem. 2011, 27, 6285), например, 2'-O-(2-хлорэтокси)метил (MCEM), 2'-O-(2,2-дихлорэтокси)метил (DCEM); 2'-O-алкоксикарбонил, например, 2'-O-[2-(метоксикарбонил)этил] (МОСЕ), 2-O-[2-(N,N-метилкарбамоил)этил] (MCE), 2'-О-[2-(N,N-диметилкарбамоил)этил] (DCME); 2'-галоид, например, 2'-F, FANA (2'-F арабинозил нуклеиновая кислота); модификации сахаров по атомам углерода и азота; 3'-О-алкил, например, 3'-О-метил, 3'-О-бутирил, 3'-О-пропаргил; и их производные. Другие модификации включают "мостиковую" или "бициклическую" нуклеиновую кислоту (BNA), например, замкнутую (закрытую) нуклеиновую кислоту (LNA, ЗНК), ксило-LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, cEt (2'-O4'-С пространственно затрудненный этил) LNA, cMOEt (2'-O,4'-С пространственно затрудненный метоксиэтил) LNA, нуклеиновую кислоту с этиленовым мостиком (ENA), трицикло ДНК; незапертую (разомкнутую) нуклеиновую кислоту (UNA); циклогексенил-нуклеиновую кислоту (CeNA), альтрит-нуклеиновую кислоту (ANA), гексит-нуклеиновую кислоту (HNA), фторированную HNA (F-HNA), пиранозил-РНК (p-RNA, п-РНК), 3'-дезоксипиранозил-ДНК (p-DNA); морфолино (РМО), катионную морфолино (PMOPlus), РМО-Х; и их производные. Настоящее изобретение охватывает также введение нескольких (более одной) разных модификаций сахаров в олигонуклеотид по настоящему изобретению. BNA производные описаны, например в Международной заявке WO 2011/097641, которая во всей полноте включена в настоящее изобретение посредством отсылки. Примеры РМО-Х описаны в Международной заявке WO 2011150408, которая во всей полноте включена в настоящее изобретение посредством отсылки.

Модификация скелета включает модифицированный вариант фосфодиэфира, такой как фосфоротиоат (PS), хирально чистый фосфоротиоат, фосфородитиоат (PS2), фосфоноацетат (РАСЕ), фосфоноацетамид (РАСА), тиофосфоноацетат, тиофосфоноацетамид, пролекарство фосфоротиоата, Н-фосфонат, метилфосфонат, метилфосфонотиоат, метилфосфат, метилфосфоротиоат, этилфосфат, этилфаосфоротиоат, боранофосфат, боранофосфоротиоат, метил боранофосфат, метил боранофосфонат, метил боранофосфоротиоат и их производные. Другие модификации включают фосфорамидит, фосфорамидат, N3'→Р5' фосфорамидат, фосфор диамидат, фосфоротиодиамидат, сульфамат, диметиленсульфоксид, сульфонат, триазол, оксалил, карбамат, метиленимино (MMI) и тиоацетамидо-нуклеиновую кислоту (TANA); и их производные. Настоящее изобретение охватывает также введение нескольких (более одной) разных модификаций скелета в олигонуклеотид по настоящему изобретению.

Другие химические модификации олигонуклеотида по настоящему изобретению включают пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA, ПНК), PNA (ПНК), модифицированные борным кластером, пирролидин оксипептидо-нуклеиновую кислоту (POPNA), гликоль- или глицерин-нуклеиновую кислоту (GNA), треозо-нуклеиновую кислоту (TNA), ациклический треонин-нуклеиновую кислоту (aTNA), морфолино-олигонуклеотид (РМО, РМО-Х), катионные морфолино-олигомеры (PMOPlus), олигонуклеотиды с интегрированными (объединенными) основаниями и скелетами (ONIBs), пирролидин-амид олигонуклеотиды (POMs) и их производные.

Олигонуклеотид по изобретению содержит последовательность, комплементарную целевой РНК, которая подлежит репарации (восстановлению, исправлению) и, предпочтительно, кодирует последовательность полипептида дикого типа. Соответственно, вследствие вырождения кодонов, олигонуклеотид может содержать один или более вырожденных комплементарных кодонов. Комплементарные нуклеотиды могут находиться по обеим сторонам сайта, которые подлежит репарации, т.е. последовательность, фланкирующая последовательность, подлежащую изменению, предпочтительно находится на 3', 5' или как на 3', так и на 5'стороне от последовательности, подлежащей изменению. В результате спаривания оснований этих комплементарных последовательностей репарация РНК активируется.

Последовательность целевой РНК, предпочтительно, отличается от восстановленной (исправленной) последовательности или последовательности дикого типа. Неисправленная целевая РНК, предпочтительно, представляет собой мутированную последовательность. Предпочтительно, мутация представляет собой замену, делецию или инсерцию (вставку) нормальной последовательности дикого типа. Исправленная нацеленная РНК, предпочтительно, представляет собой последовательность гена дикого типа или другую заданную эталонную последовательность.

Протяженность олигонуклеотида по изобретению, предпочтительно, составляет от 15 до 100 нуклеотидов и, предпочтительно, по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или по меньшей мере 40 нуклеотидов, из которых по меньшей мере 10 нуклеотидов комплементарны целевой последовательности РНК. В качестве матрицы (или индуктора, индуцирующего фактора) репарации можно применять другие нуклеотиды. Спаривание оснований с целевой мРНК-последовательностью преимущественно осуществляется в клетке. Клетка может являться клеткой млекопитающего и может находиться в клеточной культуре (in vitro) или в организме (внутри тела) (in vivo).

Настоящее изобретение, предпочтительно, относится к способу лечения муковисцидоза, при этом генетическое нарушение, предпочтительно, представляет собой мутацию дельтаF508, а последовательность, подлежащая изменению, предпочтительно, представляет собой (пре)мРНК белка CFTR, содержащая (укрывающая) мутацию дельтаF508. Предмет и способы по настоящему изобретению, предпочтительно, применяются для репарации РНК пациентов с мутацией ΔF508 в белке трансмембранном регуляторе муковисцидоза (CFTR). Введение 5'-UUU-3' или 5'-CUU-3' вместо трех удаленных (делетированных) нуклеотидов дает исправленную РНК, которая восстанавливает отсутствующую аминокислоту фенилаланин (F или Phe) в белковой последовательности и, следовательно, приводит к образованию белка дикого типа.

РНК CFTR AF508 может быть восстановлена, например, посредством контактирования с и/или трансфекции клеток, предпочтительно, клеток млекопитающих, более предпочтительно, человеческих клеток, in vitro или in vivo, олигонуклеотидом по изобретению.

Предпочтительный олигонуклеотид по изобретению является комплементарным последовательности, имеющей идентичность по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% нуклеотидам 16-30 и 34-48 последовательности SEQ ID NO: 6, а изменение в последовательности, предпочтительно, выбрано из 5'-UUU-3' и 5'-CUU-3', предпочтительно, 5'-CUU-3'. Более предпочтительный олигонуклеотид по изобретению представляет собой олигонуклеотид, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, предпочтительно, SEQ ID NO: 1; или олигонуклеотид, содержащий или состоящий из укороченного варианта SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, предпочтительно, SEQ ID NO: 1. В таком укороченном варианте отсутствует (удалено) несколько нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 нуклеотидов на 3' и/или 5' конце SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. Предпочтительный вариант олигонуклеотида по изобретению содержит нуклеотиды с 7 до 29 последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, предпочтительно, SEQ 15 ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1; 5'-AUCAUAGGAAACACCAAAGAUGAUAUUUUCUUU-3' (CAPS нуклеотиды, предпочтительно, означают РНК, модифицированную группой 2'-O-Ме).

SEQ ID NO: 3; 5'-AUCAUAGGAAACACCAAAAAUGAUAUUUUCUUU-3' (CAPS нуклеотиды, предпочтительно, означают РНК, модифицированную группой 2'-O-Ме).

Другой предпочтительный олигонуклеотид по изобретению включает олигонуклеотид, содержащий олигонуклеотид или состоящий из олигонуклеотида с последовательностью, выбранной из группы от SEQ ID NO: 16 до SEQ ID NO: 24, или олигонуклеотид, содержащий укороченный вариант или состоящий из укороченного варианта олигонуклеотида с последовательностью, выбранной из группы от SEQ ID NO: 16 до SEQ ID NO: 24. В таком укороченном варианте отсутствует (удалено) несколько нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 нуклеотидов на 3' и/или 5' конце последовательностей от SEQ ID NO: 16 до SEQ ID NO: 24. Такие олигонуклеотиды удобно применять для осуществления изменений в последовательности молекулы целевой РНК, например, посредством мутации сдвига рамки-инсерции 1 или 2 пар оснований в удаляемый кодон для фенилаланина (для иллюстрации), инсерции в рамке считывания нуклеозидного триплета, образующего кодон для фенилаланина в аминокислотном положении 508 белка CFTR, инсерции в рамке считывания нуклеозидного триплета, образующего кодон для лейцина в аминокислотном положении 508 или другом аминокислотном положении белка CFTR, или для вставки стоп-кодона в последовательность, кодирующую CFTR. Способ действия этих приведенных в качестве примера олигонуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 16-24 показан на Фиг. 7b-8f.

Предпочтительно, в олигонуклеотиде по изобретению несколько, а именно, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов содержат модификацию, описанную выше, или комбинации модификаций, причем предпочтительными являются 2'-O-Ме-модифицированные нуклеотиды. Можно также добавлять к последовательностям другие описанные ранее признаки, повышающие устойчивость, такие как LNA (ЗНК)- или PNA (ПНК)-нуклеотиды или фосфоротиоатные связи между некоторыми или всеми нуклеотидами. Или же вместо РНК-нуклеотидов можно использовать ДНК-нуклеотиды. В одной антисмысловой молекуле могут комбинироваться все или некоторые описанные модификации.

Вышеописанные модификации могли бы усилить всасывание в эпителиальных клетках. Или же молекулу можно сделать короче посредством удаления нескольких, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12 нуклеотидов на 3' и/или 5' конце для усиления всасывания в клетки.

Для применения in vivo олигонуклеотид по изобретению может быть заключен для доставки (введения) в липосому, полисому (полирибосому) или наночастицу или другую подходящую частицу, такую как вирусная частица. Или же в комбинации с носителями молекулы для репарации могут находится в комплексе с полиэтиленимином (ПЭИ, PEI) и/или полиэтиленгликолем (ПЭГ, PEG). Олигонуклеотиды по изобретению можно синтезировать внутри клетки, даже in vivo, например, заражая клетки вирусом или вирусоподобной частицей, кодирующей олигонуклеотид. Или же живые клетки можно трансфецировать - in vitro или in vivo - с помощью (вирусной) ДНК или плазмиды и т.п. После заражения (инфицирования) или трансфекции живой клетки олигонуклеотид по изобретению синтезируется внутри живой клетки посредством обычной транскрипции и/или репликации.

Таким образом, олигонуклеотид по изобретению можно доставлять, как таковой, непосредственно в клетку, ткань или орган многоклеточного организма. Олигонуклеотид по изобретению можно также вводить опосредованно любым подходящим способом, известным из уровня техники. Олигонуклеотид по изобретению можно доставлять, например, в клетку, ткань или орган многоклеточного организма в виде вектора или экспрессионного вектора, при этом вектор или экспрессионный вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую олигонуклеотид. Предпочтительно, экспрессионный вектор вводится в клетку, ткань или орган многоклеточного организма с применением носителя для доставки генов. Согласно одному варианту в изобретении предусматривается вирусный вектор, содержащий экспрессионную кассету (кассету экспрессии) или транскрипционную кассету, которая управляет экспрессией или транскрипцией олигонуклеотида по изобретению. Предпочтительным носителем для доставки является вирусный вектор, такой как аденоассоциированный вирусный вектор (AAV), или ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор и т.п.

Один вариант изобретения относится к применению вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по определению выше, причем этот вектор применим для генной терапии. Векторы, которые применимы для генной терапии, описаны в статьях Anderson 1998, Nature 392: 25-30; Walther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71; Kay et al, 2001, Nat. Med. 7: 33-40; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-604; Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6; Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53; Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16; Marin et al, 1997, Mol. Med. Today 3: 396 - 15 403; Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7; Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64; Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3; и цитируемых в них ссылочных материалах.

Вектор, особенно подходящий для генной терапии, включает аденовирусный и аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор. Эти векторы заражают большое число типов пролиферирующих и не пролиферирующих клеток. Помимо этого, аденовирусные векторы обладают способностью к высокоуровневой экспрессии трансгенов. Однако, ввиду эписом(аль)ного характера аденовирусных и AAV векторов после входа в клетку эти вирусные векторы лучше всего подходят для терапевтического применения, требующего только транзиторной экспрессии трансгена (Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604; Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43), указанной выше. Предпочтительные аденовирусные векторы модифицируют с целью уменьшить реакцию организма, обсуждаемую в обзоре Russell (2000, см. выше).

Предпочтительным ретровирусным вектором для применения по настоящему изобретению является экспрессионная конструкция на основе лентивируса. Лентивирусные векторы обладают уникальной способностью заражать не пролиферирующие клетки (Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6). Способы создания и применения экспрессионных конструкций на основе лентивируса описаны в патентах США №№6,165,782, 6,207,455, 6,218,181, 6,277,633 и 6,323,031 и в статьях Federico (1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53) и Vigna et al. (2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16).

Обычно векторы для генной терапии рассматриваются как экспрессионные векторы, описанные выше, в том смысле, что они содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую экспрессирующийся олигонуклеотид по изобретению, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с соответствующими регуляторными последовательностями. Такая регуляторная последовательность содержит по меньшей мере промоторную последовательность. Подходящие промоторы для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующие полипептид из векторов для генной терапии, включают, например, промежуточный промотор ранних генов цитомегаловируса (CMV), промоторы длинных концевых повторов (LTRs) вируса, например, такие как ранний промотор длинных концевых повторов вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV), вируса саркомы Рауса или HTLV-1, вируса зеленой мартышки 40 (SV 40) и тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса.

Многие лекарственные средства для введения в легкие можно вводить через дыхательные пути. Одно такое лекарственное средство могло бы содержать молекулу для РНК-репарации, например, олигонуклеотид по изобретению. Для доставки олигонуклеотида по изобретению в аэрозоле в эпителиальные клетки дыхательных путей, предпочтительно, применяют ингалятор. Или же можно применять композицию для ингаляции в сухом порошке. Применение одноцепочечных (однонитевых) олигонуклеотидов по изобретению в системе доставки в дыхательные пути уменьшает вероятность разрыва молекулы за счет усилия сдвига при введении.

При многих заболеваниях повышается вязкость слизистого слоя, что приводит к уменьшению всасывания лекарственных средств через легкие. Одним таким заболеванием является хронический бронхит, другим примером такого заболевания является муковисцидоз. Имеются различные формы нормализаторов слизи, такие как ДНКазы, гипертонический солевой раствор или маннит, который продается под названием Бронхитол/Bronchitol. Когда нормализаторы слизи применяются в комбинации с соединениями для репарации РНК, такими как олигонуклеотиды по изобретению, они могут повышать эффективность таких лекарственных средств. Следовательно, введение олигонуклеотида по изобретению субъекту, предпочтительно человеку, предпочтительно объединяется с нормализаторами слизи, предпочтительно с нормализаторами слизи, описанными в настоящей заявке. Помимо этого, введение олигонуклеотидов по изобретению можно комбинировать с введением малой молекулы для лечения CF, такого как усилители (действия), например Калидеко/Kalydeco (ивакафтор/ivacaftor; VX-770), корректирующие соединения, например VX-809 (лумакафтор/Lumacaftor) и/или VX-661.

С целью эффективной доставки молекул для РНК репарации в эпителиальные клетки, например, легкого или кишечника, в качестве альтернативы или в комбинации с нормализаторами слизи можно осуществлять доставку в слизь проникающих частиц или наночастиц. Соответственно, при введении олигонуклеотида по настоящему изобретению субъекту, предпочтительно, человеку, применяют, предпочтительно, доставку в слизь проникающих частиц или наночастиц.

Хронические и острые легочные инфекции часто обнаруживаются у пациентов с такими заболеваниями, как муковисцидоз. Лечение антибиотиками уменьшает бактериальные инфекции и ослабляет их симптомы, такие как повышение вязкости слизи и/или образование биопленки. Применение антибиотиков в комплексе с молекулами РНК-репарации могло бы повысить эффективность репарации РНК благодаря более легкому доступу молекул для репарации к клеткам-мишеням. Поэтому введение олигонуклеотида по изобретению субъекту, предпочтительно, человеку, предпочтительно, комбинируют с лечением антибиотиками для уменьшения бактериальных инфекций и ослабления их симптомов, таких как повышение вязкости слизи и/или образование биопленки. Антибиотики можно применять системно или локально, или и тем и другим способом.

Например, для применения у больных муковисцидозом олигонуклеотиды по изобретению, или упакованные олигонуклеотиды или находящиеся в комплексе олигонуклеотиды по изобретению можно комбинировать с нормализаторами слизи, такими как ДНКаза, маннит или гипертонический солевой раствор, и/или антибиотиками и/или малой молекулой для лечения CF, таким как усилители (действия), например, Калидеко (ивакафтор; VX-770), или корректирующими соединениями, например VX-809 (лумакафтор) и/или VX-661.

С целью облегчения доступа к клеткам-мишеням для промывания легких перед введением олигонуклеотидов по изобретению можно применять бронхоальвеолярный лаваж (BAL).

Для доставки олигонуклеотидов по изобретению к эпителиальным клеткам кишечника можно применять капсулу с замедленным высвобождением (англ. термин «time-release capcule»). Репарация CFTR в этих клетках могла бы повысить всасывание питательных веществ. Это лечение можно комбинировать с применением препаратов панкреатических ферментов биологического или синтетического происхождения, таких как Панкрелипаза или Креон/Creon, которые имеются в продаже и обычно применяются для того, чтобы способствовать пищеварению у CF пациентов.

Согласно всем вариантам настоящего изобретения олигонуклеотиды по изобретению могут находиться в композиции с гипертоническим солевым раствором, т.е. в композиции, содержащей олигонуклеотид по изобретению, а также содержащей 2%-9% солевого раствора, предпочтительно, 3%-8% солевого раствора, более предпочтительно, 4%-8% солевого раствора, более предпочтительно, 5%-8% солевого раствора, более предпочтительно, 6%-8% солевого раствора (например, 6.1%, 6.2%, 6.3%, 6.4%, 6.5%, 6.6%, 6.7%, 6.8%, 6.9%, 7.0%, 7.1%, 7.2%, 7.3%, 7.4%, 7.5%, 7.6%, 7.7%, 7.8%, 7.9% или 8.0%)), более предпочтительно, 6%-7% солевого раствора, еще более предпочтительно, около 7% солевого раствора, наиболее предпочтительно, 7% солевого раствора. Процентное содержание солевого раствора в данном контексте определяется как вес солевого раствора/общий объем композиции, т.е. 7% солевого раствора соответствует 70 граммам солевого раствора/литр композиции. Предпочтительно, гипертонической солевой раствор по существу представляет собой раствор NaCl.

Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения олигонуклеотид и/или композицию по изобретению можно вводить любым способом, известным специалисту в данной области техники, включая, но без ограничения, введение в легкие, предпочтительно, через (верхние) дыхательные пути, и системное введение, предпочтительно, внутривенное, внутримышечное, интрадермальное или подкожное введение.

Специалист в данной области техники поймет, что описанные выше в данной заявке способы доставки, носители и комбинации для введения можно также комбинировать в способах и при применении согласно настоящему изобретению, например, олигонуклеотид по настоящему изобретению и/или композиция, содержащая такой олигонуклеотид, может находится в комплексе с соединением для доставки по настоящей заявке, может быть упакован(а) (заключена) в носитель для доставки по настоящей заявке и/или может быть упакован(а) в капсулу с замедленным высвобождением.

Предпочтительным способом доставки является доставка в форме вирусной частицы или последовательности вирусной нуклеиновой кислоты, кодирующей олигонуклеотид по изобретению, причем этот олигонуклеотид экспрессируется в результате инфицирования живой клетки вирусной частицей или трансфекции живой клетки при использовании вирусной нуклеиновой кислоты; предпочтительно, как описано ранее в настоящей заявке.

Доставку олигонуклеотида по настоящему изобретению можно осуществлять в легкое, предпочтительно, через (верхние) дыхательные пути, и/или в кишечник. Введение можно сочетать