Способы и композиции, содержащие варианты сериновой протеазы

Способы и композиции, содержащие варианты сериновой протеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к потребительским товарам, содержащим вариант сериновой протеазы. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вариант сериновой протеазы, имеющий одну или более замен по сравнению со стандартной сериновой протеазой. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения и применения таких потребительских товаров. Протеаза может быть вариантом субтилизина.

Уровень техники

Хотя протеазы, как известно, обеспечивают хорошую чистку пятен (таких как кровь), представляемые рациональное использование природных ресурсов и потребительские предпочтения к более низким температурам стирки, предъявляют требования к моющим средствам, чтобы предоставить потребителю приемлемые преимущества, которые непрерывно растут, и остается потребность в обеспечении композиций, которые обеспечивают очистку и свежесть. Несмотря на то, что сериновые протеазы давно известны из уровня техники промышленных ферментов, остается потребность в сконструированных протеазах, которые являются приемлемыми для конкретных условий и применений, и изобретатели обнаружили, что они могут быть полезными в создании композиций для эффективной очистки и/или обработки, в которых постоянно растет потребность.

Сущность изобретения

В одном варианте осуществления настоящее изобретение включает композицию для очистки и/или обработки, содержащую выделенный вариант субтилизина, при этом упомянутый вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, имеющую протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен в положениях, выбранных из Списков 1-19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, показанной в SEQ ID NO: 1; и вспомогательное вещество.

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение включает композицию для очистки и/или обработки, содержащую выделенный вариант субтилизина Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы, в котором упомянутая Bacillus lentus субтилизин GG36 протеаза имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, и причем упомянутый вариант субтилизина имеет, по меньшей мере, 80% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2, и имеет протеолитическую активность, и содержит аминокислотную последовательность, содержащую комбинацию аминокислотных замен, выбранных из Списков 1-19, и при этом аминокислотные положения варианта субтилизина пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens, показанной в SEQ ID NO: 1; и вспомогательное вещество.

В каждом варианте осуществления, перечисленном выше, вариант может демонстрировать улучшенную очистку по сравнению с GG36 протеазой, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает любой из перечисленных выше вариантов, при этом общий суммарный заряд варианта составляет 0, +1, +2, +3, +4, +5, -1, -2, -3, -4 или -5 относительно общего суммарного заряда Bacillus lentus субтилизин GG36 протеазы.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает композиции, имеющие, по меньшей мере, один из вариантов, перечисленных выше, при этом упомянутая композиция представляет собой продукт по уходу за тканью и домом.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает способ получения композиции, как описано выше, включающий стадии, на которых получают, по меньшей мере, один из вариантов, перечисленных выше, и смешивают его со вспомогательным веществом или их смесью.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает способ обработки поверхности, в частности ткани, который включает стадию, на которой вводят в контакт поверхность с водным раствором, содержащим, по меньшей мере, один из вариантов, перечисленных выше, и вспомогательное вещество.

Краткое описание перечня последовательностей

ФИГ. 1 представляет выравнивание зрелых стандартных протеаз, включая: BPN' (SEQ ID NO: 1) и GG36 (SEQ ID NO: 2). Положение каждой аминокислоты каждого варианта протеазы, более конкретно вариантов субтилизина, описанных в данной заявке, включая каждый вариант протеазы холодной воды, нумеруется в соответствии с нумерацией соответствующего положения аминокислоты в аминокислотной последовательности протеазы субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 1), как показано на ФИГ. 1, как определено путем выравнивания аминокислотной последовательности варианта протеазы с аминокислотной последовательностью протеазы субтилизина BPN' Bacillus amyloliquefaciens. Таким образом, если в данной заявке не указано другое, то положения замен приведены по отношению к BPN'.

Подробное описание изобретения

Определения

Если не указано другое, получение с соответствии с настоящим изобретением включает традиционные способы, которые обычно используют в молекулярной биологии, белковой инженерии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, которые известны специалисту в данной области техники. Такие способы известны специалисту в данной области техники и описаны во многих учебниках и справочных работах, хорошо известных специалисту в данной области техники. Все патенты, заявки на патенты, статьи и публикации, упомянутые в данной заявке, как выше, так и ниже, таким образом, точно включены в данную заявку путем ссылки.

Если в данной заявке не указано другое, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. Специалисту в данной области техники известно много технических терминологий. Несмотря на то, что некоторые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в данной заявке, находят использование в получении в соответствии с настоящим изобретением, некоторые приемлемые способы и материалы описаны в данной заявке. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно описываются со ссылкой на описание в целом. Кроме того, как используется в данной заявке, единственное число включает множественное число, если в контексте явно не указано другое. Числовые диапазоны включают в себя числа, которые определяют диапазон. Если не указано другое, нуклеиновые кислоты записываются слева направо от 5' к 3' ориентации; аминокислотные последовательности записываются слева направо от амино к карбокси ориентации, соответственно. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными методологией, протоколами и реагентами, так как они могут изменяться в зависимости от контекста, в котором они используются специалистом в данной области техники.

Получение в соответствии с настоящим изобретением использует, если не указано другое, традиционные методики очистки белков, молекулярной биологии, микробиологии, методики рекомбинантной ДНК и секвенирования белка, все из которых находятся в пределах компетентности специалиста в данной области техники.

Кроме того, заголовки, предусмотренные в данной заявке, не ограничиваются различными аспектами или вариантами осуществления изобретения, которые могут быть включены путем ссылки на описание в целом. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно определены путем ссылки на описание в целом. Тем не менее, для того, чтобы облегчить понимание изобретения, ниже определен ряд терминов.

Как используется в данной заявке, термины «протеаза» и «протеиназа» относятся к ферментному белку, который имеет способность к разрушению других белков. Протеаза имеет способность к проведению «протеолиза», который начинает катаболизм белка за счет гидролиза пептидных связей, которые связывают аминокислоты вместе в пептидную или полипептидную цепь, образуя белок. Данная активность протеазы, как белок-переваривающего фермента, называется «протеолитической активностью». Существует много хорошо известных методик для оценки протеолитической активности (см., например, Kalisz, «Microbial Proteinases», In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, (1988)). Например, протеолитическая активность может быть установлена путем сравнительных анализов, которые анализируют соответствующую способность протеазы гидролизовать коммерческий субстрат. Характерные субстраты, пригодные для анализа протеазы или протеолитической активности, включают, но не ограничиваются этим, диметилказеин (Sigma С-9801), бычий коллаген (Sigma С-9879), бычий эластин (Sigma Е-1625) и бычий кератин (ICN Biomedical 902111). Колориметрические анализы с использованием данных субстратов хорошо известны из уровня техники (см., например, WO 99/34011 и патент США No. 6,376,450, оба из которых включены в данную заявку путем ссылки). Также используется анализ pNA (см., например, Del Mar et al, Anal. Biochem. 99:316-320 [1979]) для определения концентрации активного фермента для фракций, собранных в ходе градиентного элюирования. В этом анализе измеряется скорость, с которой высвобождается п-нитроанилин по мере гидролиза ферментом растворимого синтетического субстрата, сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-п-нитроанилид (suc-AAPF-pNA). Скорость образования желтого цвета при реакции гидролиза измеряют при 410 нм на спектрофотометре, и она пропорциональна концентрации активного фермента. Кроме того, измерения оптической плотности при 280 нанометрах (нм) может быть использовано для определения общей концентрации белка. Соотношение активный фермент/общий белок определяет чистоту фермента.

Как используется в данной заявке, термин «субтилизин» относится к любому члену из семейства S8 сериновых протеаз, как описано в MEROPS - базе данных пептидаз (см., Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucl Acids Res, 34 Database issue, D270-272 [2006]). Как описано в том документе, семейство пептидазы S8 включает сериновый эндопептидазный субтилизин и его гомологи (Rawlings and Barrett, Biochem J., 290:205-218, [1993]). Семейство S8, кроме того, известное как семейство субтилазы, является вторым наибольшим семейством сериновых пептидаз. На данный момент определены третичные структуры для некоторых членов семейства S8. Типичная S8 белковая структура состоит из трех слоев с семью скрученными β листами, состоящими из перемежающихся слоев между двумя слоями спиралей. Субтилизин (S08.001) представляет собой типичную структуру для группы SB (SB). Несмотря на различную структуру, активные сайты субтилизина и химотрипсина (S01.001) могут перекрываться, что предполагает сходство, которое является результатом конвергентной эволюции больше, чем дивергентной эволюции.

Как используется в данной заявке, термины «протеазный вариант», «вариантная протеаза», «вариантная сериновая протеаза», «сериновый протеазный вариант», «вариант субтилизина», «мутантная протеаза» используются по отношению к протеазам, которые являются подобными стандартной протеазе (которая может быть субтилизиновой протеазой дикого типа), особенно в их функции, но имеют мутации в своей аминокислотной последовательности, что делает их отличными в последовательности от протеазы дикого типа или любой исходной стандартной протеазы (то есть, «родительской» протеазы), из которой получают вариант протеазы. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает «GG36 варианты» (или «GG36 варианты субтилизинов»), в которых мутации присутствуют в зрелой GG36 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Однако, это не означает, что стандартная протеаза ограничивается любой конкретной аминокислотной последовательностью. Кроме того, имеется в виду, что термин охватывает варианты родительской протеазы, в которых последовательность родительской протеазы является, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

Как используется в данной заявке, термин «вариант протеазы холодной воды» означает вариант протеазы, более конкретно варианты субтилизинов родительской протеазы, в котором В. lentus субтилизин GG36 протеаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, при этом упомянутый вариант протеазы, более конкретно варианты субтилизинов имеют одну или больше из следующих характеристик: а) индекс эффективности способа тестирования 2, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; b) индекс эффективности способа тестирования 3, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8, или даже от 1,1 до приблизительно 5; с) индекс эффективности способа тестирования 4, по меньшей мере, 1,0, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или d) индекс эффективности способа тестирования 6, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1,0 до приблизительно 8, или даже от 1,0 до приблизительно 5; и/или е) индекс эффективности способа тестирования 7, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,1 до приблизительно 15, от 1,1 до приблизительно 10, или даже от 1,1 до приблизительно 7. Способ тестирования 2, способ тестирования 3, способ тестирования 4, способ тестирования 6 и способ тестирования 7 подробно описаны ниже в разделе Примера 1, озаглавленном «Способы тестирования». Кроме того, подразумевается, что термин охватывает варианты родительской протеазы, при этом последовательность родительской протеазы является, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, родительская протеаза варианта протеазы (то есть, «стандартная» или «исходная» протеаза) является коммерчески доступной протеазой, включая, но не ограничиваясь протеазами, продаваемыми под торговыми названиями SAVINASE®, POLARZYME®, KANNASE®, LIQUINASE®, LIQUINASE ULTRA®, SAVINASE ULTRA®, OVOZYME®, (от Novozymes A/S); MAXACAL®, PROPERASE®, PURAFECT®, FN3®, FN4® и PURAFECT ОХР®, PURAFAST™, PURAFECT® PRIME, PURAMAX® (от Danisco US, Genencor Division); и те, которые доступны от Henkel/Kemira, а именно BLAP (последовательность, показанная на фигуре 29 US 5,352,604 со следующими мутациями S99D+S101R+S103A+V104I+G159S, в дальнейшем именуемые в данной заявке как BLAP) и BLAP X (BLAP с S3T+V4I+V205I).

Как используется в данной заявке, термин «вариантный полипептид» относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая отличается, по меньшей мере, на один аминокислотный остаток от аминокислотной последовательности родительского или стандартного полипептида (включая, но не ограничиваясь приведенным, полипептиды дикого типа).

Как используется в данной заявке, «род Васillus» включает все виды рода «Bacillus,» как известно специалисту в данной области техники, включая, но, не ограничиваясь приведенным, В. subtilis, В. licheniformis, В. lentus, В. brevis, В. stearothermophilus, В. alkalophilus, В. amyloliquefaciens, В. clausii, В. halodurans, В. megaterium, В. coagulans, В. circulans, В. lautus и В. thuringiensis. Является общепризнанным, что род Bacillus продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые реклассифицированы, включая, но не ограничиваясь приведенным, такие организмы, как В. stearothermophilus, которые в настоящее время называют «Geobacillus stearothermophilus». Продуцирование устойчивых эндоспор в присутствии кислорода считается определяющим признаком рода Bacillus, хотя данную характеристику, кроме того, применяют к недавно получившим название Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus.

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота», которые взаимозаменяемо используются в данной заявке, относятся к полимеру любой длины из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепь. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), полинуклеотид, содержащий дезоксирибонуклеотиды, и РНК (рибонуклеиновая кислота), полимер из рибонуклеотидов, представляют собой примеры полинуклеотидов или нуклеиновых кислот, которые имеют отличающуюся биологическую функцию. Полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают, но не ограничиваются приведенным, одно-, дву- или три-нитевую ДНК, геномный ДНК, кДНК, РНК, ДНК-РНК гибрид или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные или производные нуклеотидные основания. Ниже представлены неограничивающие примеры полинуклеотидов: гены, фрагменты генов, хромосомные фрагменты, маркер(ы) экспрессированной последовательности (EST), экзоны, интроны, информационная РНК (иРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомальная РНК (рРНК), рибозимы, комплементарная ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенные ДНК любой последовательности, выделенные РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды содержат модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибоза и тиоат, и нуклеотидные разветвления. В конкретном варианте осуществления, последовательность нуклеотидов прерывается ненуклеотидными компонентами.

Как используется в данной заявке, термин «мутация» относится к изменениям, сделанным в исходной последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты. Подразумевается, что термин охватывает замены, вставки и делеции.

Как используется в данной заявке, термин «вектор» относится к конструкции нуклеиновой кислоты или полинуклеотидной конструкции, используемой для введения или переноса нуклеиновой(ых) кислоты или полинуклеотида(ов) в клетку-мишень или ткань. Вектор, как правило, используют для введения чужой ДНК в другую клетку или ткань. Вектор, в основном, содержит последовательность ДНК, которая является трансгенной и большей полинуклеотидной последовательностью, которая служит в качестве «скелета» вектора. Вектор, как правило, служит для переносов генетической информации, такой как вставочный трансген, в клетку-мишень или ткань для того, чтобы выделить, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени или ткани. Векторы включают плазмиды, клонирующие векторы, бактериофаги, вирусы (например, вирусный вектор), космиды, экспрессирующие векторы, шаттл-векторы, кассеты и тому подобное. Вектор, как правило, включает точку начала репликации, сайт множественного клонирования и селектируемый маркер. Процесс включения вектора в клетку-мишень, как правило, называют как трансфекция. Трансфекцию клетки вирусным вектором, как правило, называют как трансдукция. Настоящее изобретение включает, в некоторых вариантах осуществления, вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую вариант протеазы (например, предшественника или зрелый вариант протеазы), которая функционально связана с приемлемой пропоследовательностью (например, секреторной, сигнальной пептидной последовательностью, т.д.), способной осуществлять экспрессию последовательности ДНК в подходящем хозяине.

Как используется в данной заявке, термин «экспрессионная кассета», «экспрессионный плазмид» или «экспрессионный вектор» относится к конструкции нуклеиновой кислоты или вектору, образованному рекомбинантно или синтетически, для экспрессии интересующей нуклеиновой кислоты (например, чужой нуклеиновой кислоты или трансгена) в клетке-мишени. Нуклеиновая кислота, представляющая интерес, как правило, экспрессирует представляющий интерес белок. Экспрессионный вектор или экспрессионная кассета, как правило, содержит промотор нуклеотидной последовательности, который управляет или способствует экспрессии чужой нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор или кассета, кроме того, как правило, включает любые другие специфические элементы нуклеиновой кислоты, которые разрешают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантная экспрессионная кассета может быть включена в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Некоторые экспрессионные вектора имеют способность включать и экспрессировать гетерологичные фрагменты ДНК в клетке-хозяине. Многие прокариотические и эукариотические экспрессионные векторы являются коммерчески доступными. Выбор соответствующих векторов экспрессии находится в пределах знаний специалистов в данной области техники. Выбор соответствующих векторов экспрессии для экспрессии белка из последовательности нуклеиновой кислоты, включенной в вектор экспрессии, находится в пределах знаний специалистов в данной области техники.

Конструкция ДНК представляет собой искусственно сконструированный сегмент нуклеиновой кислоты, который может быть введен в клетку-мишень или ткань. Конструкция ДНК обычно содержит вставку ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, который был субклонирон в вектор. Вектор может содержать бактериальные резистентные гены для роста в бактериях и промотор для экспрессии представляющего интерес белка в организме. ДНК может быть сгенерирована in vitro посредством ПЦР или любого другого подходящего способа(ов), известного(ых) в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления, конструкция ДНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет интерес. В некоторых вариантах осуществления, последовательность функционально связана с дополнительными элементами, такими как элементы контроля (например, промоторы и т.д.). Конструкция ДНК может дополнительно содержать селектируемый маркер и может дополнительно содержать вводимую последовательность, фланкированную гомологичными фрагментами. Конструкция может содержать другие негомологичные последовательности, добавленные к концам (например, спейсерные последовательности или фланкирующие). В некоторых вариантах осуществления, концы последовательности замкнуты так, что конструкция ДНК образует замкнутый круг. Последовательность представляющей интерес нуклеиновой кислоты, которая включена в конструкцию ДНК, используя способы, хорошо известные в данной области техники, может быть мутантной или модифицированной нуклеиновой кислотой дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, конструкция ДНК содержит одну или больше последовательностей нуклеиновых кислот, гомологичных хромосоме клетки-хозяина. В других вариантах осуществления, конструкция ДНК содержит одну или больше негомологичных нуклеотидных последовательностей. После сборки конструкции ДНК in vitro, ее можно использовать, например, для: 1) встраивания гетерологичных последовательностей в желаемую последовательность-мишень клетки-хозяина; и/или 2) осуществления мутагенеза участка хромосомы клетки-хозяина (то есть, замены эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью); 3) удаления генов-мишеней; и/или 4) введения заменяющей плазмиды в хозяина. «ДНК конструкция» в данной заявке используется взаимозаменяемо с «экспрессионной кассетой».

Как используется в данной заявке, термин «плазмида» относится к внехромосомной молекуле ДНК, которая является способной к репликации независимо от хромосомной ДНК. Плазмида является двухцепочечной (ds) и может быть круглой, и, как правило, используется в качестве клонирующего вектора.

Как используется в данной заявке в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, термин «введенный» относится к любому способу приемлемому для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают, но не ограничиваются приведенным, слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, электропорацию, конъюгацию и трансдукцию (см., например, Ferrari et al, «Genetics,» in Hardwood et al. (eds.), Bacillus. Plenum Publishing Corp., pp. 57-72 [1989]).

Трансформация относится к генетической альтерации клетки, которая возникает в результате поглощения, геномного включения и экспрессии генетического материала (например, ДНК).

Как используется в данной заявке, нуклеиновая кислота является «функционально связанной» с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер является функционально связанным с нуклеотидом, кодирующим последовательность, если промотор влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Сайт связывания рибосом может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчить трансляцию кодирующей последовательности. Как правило, «функционально связанные» последовательности ДНК являются смежными. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, могут быть использованы синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с традиционной практикой.

Как используется в данной заявке, термин «ген» относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает участки предшествующие кодирующим областям и следующие после них, а также к встроенным последовательностям (интронам) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Как используется в данной заявке, термин «рекомбинантный», при использовании со ссылкой на клетку, как правило, указывает, что клетка была модифицирована путем введения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты или что клетка происходит из клетки, модифицированной таким образом. Например, рекомбинантная клетка может содержать ген, не найденный в идентичной форме в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или рекомбинантная клетка может содержать нативный ген (найденный в нативной форме клетки), но который был модифицирован и повторно введен в клетку. Рекомбинантная клетка может содержать нуклеиновую кислоту, эндогенную к клетке, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты из клетки; такие модификации включают те, которые получены путем замещения гена, сайт-специфических мутаций, и соответствующих способов, известных специалисту в данной области техники. Технология рекомбинантной ДНК включает способы продуцирования рекомбинантной ДНК in vitro и переноса рекомбинантной ДНК в клетки, где она может быть экспрессирована или размножена, таким образом получая рекомбинантный полипептид. «Рекомбинация», «рекомбинирование» и получение «рекомбинированных» полинуклеотидов или нуклеиновых кислот, как правило, означает соединение или комбинирование двух или более нуклеиновых кислот или полинуклеотидных нитей или фрагментов с созданием нового полинуклеотида или нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный полинуклеотид или нуклеиновая кислота иногда называются химерой. Нуклеиновая кислота или полипептид является «рекомбинантным», когда он является искусственным или сконструированным, или полученным из искусственного или сконструированного белка или нуклеиновой кислоты.

Как используется в данной заявке, термин «амплификация» нуклеиновой кислоты или гена относится к процессу, при котором специфические последовательности ДНК являются непропорционально реплицированными, таким образом, что амплифицированная нуклеиновая кислота или ген становится присутствующим в более высоком количестве копий, чем первоначально присутствовало в геноме. В некоторых вариантах осуществления, селекция клеток посредством роста в присутствии лекарственного средства {например, ингибитора ингибируемого фермента) в результате приводит к амплификации либо эндогенного гена, кодирующего генный продукт необходимый для роста в присутствии лекарственного средства, либо амплификации экзогенных (то есть, вводимых) последовательностей, кодирующих данную нуклеиновую кислоту или генный продукт, или оба.

«Амплификация» является частным случаем репликации нуклеиновой кислоты с использованием матрицы специфичности. Ее следует отличать от репликации с неспецифической матрицей (то есть, репликации, которая является матрица-зависимой, но не зависит от конкретной матрицы). Специфичность матрицы в данной заявке отличается от точности репликации (то есть, синтеза подходящей полинуклеотидной последовательность) и специфичности нуклеотида (рибо- или дезоксирибо-). Специфичность матрицы часто описывают в терминах специфичности «мишень». Последовательности-мишени представляют собой «мишени» в том смысле, что следует приложить усилия, чтобы их отсортировать от другой нуклеиновой кислоты. Способы амплификации, в первую очередь, разработаны для данной сортировки.

Как используется в данной заявке, термин «праймер» относится к олигонуклеотиду (полимеру из нуклеотидных остатков), либо встречающемуся в природе в виде очищенного рестриктазный фрагмент, либо полученному синтетически, который способен действовать как точка инициации синтеза при размещении в условиях, в которых инициируется синтез продукта удлинения праймера, который является комплементарным к нити нуклеиновой кислоты (то есть, в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при соответствующей температуре и рН). Праймер предпочтительно является однонитевым для максимальной эффективности в амплификации, но альтернативно может быть двунитевым. Если он является двунитевым, то праймер сначала обрабатывают, чтобы разделить его нити, перед его использованием для получения продуктов удлинения. В некоторых вариантах осуществления, праймер представляет собой олигодезоксирибонуклеотид. Праймер должен быть достаточно длинным, чтобы запустить синтез продуктов удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймера зависит от множества факторов, включая температуру, источник праймера и использование способа.

Как используется в данной заявке, термин «зонд» относится к олигонуклеотиду, либо встречающемуся в природе в виде очищенного рестриктазного фрагмента, либо полученного синтетически, рекомбинантно или путем ПЦР амплификации, который, как правило, способен гибридизироваться с другим олигонуклеотидом, представляющим интерес. Зонд может быть однонитевым или двунитевым. Зонды являются полезными для обнаружения, идентификации и выделения конкретных последовательностей гена. Предполагается, что любой зонд, использованный в настоящем изобретении, будет маркирован любой «репортерной группой», таким образом, что она может быть обнаружена в любой системе обнаружения, включая, но, не ограничиваясь приведенным, ферментные (например, ELISA, а также гистохимические анализы на основе ферментов), флуоресцентные, радиоактивные и люминесцентные системы. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной системой обнаружения или меткой.

Как используется в данной заявке, термин «мишень», при использовании по отношению к полимеразной цепной реакции, относится к участку нуклеиновой кислоты, связанному с праймерами, используемыми для полимеразной цепной реакции. Таким образом, прилагаются усилия, чтобы «мишень» отсортировать от других последовательностей нуклеиновой кислоты. Нуклеотидный «сегмент» представляет собой участок нуклеиновой кислоты в мишени-последовательности нуклеиновой кислоты.

Как используется в данной заявке, термин «полимеразная цепная реакция» (ПЦР) относится к способам из патентов США №4,683,195 4,683,202 и 4,965,188, включенных в данную заявку путем ссылки, которые включают способы увеличения концентрации сегмента мишени-последовательности в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Данный процесс амплифилирования мишени-последовательности хорошо известен в данной области техники.

Как используется в данной заявке, термин «реагенты амплификации» относится к тем реагентам (например, трифосфатам дезоксирибонуклеотида, буферу и т.д.), которые необходимы для амплификации, за исключением праймеров, матрицы нуклеиновой кислоты и фермента амплификации. Как правило, реагенты амплификации вместе с другими компонентами реакции помещают и содержат в реакционном сосуде (пробирке, микролунке и т.д.).

Как используется в данной заявке, термин «эндонуклеаза рестрикции» или «фермент рестрикции» относится к ферменту (например, бактериальному ферменту), который способен к резанию двунитевой или однонитевой ДНК в или вблизи конкретной последовательности нуклеотидов, известных как сайт рестрикции. Нуклеотидная последовательность, содержащая сайт рестрикции, распознается и расщепляется с помощью данной эндонуклеазы рестрикции или фермента рестрикции и часто является сайтом для встраивания ДНК фрагментов. Сайт рестрикции может быть сконструирован в вектор экспрессии или конструкцию ДНК.

«Гомологичная рекомбинация» относится к обмену ДНК фрагментов между двумя молекулами ДНК или парными хромосомами на сайте идентичных или близких к идентичным нуклеотидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, хромосомная интеграция является гомологичной рекомбинацией.

Нуклеиновая кислота или полинуклеотид, как упоминается, «кодирует» полипептид, если в его нативном состоянии или при обработке способами, известными специалисту в данной области техники, он может быть транскрибирован и/или транслирован, чтобы продуцировать полипептид или его фрагмент. Антисмысловая нить такой нуклеиновой кислоты также, как упоминается, кодирует последовательность.

Как известно из уровня техники, последовательность ДНК может быть транскрибирована с помощью РНК полимеразы, чтобы получить последовательность РНК, но последовательность РНК может быть обратно транскрибирована с помощью обратной транскриптазы, чтобы получить последовательность ДНК.

«Штамм-хозяин» или «клетка-хозяин» относится к подходящему хозяину для вектора экспрессии, содержащего последовательность ДНК, представляющую интерес. Представляющая интерес последовательность ДНК может экспрессировать представляющий интерес белок в штамме-хозяине или клетке-хозяине.

«Белок» или «полипептид» содержит полимерную последовательность аминокислотных остатков. Термины «белок» и «полипептид» используют взаимозаменяемо в данной заявке. Одно и 3-буквенный код для аминокислот, как определено в соответствии с IUРАС-IUВ объединенной комиссией по биохимической номенклатуре (Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)), используют по всей заявке. Однобуквенный X относится к любой из двадцати аминокислот. Кроме того, следует понимать, что полипептид может быть кодирован для более, чем одной нуклеотидной последовательности вследствие вырожденности генетического кода. Мутации названы однобуквенным кодом родительской аминокислоты, с последующими тремя или двумя числами цифровой позиции и затем однобуквенным кодом для вариантной аминокислоты. Например, мутирующий глицин (G) в положении 87 к серину (S) представляют как «G087S» или «G87S». Многократные мутации показывают путем вставки «-» между мутациями. Мутации в положениях 87 и 90 представляют как или «G087S-A090Y», или «G87S-A90Y», или «G87S+A90Y», ил