Клетки-хозяева и способы использования

Клетки-хозяева и способы использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области биохимической инженерии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к генетически модифицированным клеткам-хозяевам и способам получения в них полипептидов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терапевтические полипептиды и белки могут экспрессироваться в различных клетках-хозяевах, включая бактериальные клетки, клетки E.coli, клетки грибов или дрожжевые клетки, клетки микроорганизмов, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Грибковые хозяева, такие как метилотрофные дрожжи Pichia pastoris, имеют определенные преимущества в отношении терапевтических белков, например, они не секретируют большого количества эндогенных белков, они имеют сильный индуцируемый промотор, их можно выращивать на определенной химической среде, и они могут продуцировать рекомбинантные белки с высоким титром (Cregg et al., Mol. Biotech. 16:23-52 (2000)). И дрожжи и нитевидные грибы успешно используются для получения рекомбинантных белков, как внутриклеточно, так и в секретируемом виде (Cereghino, J. L. and J. M. Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45-66; Harkki, A., et al. 1989 Bio-Technology 7(6): 596; Berka, R. M., et al. 1992 Abstr. Papers Amer. Chem.Soc. 203: 121-BIOT; Svetina, M., et al. 2000 J. Biotechnol. 76(23): 245-251). S. cerevisiae представляют собой замечательные клетки-хозяева для экспрессии рекомбинантного сывороточного альбумина человека (HSA). Однако экспрессия других терапевтических полипептидов, включая полипептиды, генетически слитые с HSA, сталкивается с техническим препятствием в виде низкого титра рекомбинантных белков. Поэтому существует потребность в клетках-хозяевах, в частности штаммах S. cerevisiae , которые способны продуцировать гетерологичные пептиды, полипептиды и/или белки с высоким титром рекомбинантного белка.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящего изобретения предлагаются генетически модифицированные клетки-хозяева, содержащие по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий протеазу Killer Expression (Kex2p) или ее фрагмент и/или вариант, который имеет по меньшей мере одну функциональную активность Kex2p, и по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий протеин-дисульфидизомеразу (Pdi1) или ее фрагмент и/или вариант, который имеет по меньшей мере одну функциональную активность Pdi. Также в настоящем изобретении предложены генетически модифицированные клетки-хозяева, содержащие по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий протеазу Killer Expression (Kex2p) или ее фрагмент и/или вариант, который имеет по меньшей мере одну функциональную активность Kex2p, по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий протеин-дисульфидизомеразу (Pdi1) или ее фрагмент и/или вариант, который имеет по меньшей мере одну функциональную активность Pdi, и по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий оксидоредуктин эндоплазматического ретикулума (Ero1) или его фрагмент и/или вариант, который имеет по меньшей мере одну функциональную активность Ero1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к генетически модифицированным клеткам-хозяевам, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют по меньшей мере один генный продукт по меньшей мере одного выделенного полинуклеотида, кодирующего белок или его фрагмент и/или его вариант, который имеет по меньшей мере одну функциональную активность указанного белка, выбранного из: Kex2p, Pdi1 или Ero1, когда указанные генетически модифицированные клетки-хозяева выращиваются в культуре. Другой аспект настоящего изобретения предлагает генетически модифицированные клетки-хозяева, которые сверхэкспрессируют по меньшей мере два белка или их фрагмента и/или варианта, которые имеют по меньшей мере одну функциональную активность указанных по меньшей мере двух белков, выбранных из: Kex2p, Pdi1 или Ero1, когда указанные генетически модифицированные клетки-хозяева выращиваются в культуре, по сравнению с клеткой-хозяином дикого типа, причем указанная клетка-хозяин дикого типа относится к тому же виду и выращивается в таких же условиях культивирования, но не сверхэкспрессирует по меньшей мере два генных продукта, выбранных из Kex2p, Pdi1 и Ero1. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Примеры клеток-хозяев могут включать в себя, но не ограничиваются ими: HeLa, СНО, COS, HEK293, THPI, дрожжи и клетки насекомых. В конкретных вариантах осуществления изобретения клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте осуществления изобретения клеткой является клеточная линия CHO, клеточная линия НЕК 293 или клеточная линия ВНК.

Также в настоящем документе предложены способы получения рекомбинантного полипептида, включающие культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению. В другом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантным полипептидам, полученным способами по настоящему изобретению. Также в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантные полипептиды, изготовленные способами по настоящему изобретению. В другом аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения пациента, нуждающегося в этом, включающие введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Создание Предварительного главного клеточного банка штаммов-продуцентов альбиглютида. Стадии от ПЦР-продукта экспрессионной кассеты KEX2-KanMX до штамма-продуцента BXP10KEX2PDIERO1 представляют собой последовательное встраивание экспрессионных кассет для создания штамма-хозяина Процесса IV, BXP10_KEX2_PDI_ERO1. После трансформации плазмидой pCID3610 был отобран финальный штамм-продуцент и использован для изготовления предварительного главного клеточного банка (РСВ).

Фигура 2. Анализ методом Саузерн-блота PDI1 и KEX2 в штаммах-хозяевах. Эндогенные гены KEX2 и PDI1 расположены на хромосомах XIV и III, соответственно, в единственной копии (дикий тип). Планируемый участок встраивания на хромосоме XII изображен ниже дикого типа. Зонды для обнаружения каждого гена показаны в виде сплошного прямоугольника.

Фигура 3. Анализ методом Вестерн-блоттинга Pdi1 и Kex2p из штаммов-хозяев. Образцы нанесены в следующем порядке, дорожки 1-5: 5 клонов штамма BXP10-KEX2-PDI1; PDI: BXP10, сверхэкспрессирующий Pdi1; KEX2: BXP10, сверхэкспрессирующий Kex2p; и BXP10: штамм-хозяин в качестве контроля. Наносили равное количество белка.

Фигура 4. Электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле (электрофорез в ДСН-ПААГ) 12 образцов супернатанта после роста в планшете при встряхивании. Дорожки в геле: L: предварительно окрашенный белковый маркер SeeBlue2 (Invitrogen); RS. Эталон белка pCID3610; 1-12: 12 субклонов, экспрессирующих pCID3610.

Фигура 5. Анализ титра (А) и качества (В) белка pCID3610, получаемого ферментацией в DasGip. Получаемый титр в супернатанте и уровень 6-AA (в %) для белка pCID3610 сравнивали с BXP10-KEX2-PDI1 в качестве контроля, который представляет собой BXP10, сверхэкспрессирующий Kex2p и Pdi1.

Фигура 6. Кривые роста, полученные для клеток из ампулы Исследовательского клеточного банка.

Фигура 7. Кривые роста, полученные для клеток из Предварительного главного клеточного банка.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

«Клетка-хозяин (клетки-хозяева)» в контексте настоящего изобретения относится к клетке, в которую была введена (например, путем трансформации, инфекции или трансфекции) или в которую можно ввести (например, путем трансформации, инфекции или трансфекции) выделенную полинуклеотидную последовательность. Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут включать, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки микроорганизмов, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Клетки-хозяева по настоящему изобретению, имеющие свое происхождение от дрожжей и/или нитевидных грибов, могут включать, но не ограничиваются ими, следующие семейства, роды и виды: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichi salictaria, Pichia guercum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia sp., Saccharomyces castelii, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces cryophilus, Schizosaccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Candida sp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, Schwanniomyces occidentalis и Neurospora crassa.

«Трансформированный» в данной области представляет собой направленное изменение генома или эписомы организма путем введения внешней ДНК или РНК или любое другое стабильное введение внешней ДНК или РНК.

«Трансфицированный» в данной области представляет собой введение внешней ДНК или РНК в микроорганизм, включая, но не ограничиваясь ими, рекомбинантную ДНК или РНК.

«Идентичность» в данной области представляет собой связь между двумя или несколькими полипептидными последовательностями или двумя или несколькими полинуклеотидными последовательностями (в зависимости от обстоятельств), определенную путем сравнения последовательностей. В данной области «идентичность» также означает степень родства по последовательности между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями (в зависимости от обстоятельств), определенную путем сравнения цепей этих последовательностей. «Идентичность» может быть легко вычислена известными способами, включающими, но не ограниченными ими, описанные в (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; а также Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)). Способы определения идентичности разработаны, чтобы достигнуть наибольшего совпадения между исследуемыми последовательностями. Более того, способы определения идентичности входят в общедоступные компьютерные программы. Компьютерные программные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются ими, программный пакет GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)). Программа BLAST X общедоступна в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Также для определения идентичности может использоваться хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.

Параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают следующие:

Алгоритм: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970); Матрица сравнения: BLOSSUM62 от Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)

Штраф за разрыв: 12

Штраф за длину разрыва: 4

Программой с этими параметрами является общедоступная программа «gap» от Genetics Computer Group, Madison WI. Вышеуказанные параметры является параметрами «по умолчанию» для сравнения пептидов (вместе с отсутствием штрафа за окончание разрывов).

Параметры для сравнения полинуклеотидных последовательностей включают следующие: алгоритм: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Матрица сравнения: совпадения = +10, несовпадения = 0

Штраф за разрыв: 50

Штраф за длину разрыва 3

Доступны в программе «gap» от Genetics Computer Group, Madison WI. Они является параметрами «по умолчанию» для сравнения нуклеиновых кислот.

Смысл «идентичности» для полинуклеотидов и полипептидов, в зависимости от обстоятельств, приведен в пп.(1) и (2) ниже.

(1) Полинуклеотидные варианты осуществления дополнительно включают выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 или 100% идентичности с эталонной последовательностью, например, SEQ ID NO: 3, причем указанная полинуклеотидная последовательность может быть идентична эталонной последовательности SEQ ID NO: 3 или может включать в себя до некоторого целого числа нуклеотидных изменений по сравнению с эталонной последовательностью, где указанные изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной нуклеотидной делеции, замены, включая транзицию и трансверсию, или вставки, и где указанные изменения могут происходить в 5'- или 3'-концевых позициях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми позициями, расположенные либо индивидуально среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких непрерывных группах в эталонной последовательности, и где указанное число нуклеотидных изменений определяется умножением общего числа нуклеотидов в SEQ ID NO:3 на целое число, определяющее процент идентичности, деленное на 100, а затем вычитанием этого результата из указанного общего числа нуклеотидов в SEQ ID NO: 3, или:

n_n ≤ x_n - (x_n • y),

где n_n представляет собой число нуклеотидных изменений, x_n является общим числом нуклеотидов в SEQ ID NO:3, y является 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%, а • является символом для оператора умножения, и где любой нецелочисленный результат x_n и y округляется до ближайшего целого числа до вычитания его из x_n. Изменения полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, может создать нонсенс, миссенс или мутации со сдвигом рамки в этой кодирующей последовательности и тем самым изменять полипептид, кодируемый полинуклеотидом после таких изменений.

(2) Полипептидные варианты осуществления дополнительно включают выделенный полипептид, содержащий полипептид, имеющий по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 или 100% идентичности с эталонной последовательностью полипептида, например, SEQ ID NO: 1, причем указанная полипептидная последовательность может быть идентична эталонной последовательности или может включать в себя до некоторого целого числа аминокислотных изменений по сравнению с эталонной последовательностью, где указанные изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной аминокислотной делеции, замены, включая консервативную и неконсервативную замену, или вставки, и где указанные изменения могут происходить в амино- или карбокси-концевых позициях эталонной полипептидной последовательности или в любом месте между этими концевыми позициями, расположенные либо индивидуально среди аминокислот в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких непрерывных группах в эталонной последовательности, и где указанное число аминокислотных изменений определяется умножением общего числа аминокислот на целое число, определяющее процент идентичности, деленное на 100, а затем вычитанием этого результата из указанного общего числа аминокислот, или:

n_а ≤ x_a - (x_a • y),

где n_а представляет собой число аминокислотных изменений, x_а является общим числом аминокислот в последовательности, y является 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%, а • является символом для оператора умножения, и где любой нецелочисленный результат x_а и y округляется до ближайшего целого числа до вычитания его из x_а.

«Выделенный» означает измененный «руками человека» из своего природного состояния, то есть, если это происходит в природе, измененный или удаленный из своей исходной окружающей среды, или оба варианта. Например, полинуклеотид или полипептид, естественным образом присутствующий в живом организме, не является «выделенным», но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от сопутствующих в своем природном состоянии материалов, является «выделенным», включая, но не ограничиваясь этим, когда такой полинуклеотид или полипептид вводят обратно в клетку.

«Выделенными» или «по существу чистыми» нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом (например, РНК, ДНК или смешанный полимер) являются те, которые по существу отделены от других клеточных компонентов, естественным образом сопровождающих нативный полинуклеотид в его природной клетке-хозяине, например, рибосомы, полимеразы и геномные последовательности, с которыми он ассоциирован в природе. Термин охватывает нуклеиновую кислоту или полинуклеотид, которые (1) были удалены из своей природной среды, (2) не ассоциированы с целым полинуклеотидом или его участком, в котором «выделенный полинуклеотид» встречается в природе, (3) функционально связаны с полинуклеотидом, с которым они не связаны в природе, или (4) не встречаются в природе. Термин «выделенный» или «по существу чистый» также может использоваться по отношению к рекомбинантной или клонированной выделенной ДНК, химически синтезированным аналогам полинуклеотидов или полинуклеотидным аналогам, биологически синтезированным в гетерологичных системах.

Однако термин «выделенный» не требует обязательно, чтобы таким образом описанные нуклеиновая кислота или полинуклеотид сами по себе были физически удалены из своего природного окружения. Например, эндогенная последовательность нуклеиновой кислоты в геноме организма считается «выделенной» в данном описании, если гетерологичная последовательность примыкает к эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, что изменяется экспрессия этой эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, например, увеличивается, уменьшается или прекращается. В этом контексте гетерологичной последовательностью является последовательность, которая в природе не примыкает к эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, вне зависимости от того, является ли сама гетерологичная последовательность эндогенной (полученной из той же клетки-хозяина или ее потомства) или экзогенной (полученной из другой клетки-хозяина или ее потомства). В качестве примера, промоторная последовательность может замещать (например, посредством гомологичной рекомбинации) нативный промотор гена в геноме клетки-хозяина таким образом, что этот ген имеет измененную картину экспрессии. Этот ген будет теперь являться «выделенным», поскольку он отделен по меньшей мере от некоторых последовательностей, которые фланкируют его в природе.

Нуклеиновая кислота также считается «выделенной», если она содержит любые модификации, которые естественным образом не возникают в соответствующей нуклеиновой кислоте в геноме. Например, эндогенная кодирующая последовательность считается «выделенной», если она содержит вставку, делецию или точечную мутацию, введенные искусственно, например, путем вмешательства человека. «Выделенная нуклеиновая кислота» также включает нуклеиновую кислоту, встроенную в хромосому клетки-хозяина в гетерологичном участке, и нуклеотидную конструкцию, присутствующую в виде эписомы. Более того, «выделенная нуклеиновая кислота» может быть по существу свободной от другого клеточного материала или по существу свободной от культуральной среды при получении рекомбинантными методами, или по существу свободной от химических предшественников или других химических веществ при получении химическим синтезом.

В контексте настоящего изобретения «последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный генный продукт» относится к любому участку кодирующей части гена. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный генный продукт, может быть участком фермента, который способен осуществлять по меньшей мере одну активность всего фермента или целого фермента.

В контексте настоящего изобретения «нуклеиновая кислота, необходимая для экспрессии по меньшей мере одного генного продукта» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой участок гена и/или функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей генный продукт, но не включает обязательно кодирующую последовательность. В качестве примера, последовательность нуклеиновой кислоты, необходимая для экспрессии по меньшей мере одного генного продукта, включает, но не ограничивается ими, энхансеры, промоторы, регуляторные последовательности, стартовые кодоны, стоп-кодоны, последовательности полиаденилирования и/или кодирующие последовательности.

В контексте настоящего изобретения «протеолиз» или «генный продукт, отвечающий за протеолиз в клетке», относится к любому пептиду, полипептиду, белку и/или ферменту, или их участку, способному вызвать расщепление по меньшей мере одного пептида, полипептида и/или белка. Генный продукт, отвечающий за протеолиз, может непосредственно отвечать за расщепление (т.е. являться пептидазой) или может отвечать непрямым образом, являясь частью пути синтеза пептидазы. Примеры генных продуктов, которые ответственны за протеолиз в клетке, включают, но не ограничиваются ими, аспартильные протеазы, сериновые протеазы, секретируемые аспартильные протеазы, секретируемые сериновые протеазы, протеазы метилотрофных дрожжей, DPPIV-подобные эндопептидазы, металлоэндопептидазы, Prb1-подобные сериновые протеазы, сериновые протеазы Prb1 и CPY-подобные карбоксипептидазы. Также в это определение включены протеазы, которые могут секретироваться из клетки, но по-прежнему сохранять некоторую или всю протеолитическую активность, например, секретируемые сериновые протеазы. Секретируемая протеаза может отвечать за протеолиз внутри клетки и/или вне клетки.

В контексте настоящего изобретения «гликозилирование» или «генный продукт, отвечающий за гликозилирование в клетке» относится к любому пептиду, полипептиду, белку и/или ферменту, или их части, участвующему в добавлении по меньшей мере одного сахаридного звена к полипептиду или в удлинении по меньшей мере одной сахаридной цепи в клетке. Генный продукт, отвечающий за гликозилирование в клетке, может непосредственно отвечать за добавление сахарида к полипептиду в клетке, как, например, но не ограничиваясь этим, маннозилтрансферазы. Маннозилтранферазы могут переносить остаток от Dol-P-Man на сериновый и/или треониновый остатки в пептиде, полипептиде и/или белке, или могут переносить остаток маннозы с GPD-Man на сахарид, таким образом удлиняя сахаридную цепь. В альтернативном варианте генный продукт, отвечающий за гликозилирование, может быть частью пути гликозилирования и может непрямым образом отвечать за добавление полисахарида к полипептиду в клетке. Примеры генных продуктов, которые отвечают за гликозилирование в клетке, включают, но не ограничиваются ими, маннозилтранферазы.

«Полинуклеотид(ы)» в общем относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. «Полинуклеотид(ы)» включает, без ограничения, одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей или одно-, двух- и трехцепочечных областей, одно- и двухцепочечную РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут представлять собой одноцепочечные или, более типично, двухцепочечные или трехцепочечные области, или смесь одно- и двухцепочечных областей. Дополнительно, «полинуклеотид» в контексте настоящего изобретения относится к трехцепочечным областям, содержащим РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Цепи в таких областях могут принадлежать одной молекуле или разным молекулам. Области могут включать в себя целиком одну или несколько молекул, но обычно включают только область некоторых молекул. Одна из молекул трехспиральной области часто представляет собой олигонуклеотид. В контексте настоящего изобретения термин «полинуклеотид(ы)» включает также ДНК или РНК, описанные выше, которые содержат одно или несколько модифицированных оснований. Таким образом, ДНК или РНК со остовом, модифицированным для стабильности или по другим причинам, представляют собой «полинуклеотид(ы)» согласно тому, что подразумевает данный термин в настоящем документе. Более того, ДНК или РНК, содержащие необычные основания, такие как инозин, или модифицированные основания, такие как тритилированные основания (приведено только два примера), представляют собой полинуклеотиды согласно тому, что подразумевает данный термин в настоящем документе. Следует иметь в виду, что можно провести большое число модификаций ДНК и РНК, которые служат для различных полезных целей, известных специалистам в данной области техники. Термин «полинуклеотид(ы)» в контексте настоящего описания, охватывает такие химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток, включая, например, простые и сложные клетки. «Полинуклеотиды» также охватывают короткие полинуклеотиды, часто называемые олигонуклеотидами.

«Полипептид(ы)» относится к любому пептиду или белку, содержащему две или несколько аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями. «Полипептид(ы)» относится как к коротким цепям, обычно называемым пептидами, олигопептидами и олигомерами, так и к длинным цепям, обычно называемым белками. Полипептиды могут содержать аминокислоты, отличающиеся от генетически кодируемых 20 аминокислот. «Полипептид(ы)» включает аминокислоты, модифицированные в результате любых природных процессов, таких как процессинг и другие посттрансляционные модификации, а также в результате химических методов модификации. Такие модификации хорошо описаны в базовых учебниках и в более подробных монографиях, а также в большом количестве исследовательской литературы, и они хорошо известны специалистам в данной области техники. Следует понимать, что один тип модификации может присутствовать в одинаковой или различной степени в нескольких участках в данном полипептиде. Также данный полипептид может содержать много типов модификаций. Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксильные концы. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестную сшивку, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, гликозилирование, присоединение липидов, сульфирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АДФ-рибозилирование, селеноилирование, сульфатирование, тРНК-опосредованное добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование, и убиквитинилирование. См., например, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) и Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 в POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) и Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Полипептиды могут быть разветвленными или циклическими, с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут быть результатом посттрансляционных природных процессов, а также могут быть изготовлены полностью синтетическими способами.

«Вариант» в соответствии с тем, как этот термин используется в данном документе, представляет собой полинуклеотид или полипептид, который соответственно отличается от эталонного полинуклеотида или полипептида, но сохраняет значимые свойства. Типичный вариант полинуклеотида отличается по нуклеотидной последовательности от другого, эталонного полинуклеотида. Изменения в нуклеотидной последовательности варианта могут изменять или могут не изменять аминокислотную последовательность полипептида, кодируемого эталонным полинуклеотидом. Нуклеотидные изменения могут привести к аминокислотным заменам, добавлениям, делециям, слияниям и укорачиваниям в полипептиде, кодируемом эталонной последовательностью, как описано ниже. Типичный вариант полипептида отличается по аминокислотной последовательности от другого, эталонного полипептида. Обычно различия ограничены, так что последовательности эталонного полипептида и варианта очень похожи в целом и во многих областях идентичны. Вариант и эталонный полипептид могут отличаться по аминокислотной последовательности одной или несколькими заменами, добавлениями, делециями в любой комбинации. Замещенный или вставленный аминокислотный остаток может кодироваться или может не может кодироваться генетическим кодом. Вариант полинуклеотида или полипептида может быть природным, таким как аллельный вариант, или это может быть вариант, который не встречается в природе. Настоящее изобретение также включает в варианты каждого из полипептидов по настоящему изобретению, то есть полипептиды, которые отличаются от эталонной последовательности консервативными аминокислотными заменами, в результате которых остаток заменен другим с похожими характеристиками. Как правило, такие замены происходят между Ala, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr; между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gln; и между основными остатками Lys и Arg; или между ароматическими остатками Phe и Tyr. В частности, существуют варианты, в которых несколько, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 или 1 аминокислота замещены, удалены или добавлены в любой комбинации. Неприродные варианты полинуклеотидов и полипептидов могут быть получены методами мутагенеза или прямым синтезом. Варианты могут также включать, но не ограничиваются ими, полипептиды или их фрагменты, имеющие химическую модификацию одной или нескольких из боковых групп своих аминокислот. Химическая модификация включает, но не ограничиваются ими, добавление химических групп, создание новых связей и удаление химических групп. Модификации в боковых группах аминокислот включают, без ограничения, ацилирование ε-аминогруппы лизина, N-алкилирование аргинина, гистидина, лизина или алкилирование глутаминовой или аспарагиновой карбоксильных групп, и дезамидирование глутамина или аспарагина. Модификации концевой аминогруппы включают, без ограничения, дезамининирование, N-алкилирование низшими алкилами, N-диалкилирование низшими алкилами и N-ацильные модификации. Модификации концевой карбоксильной группы включают, без ограничения, амидирование, образование алкиламида с низшими алкилами, образование диалкиламида с низшими алкилами и образование сложных эфиров с низшими алкилами. Кроме того, одна или несколько боковых групп или концевых групп могут быть защищены защитными группами, обычно известными среднему специалисту в белковой химии.

В контексте настоящего изобретения «фрагмент» при использовании в отношении полипептида представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является одинаковой с частью, но не со всей аминокислотной последовательностью полноразмерного природного полипептида. В контексте настоящего изобретения «фрагмент» при использовании в отношении полинуклеотида или последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, которая является одинаковой с частью, но не со всей аминокислотной последовательностью полноразмерного природного полипептида. Фрагменты могут быть «одиночными» или входить в состав более крупного полипептида, в котором они образуют часть или область в виде одной непрерывной области в одном более крупном полипептиде. В качестве примера, фрагмент природного GLP-1 будет включать аминокислоты с 7-й по 36-ю из природных аминокислот с 1-й по 36-ю. Кроме того, фрагменты полипептида могут также представлять собой варианты природной частичной последовательности. Например, фрагмент GLP-1, содержащий аминокислоты 7-36 из природного GLP-1, также может представлять собой вариант, имеющий аминокислотные замены в данной частичной последовательности. В качестве другого примера, «фрагмент» может относиться к любому гетерологичному полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный полипептид, описанный в данном документе, включая, но не ограничиваясь ими, Kex2р, Pdi1 и Ero1, где указанный фрагмент сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность указанного полипептида или фермента дикого типа.

В контексте настоящего изобретения «конъюгат» или «конъюгированный» относится к двум молекулам, которые связаны друг с другом. Например, первый полипептид может быть ковалентно или нековалентно связан со вторым полипептидом. Первый полипептид может быть ковалентно связан с помощью химического линкера или может быть генетически слит со вторым полипептидом, когда первый и второй полипептиды имеют общий полипептидный остов. Рекомбинантные полипептиды, экспрессированные в клетках-хозяевах по настоящему изобретению, могут содержать по меньшей мере один терапевтический полипептид, конъюгированный с сывороточным альбумином человека. Другие конъюгаты также включают, но не ограничиваются ими, по меньшей мере один терапевтический полипептид, конъюгированный с трансферрином, одноцепочечным вариабельным доменом и/или по меньшей мере одной Fc-областью антитела. Конъюгаты могут содержать или не содержать линкер.

В контексте изобретения «тандемно ориентированные» относится к двум или нескольким полипептидам, которые примыкают друг к другу в виде части одной молекулы. Они могут быть связаны ковалентно или нековалентно. Два или несколько тандемно ориентированных полипептидов могут входить в состав одного полипептидного остова. Тандемно ориентированные полипептиды могут иметь прямую или обратную ориентацию и/или могут быть разделены другими аминокислотными последовательностями.

В контексте настоящего изобретения «альбиглютид» относится к рекомбинантному слитому белку, состоящему из 2 копий 30-аминокислотной последовательности модифицированного глюкагон-подобного пептида 1 человека (GLP-1, фрагмент 7-36(A8G)), генетически слитому с сохранением рамки считывания с рекомбинантным сывороточным альбумином человека. Аминокислотная последовательность альбиглютида приведена ниже как SEQ ID NO:1.

«Рекомбинантные экспрессионные системы» относятся к экспрессионным системам или их участкам, или к полинуклеотидам по изобретению, введенным, трансфицированным или трансформированным в клетку-хозяина или лизат клеток-хозяев, для получения полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения «белок, слитый с альбумином» включает по меньшей мере фрагмент или вариант терапевтического полипептида и по меньшей мере фрагмент или вариант сывороточного альбумина человека, которые связаны друг с другом, предпочтительно, путем генетического слияния.

Полипептиды, имеющие активность GLP-1, могут содержать по меньшей мере один фрагмент и/или вариант GLP-1 человека. Два природных фрагмента GLP-1 человека представлены в SEQ ID NO: 2.

,

где Хаа в позиции 37 является Gly (далее обозначается как «GLP-1(7-37)») или -NH₂ (далее обозначается как «GLP-1(7-36)»). Фрагменты GLP-1 могут включать, но не ограничиваются ими, молекулы GLP-1, содержащие или, в альтернативном варианте, состоящие из аминокислот 7-36 GLP-1 человека (GLP-1(7-36)). Варианты GLP-1 или их фрагменты могут включать, но не ограничиваются ими, одну, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен в GLP-1 дикого типа или в природных фрагментах GLP-1, представленного в SEQ ID NO:2. Варианты GLP-1 или фрагменты GLP-1 могут включать, но не ограничиваются ими, замены остатка аланина, аналогичного аланину 8 в GLP-1 дикого типа, где аланин заменен на глицин (далее обозначается как «A8G») (см., например, мутанты, описанные в патенте США № 5545618, полное содержание которого включено в настоящий документ путем ссылки).

В контексте настоящего изобретения «KEX2» относится к гену, кодирующему белок, называемый «протеазой Killer Expression» или «Kex2p», также называемый в данном описании «kexp». Kex2p является кальций-зависимой сериновой протеазой, участвующей в процессинге пробелков. Эта протеаза расщепляет полипептиды по карбоксильному кон